海洋線蟲(chóng)Litoditis marina 早期發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析*

王彤彤 張留所

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

全球氣候變化影響海洋動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和代謝等生命過(guò)程, 變化的海洋環(huán)境如何影響海洋動(dòng)物發(fā)育的分子機(jī)制還不清楚。本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了潛在的海洋線蟲(chóng)Litoditismarina模式動(dòng)物研究體系和平臺(tái)(Xieet al, 2020; Zhaoet al, 2021), 動(dòng)物早期發(fā)育階段對(duì)環(huán)境變化非常敏感(叢巖懿等, 2020; Xieet al, 2021),但海洋線蟲(chóng)早期發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚。

秀麗線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans的發(fā)育起始于受精卵, 經(jīng)過(guò)多輪的細(xì)胞分裂和分化, 孵化為幼蟲(chóng), 依次經(jīng)歷L1、L2、L3 和L4 共四個(gè)幼蟲(chóng)階段發(fā)育成為具有多種組織和細(xì)胞類型的成蟲(chóng)(Zhanget al, 2015)。在20 °C 的條件下, 秀麗線蟲(chóng)從L1 幼蟲(chóng)發(fā)育到成蟲(chóng)約需3 d (Zhanget al, 2015)。Sulston 等科學(xué)家首次繪制出了秀麗線蟲(chóng)從受精卵到成體的完整細(xì)胞譜系, 在20 °C下, 從受精卵孵化為L(zhǎng)1 約需16 h, 剛孵化的L1 幼蟲(chóng)含558 個(gè)細(xì)胞, 幼蟲(chóng)通過(guò)細(xì)胞分裂和分化并最終發(fā)育成具有959 個(gè)體細(xì)胞的成體, 不同個(gè)體間細(xì)胞發(fā)育譜系高度一致(Sulstonet al, 1977, 1983)。

研究發(fā)現(xiàn)約3 千萬(wàn)年前分化的兩種同屬線蟲(chóng)C.elegans和C.briggsae在發(fā)育過(guò)程中mRNA 和蛋白質(zhì)的變化高度保守, 但同一物種內(nèi)mRNA 和蛋白質(zhì)的變化關(guān)聯(lián)較弱, 該報(bào)道也對(duì)秀麗線蟲(chóng)胚胎期和L1 幼蟲(chóng)間的轉(zhuǎn)錄組變化特征進(jìn)行了詳細(xì)描述(Grünet al,2014)。另一項(xiàng)研究報(bào)道胚胎時(shí)期幾乎一半的基因表達(dá)參與DNA 復(fù)制和染色質(zhì)形成, 以實(shí)現(xiàn)快速的細(xì)胞分裂和細(xì)胞類型增加(Boecket al, 2016)。通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 已有報(bào)道量化了16 細(xì)胞期前基因表達(dá)變化, 發(fā)現(xiàn)胚胎期轉(zhuǎn)錄本多樣性隨著時(shí)間推移而增加(Tintoriet al, 2016)。通過(guò)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析, 研究報(bào)道秀麗線蟲(chóng)胚胎轉(zhuǎn)錄本比幼蟲(chóng)階段的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng),進(jìn)一步揭示了秀麗線蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化(Liet al, 2020)。

我們團(tuán)隊(duì)聚焦的海洋線蟲(chóng)L.marina與陸生模式動(dòng)物秀麗線蟲(chóng)同屬線蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)小桿線蟲(chóng)科, 屬于海-陸線蟲(chóng)近緣物種(Xieet al, 2020; Zhaoet al, 2021)。秀麗線蟲(chóng)發(fā)育機(jī)制研究已經(jīng)比較深入, 而海洋線蟲(chóng)早期發(fā)育階段的研究基本處于未知階段。海洋線蟲(chóng)L.marina為雌雄異體, 其發(fā)育起始于受精卵, 受精卵在線蟲(chóng)子宮內(nèi)完成早期胚胎發(fā)育, 產(chǎn)出體外的胚胎(eggs)孵化后為L(zhǎng)1 幼蟲(chóng), 20 °C 下, 從L1 幼蟲(chóng)發(fā)育為成體約需4～5 d(Xieet al, 2020, 2021)。L.marina從L1 幼蟲(chóng)發(fā)育為成體依次經(jīng)過(guò)L2、L3 和L4 幼蟲(chóng)階段, 從L1 幼蟲(chóng)發(fā)育為L(zhǎng)2 約需46 h, 從L2 幼蟲(chóng)發(fā)育為L(zhǎng)3 約需19 h, 從L3 幼蟲(chóng)發(fā)育為L(zhǎng)4 約需16 h, 而從L4 幼蟲(chóng)發(fā)育為成體約需15 h (Zhaoet al, 2021)。研究人員通過(guò)繪制L.marina的胚胎發(fā)育細(xì)胞譜系, 發(fā)現(xiàn)L.marina與秀麗線蟲(chóng)胚胎細(xì)胞譜系同源性高達(dá)95.5%, 但末端細(xì)胞分化命運(yùn)的相似度只有76.4%, 表明了細(xì)胞分化和發(fā)育命運(yùn)決定機(jī)制在海陸線蟲(chóng)近緣種間既有相似性又有物種特異性(Houthoofdet al, 2003)。為了初步探究海洋線蟲(chóng)與秀麗線蟲(chóng)早期發(fā)育的異同, 本研究對(duì)L.marina胚胎時(shí)期和孵化后L1 發(fā)育階段2 h、4 h 和6 h 的樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析, 研究結(jié)果表明, 海洋線蟲(chóng)與秀麗線蟲(chóng)早期發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制高度相似, 秀麗線蟲(chóng)作為一種優(yōu)秀的模式生物, 具有豐富的研究資源,這些資源將極大地輔助海洋線蟲(chóng)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。同時(shí)進(jìn)一步通過(guò)基因編輯和轉(zhuǎn)基因營(yíng)救等技術(shù)和方法深入比較研究L.marina和C.elegans發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因的功能將為海-陸近緣線蟲(chóng)間的發(fā)育進(jìn)化機(jī)制、海洋線蟲(chóng)對(duì)潮間帶環(huán)境適應(yīng)以及全球氣候變化應(yīng)答的分子機(jī)制研究提供新認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 品系的獲得與培養(yǎng)

本研究所用的海洋線蟲(chóng)L.marina野生型品系HQ1 采集自青島匯泉灣潮間帶的表層泥沙, 已在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)5 年, 在20 °C 的條件下, 將其培養(yǎng)于90 mm SW-NGM 平板(Xieet al, 2020)上, 以大腸桿菌E.coliOP50 為食物。

1.2 海洋線蟲(chóng)大規(guī)模同步化

將海洋線蟲(chóng)在20 °C 下擴(kuò)大培養(yǎng)到30 個(gè)板以上,待其生長(zhǎng)至成蟲(chóng)且交配產(chǎn)生了大量的卵時(shí), 將平板上的全部線蟲(chóng)、卵以及菌用滅菌海水洗脫至15 mL離心管中, 靜置5 min 使大蟲(chóng)自然沉降, 卵及細(xì)菌在上清中, 將上清轉(zhuǎn)移至新的15 mL 離心管中, 3 000g離心1 min, 棄上清。加入滅菌水, 混勻, 1 300g離心1 min, 棄上清, 重復(fù)三次。加入3 mL 滅菌水 + 3 mL裂解液[4 mL 高樂(lè)式?漂白水(≥6.25%的次氯酸鈉溶液) + 1 mL 10 mol/L NaOH + 5 mL 滅菌水], 充分震蕩75～90 s, 再加入滅菌水到12 mL, 1 300g離心, 棄上清, 重復(fù)3 次。此時(shí)得到大量的卵, 將其轉(zhuǎn)移至海水中孵化18～20 h 得到大量同步化的幼蟲(chóng)L1。

1.3 RNAseq 樣本制備

將同步化后孵化前得到的卵通過(guò)400 目網(wǎng)篩過(guò)濾,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管, 8 000g離心, 棄上清, 置于液氮中速凍30 min 后保存在–80 °C, 得到胚胎樣品。將同步化的L1 依次通過(guò)450 目和500 目網(wǎng)篩過(guò)濾后, 置于OP50 的SW-NGM 板上分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h 后, 將平板上的L1 用滅菌海水洗脫至15 mL 離心管, 600g離心1 min, 棄上清。加入滅菌水, 600g離心2.5 min, 棄上清, 重復(fù)3 次。將L1 轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中, 加入滅菌水, 3 000g離心1 min, 棄上清, 置于液氮中速凍30 min 后保存至–80 °C, 得到L1 期2 h、4 h 和6 h 的樣品。

1.4 RNAseq 建庫(kù)及分析

提取樣本 RNA, 并使用 NanoDrop 2000 測(cè)量RNA 濃度和純度, 使用Agilent 生物分析儀2100 系統(tǒng)的RNA Nano 6000 檢測(cè)試劑盒對(duì)RNA 完整性進(jìn)行評(píng)估。使用Illumina 的NEBNext UltraTMRNA Library Prep Kit (NEB, USA)試劑盒生成測(cè)序文庫(kù)。使用TruSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumia)在cBot Cluster Generation System 上對(duì)指標(biāo)編碼的樣本進(jìn)行聚類, 然后在Illumina 平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序生成雙端reads, 最終獲得文庫(kù)。

原始fastq 數(shù)據(jù)過(guò)濾掉含接頭和低質(zhì)量的reads后, 得到高質(zhì)量Clean Data。使用HISAT2 (Kimet al,2015)將其比對(duì)到參考基因組得到Mapped reads, 然后利用String Tie (Perteaet al, 2015)將比對(duì)上的reads進(jìn)行組裝和定量。對(duì)各樣品中的Mapped reads 的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化, 采用FPKM (Floreaet al,2013)作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo), 對(duì)每個(gè)樣本分別進(jìn)行基因表達(dá)水平定量。使用DESeq2 (Loveet al,2014)對(duì)兩組樣品進(jìn)行差異表達(dá)分析, 將Fold Change≥1.5 且FDR≤0.05 作為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)[差異倍數(shù)(Fold Change)表示兩樣品(組)間表達(dá)量的比值;錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR)是使用Benjamini 和Hochberg 的方法通過(guò)對(duì)差異顯著性P值(P-value)進(jìn)行校正得到的]。將差異表達(dá)基因注釋到KEGG (Kanehisaet al, 2008)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/), 使用KOBAS (Maoet al, 2005)軟件來(lái)檢測(cè)KEGG 通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集, 篩選出兩個(gè)樣本間FDR≤0.05 的顯著性差異通路。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

本研究以EVM0015995_esyt-2為內(nèi)參基因, 隨機(jī)選擇11 個(gè)關(guān)鍵基因(表1)進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。使用ReverTra AceTMqPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒將RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA中加入SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑和正反向引物, 在QuantStudioTM6 Flex 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)中檢測(cè), 每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。算出每個(gè)比較組合的ΔΔCt 后取平均, 2–ΔΔCt即為該基因在兩個(gè)比較組合之間的倍數(shù)變化。使用Graphpad 對(duì)qPCR 和RNAseq 數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和T 檢驗(yàn), 得到兩組數(shù)據(jù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)和P值。

表1 qPCR 驗(yàn)證基因的引物序列Tab.1 The primer sequences of genes verified by qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋線蟲(chóng)L. marina 轉(zhuǎn)錄組分析

選取L.marina胚胎期(Embryo, EM)和L1 幼蟲(chóng)2 h、4 h、6 h 四個(gè)階段, 每個(gè)階段設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù), 使用二代Illumina 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)PCA主成分分析, 發(fā)現(xiàn)相同發(fā)育階段的生物學(xué)重復(fù)高度相關(guān), 不同發(fā)育階段能夠清晰區(qū)分(圖1)。

圖1 海洋線蟲(chóng)L. marina 早期發(fā)育轉(zhuǎn)錄組主成分分析(PCA)Fig.1 Principal component analysis of marine nematode L.marina in early developmental stages

通過(guò)分析不同樣品間的差異表達(dá)基因數(shù)目, 發(fā)現(xiàn)L1 期2 h、4 h 和6 h 三個(gè)發(fā)育時(shí)期相較于EM, 均有超過(guò)9 000 個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化, 而L1 2 h、4 h 和6 h 間的差異基因數(shù)目較少(表2)。通過(guò)KEGG通路富集分析, 發(fā)現(xiàn)L1 幼蟲(chóng)2 h、4 h 和6 h 相較于EM 有超過(guò)30 個(gè)通路發(fā)生顯著上調(diào)(圖2), 而超過(guò)20個(gè)通路發(fā)生了顯著下調(diào)(圖3)。

圖2 海洋線蟲(chóng)L. marina 各比較組合中上調(diào)基因的KEGG 富集情況Fig.2 KEGG enrichment of up-regulated genes in the marine nematode L. marina in each combination

圖3 海洋線蟲(chóng)L. marina 各比較組合中下調(diào)基因的KEGG 富集情況Fig.3 KEGG enrichment of down-regulated genes in the marine nematode L. marina in each combination

表2 不同組間差異基因數(shù)目Tab.2 The number of differentially expressed genes between groups

2.2 相較于EM, L1 幼蟲(chóng)核糖體和核糖體發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)

通過(guò)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn), 與胚胎期相比, L1 發(fā)育時(shí)期2 h、4 h 和 6 h 的多個(gè)核糖體蛋白大亞基編碼基因(如EVM0009601_rpl-1和EVM0014298_rpl-3)和多個(gè)核糖體蛋白小亞基編碼基因(EVM0000892_rps-1和EVM0013684_rps-7等)的表達(dá)均發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4a), 核糖體發(fā)生通路中的52 個(gè)基因(如核仁蛋白EVM0010210_nol-6, Rio 激酶 EVM0005680_riok-1,核糖體RNA 加工蛋白質(zhì)EVM0015730_rrp-8)在L1幼蟲(chóng)期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4b), 氨?；?rRNA 生物合成通路中多個(gè)氨酰基-tRNA 合成酶(如丙氨?；鵷RNA合成酶EVM0006554_aars-2, 天冬氨酸氨?；鵷RNA合成酶EVM0015786_dars-1, 精氨酸氨酰基tRNA 合成酶EVM0008023_rars-1)在L1 幼蟲(chóng)期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4c)。

圖4 核糖體相關(guān)通路基因表達(dá)變化情況Fig.4 Changes in gene expression of ribosomal related pathway

2.3 糖酵解/糖原異生、TCA 循環(huán)和氧化磷酸化通路中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著上調(diào)

通過(guò)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn), 與胚胎期相比, 糖酵解和糖原異生通路中的多個(gè)基因(如醛脫氫酶EVM0001434_alh-4和二氫硫辛酰胺脫氫酶EVM0004862_dld-1)在L1 發(fā)生顯著上調(diào)(圖5a)。檸檬酸(TCA)循環(huán)通路中的多個(gè)基因(如順烏頭酸酶EVM0011486_aco-2、檸檬酸合成酶 EVM0011427_cts-1)在L1 期發(fā)生顯著上調(diào)(圖5b)。氧化磷酸化通路中的多個(gè)基因(如ATP 合成酶EVM0008198_atp-1、液泡型H+ATP 酶EVM0002567_vha-2)在L1 發(fā)生顯著上調(diào)(圖5c)。

2.4 多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)受體基因在L1 期轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)

通過(guò)KEGG 分析, 發(fā)現(xiàn)L1 期相較于EM, 超過(guò)100 個(gè)基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中上調(diào)(圖6)。EVM0000190_dop-1和 EVM0009467_dop-2等多個(gè)多巴胺受體相關(guān)基因在L1 期表達(dá)量上調(diào)(圖6a),GABA β 受體相關(guān)基因如 EVM0013292_gbb-2,EVM0015297_gbb-1和GABA 受體基因EVM0014833_gab-1( 圖 6b), 多個(gè)神經(jīng)肽受體家族基因如EVM0011355_npr-29和EVM0012055_npr-34等(圖6c),FMRFamide 肽受體家族基因EVM0006577_frpr-3、EVM0008649_frpr-14等也在L1 期表達(dá)量上調(diào)(圖6d)。

圖6 不同神經(jīng)遞質(zhì)的基因表達(dá)變化情況Fig.6 Changes in gene expression of different neurotransmitters

2.5 DNA 復(fù)制和修復(fù)相關(guān)通路基因的表達(dá)在L1 期顯著下調(diào)

通過(guò)KEGG 分析, 發(fā)現(xiàn)DNA 復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)通路在L1 期下調(diào)。DNA 復(fù)制通路中多個(gè)相關(guān)基因(如DNA 解旋酶/核酸內(nèi)切酶EVM0005762_dna-2、DNA 連接酶EVM0006442_pri-1)。錯(cuò)配修復(fù)通路中多個(gè)相關(guān)基因(DNA 復(fù)制因子EVM0005944_rfc-1、復(fù)制蛋白 A EVM0007970_rpa-1)。堿基切除修復(fù)通路中多個(gè)相關(guān)基因(如DNA聚合酶EVM0014593_pole-1、無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶核糖內(nèi)切酶EVM0009978_apn-1)和核苷酸切除修復(fù)通路中多個(gè)相關(guān)基因(如復(fù)制蛋白A EVM0002773_rpa-2、DNA 復(fù)制因子EVM0013177_rfc-4)在L1 時(shí)期顯著下調(diào)(圖7)。

圖7 DNA 復(fù)制(a)、錯(cuò)配修復(fù)(b)、堿基切除修復(fù)(c)和核苷酸切除(d)修復(fù)通路中相關(guān)基因表達(dá)變化情況Fig.7 Changes in expression of related genes in DNA replication (a), mismatch repair (b), base exicision repair (c) and nucleotide excision repair (d)

2.6 Notch、Hippo 和Hedgehog 等重要發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路基因在L1 期顯著下調(diào)

Notch 信號(hào)通路中30 個(gè)基因(如EVM0011417_lag-1, EVM0004706_bir-1, EVM0008121_hda-1)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8a), Hippo 信號(hào)通路中10多個(gè)基因(如EVM0004098_yap-1, EVM0016569_zyx-1)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8b), Hedgehog 信號(hào)通路中10 個(gè)基因(如EVM0004427_ptc-3, EVM0015926_wrt-8)的轉(zhuǎn)錄水平在L1 期顯著下調(diào)(圖8c)。

圖8 重要發(fā)育通路-Notch 信號(hào)通路(a)、Hippo 信號(hào)通路(b)和Hedgehog 信號(hào)通路(c)的相關(guān)基因表達(dá)變化情況Fig.8 Changes in gene expression of important developmental pathways-Notch signaling pathway (a), Hippo signaling pathway (b),and Hedgehog signaling pathway (c)

2.7 剪切體通路中多個(gè)剪切因子基因在L1 期顯著下調(diào)

剪切因子對(duì)于RNA 的加工至關(guān)重要(Mortonet al,2011)。本研究中, 多個(gè)剪切因子(如BCAS 剪切因子EVM0013266_bcas-2、DBI1 剪切因子EVM0005825_dib-1、RSP 蛋白EVM0003635_rsp-6、PRP 剪切因子EVM0016298_prp-6、剪切因子3B 亞基 EVM0010128_sftb-1和 EVM0009161_sftb-2、SLU7 剪 切 因 子EVM0000329_sluh-7在L1 期下調(diào)(圖9)。

圖9 剪切體相關(guān)基因表達(dá)變化情況Fig.9 Changes in expression of spliceosomal related genes

2.8 qPCR 驗(yàn)證組學(xué)分析結(jié)果

本研究隨機(jī)選擇11 個(gè)基因進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證, 得出倍數(shù)變化(圖10a)。采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)r作為衡量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qPCR 數(shù)據(jù)相關(guān)性的指標(biāo),r越接近1,相關(guān)性越好。通過(guò)Graphpad 分析, 得出轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和qPCR 的結(jié)果相關(guān)性r為0.961 6, 顯著性P值小于0.000 1 (圖10b), 結(jié)果顯示兩者相關(guān)性很高。

圖10 qPCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.10 Verification results through qPCR analysis

3 討論

3.1 海洋線蟲(chóng)L. marina L1 幼蟲(chóng)發(fā)育需要更多的蛋白合成、能量供應(yīng)與代謝活力

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所, 與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂密不可分(Fromont-Racineet al, 2003; Thomsonet al, 2013), 對(duì)秀麗線蟲(chóng)全基因組RNAi 篩查發(fā)現(xiàn)核糖體編碼基因如rpl-4、rpl-35、rps-7、rps-13等基因的敲降會(huì)導(dǎo)致發(fā)育速率減慢(S?nnichsenet al, 2005)。研究發(fā)現(xiàn)RNAi 敲降rps-14導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)生長(zhǎng)緩慢和不育(Chanet al, 2009)。通過(guò)GFP 標(biāo)記秀麗線蟲(chóng)nog-1(編碼核仁GTP 酶)啟動(dòng)子, 發(fā)現(xiàn)nog-1在胚胎早期到成蟲(chóng)均有表達(dá), 使用RNAi 抑制nog-1的功能導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)孵化數(shù)減少、生長(zhǎng)減慢、壽命增加和脂肪儲(chǔ)存增加(Kimet al, 2014)。秀麗線蟲(chóng)riok-1編碼RIO 激酶,RNAi 抑制riok-1的功能會(huì)導(dǎo)致性腺形態(tài)異常, 從而使卵數(shù)量減少(Weinberget al, 2014)。通過(guò)EMS 化學(xué)誘變和核糖體圖譜分析, 發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)rrp-8(編碼核糖體RNA 加工蛋白)參與核糖體RNA 加工, 對(duì)于核糖體的生物發(fā)生具有重要作用(Wuet al, 2018)。氨?；?tRNA 生物合成通路中的氨酰基-tRNA 合成酶催化氨基酸與其同源tRNA 的共價(jià)連接, 在翻譯過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用(Rajendranet al, 2018)。rrt-1(rars-1)編碼精氨酰tRNA 合成酶, 通過(guò)RNAi 抑制其功能發(fā)現(xiàn),rrt-1對(duì)于秀麗線蟲(chóng)的發(fā)育、運(yùn)動(dòng)速度、缺氧敏感性、壽命有至關(guān)重要的作用(Fr?hlichet al,2017)。本研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)核糖體、核糖體發(fā)生和氨?；?tRNA 生物合成通路相關(guān)基因在L1 時(shí)期的表達(dá)相較于胚胎期發(fā)生了顯著上調(diào)(圖 4), 意味著在L.marina中, 相較于胚胎時(shí)期, L1 期的發(fā)育可能需要更多蛋白質(zhì)合成。據(jù)報(bào)道, 在秀麗線蟲(chóng)中, 相較于胚胎時(shí)期, L1 期的多個(gè)核糖體編碼基因rpl-和rps-發(fā)生了顯著上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al,2020), 這種變化模式與本研究海洋線蟲(chóng)L.marina中發(fā)現(xiàn)的一致。然而在秀麗線蟲(chóng)中, 相比于胚胎期, 核糖體發(fā)生通路多個(gè)基因在L1 期下調(diào), 氨酰基tRNA合成通路中的基因在秀麗線蟲(chóng)EM 和L1 期之間變化不明顯(Grünet al, 2014), 總之, 我們發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)這兩個(gè)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化特征和L.marina不同, 推測(cè)可能和兩種線蟲(chóng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程存在的差異相關(guān)。

核糖體的生物發(fā)生是所有細(xì)胞中對(duì)能量要求最高的生命過(guò)程之一(Kressleret al, 2010; Thomsonet al,2013)。本研究中, L1 期相較于胚胎期, 糖酵解/糖原異生通路、TCA 循環(huán)通路和氧化磷酸化通路等與能量相關(guān)的通路中多個(gè)基因在L1 期顯著上調(diào)(圖5)。在糖酵解/糖原異生通路中,alh-4編碼醛脫氫酶, 通過(guò)正向遺傳篩選發(fā)現(xiàn)其缺失會(huì)增加脂肪醛, 減少脂肪的儲(chǔ)存(Zenget al, 2021)。RNAi 抑制秀麗線蟲(chóng)中dld-1(編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶)的功能, 可改變能量代謝,激活與蛋白酶體降解相關(guān)的通路, 改善細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo), 延長(zhǎng)壽命(Ahmadet al, 2021)。TCA 循環(huán)中,cts-1編碼的檸檬酸合成酶是TCA 循環(huán)的起始酶和限速酶, RNAi 抑制秀麗線蟲(chóng)中cts-1的功能, 會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)育停滯(Hadaet al, 2019)。秀麗線蟲(chóng)aco-2編碼烏頭酸酶,idha-1編碼異檸檬酸脫氫酶, RNAi 抑制兩者的功能會(huì)導(dǎo)致檸檬酸的積累, 并延遲秀麗線蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育(Yanget al, 2022)。氧化磷酸化通路中:vha-8和vha-19編碼液泡型H+ATP 酶,vha-8是PH 動(dòng)態(tài)平衡和幼蟲(chóng)發(fā)育所必需的,vha-19是胚胎發(fā)生所必需的,RNAi 抑制秀麗線蟲(chóng)vha-8或vha-19的功能會(huì)致死(Jiet al, 2006; Knightet al, 2012)。因此, 我們推測(cè)在L1期, 這些與能量相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的增加, 為核糖體的生物合成提供了必要的能量, 同時(shí)也為L(zhǎng)1 幼蟲(chóng)的發(fā)育提供了充足的能量供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)從胚胎期發(fā)育到L1 期, 上述三個(gè)能量通路中的多個(gè)基因的表達(dá)均發(fā)生顯著上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。因此, 我們推測(cè)L.marina早期發(fā)育的能量供應(yīng)機(jī)制與秀麗線蟲(chóng)高度相似。

本研究通過(guò)KEGG 富集分析, 發(fā)現(xiàn)在L1 期, 17個(gè)代謝通路在L1 期顯著上調(diào), 相關(guān)的通路是碳代謝,嘌呤代謝, 花生四烯酸代謝, 亞油酸代謝, 淀粉和蔗糖代謝, 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝, D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝, 谷胱甘肽代謝, 2-氧代羧酸代謝,甘油磷脂代謝代謝, 組氨酸代謝, 亞麻酸代謝, β-丙氨酸代謝, 丙酸酯代謝, 氮代謝(圖2)。4 個(gè)生物合成通路在L1 期顯著上調(diào), 相關(guān)的通路是氨基酸的生物合成, 精氨酸的生物合成, 葉酸的生物合成, 類固醇的生物合成(圖2)。與海洋線蟲(chóng)相似, 這些通路中的大部分基因在秀麗線蟲(chóng)L1 期表達(dá)量也顯著高于胚胎期(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020),據(jù)此推測(cè)L.marina早期發(fā)育的代謝調(diào)控機(jī)制與秀麗線蟲(chóng)高度保守。

3.2 海洋線蟲(chóng)L. marina L1 幼蟲(chóng)神經(jīng)受體基因表達(dá)顯著上調(diào)

通過(guò)KEGG 富集分析, 發(fā)現(xiàn)L1 期相較于EM, 超過(guò)100 個(gè)基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中上調(diào), 大多是神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽受體, 可能與L1 幼蟲(chóng)的覓食和運(yùn)動(dòng)等行為調(diào)控相關(guān)。多巴胺受體和GABA 受體在L1 表達(dá)量較胚胎期顯著上調(diào)(圖6a,6b)。多巴胺和谷氨酸-氨基丁酸(γ-aminobuyric acid,GABA)對(duì)于線蟲(chóng)的基本運(yùn)動(dòng)功能至關(guān)重要(Jorgensen,2005; Omuraet al, 2012), 研究發(fā)現(xiàn)編碼多巴胺受體的dop-2在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá), 可以調(diào)節(jié)多巴胺的合成和釋放(Suoet al, 2004), 多巴胺能神經(jīng)元在感覺(jué)到細(xì)菌食物時(shí)釋放多巴胺從而引發(fā)運(yùn)動(dòng)減慢反應(yīng)(Suoet al, 2004; Nagashimaet al, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體編碼基因dop-3缺失會(huì)導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)缺陷(Chaseet al, 2004)。GABA 是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 在線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)和覓食時(shí), 起到放松身體肌肉的作用(Jorgensen, 2005)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò) RNAi 抑制gbb-1(編碼代謝型GABAβ 受體)的功能增強(qiáng)抗氧化能力并延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命(Yuanet al, 2019)。

多個(gè)神經(jīng)肽受體家族基因在L1 期表達(dá)量顯著上升(圖6c, 6d)。在秀麗線蟲(chóng)中, 目前已鑒定出113 個(gè)神經(jīng)肽基因, 對(duì)于感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要(Liet al, 2008)。比如, 通過(guò)RNAi 敲降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 秀麗線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)喚醒需要frpr-3(編碼FMRFamide 肽受體) (Chewet al, 2018)。在食物充足的情況下,npr-1(編碼神經(jīng)肽受體)可以導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)在進(jìn)食過(guò)程中聚集, 并在細(xì)菌邊緣聚集(Liet al, 2008)。因此, 隨著線蟲(chóng)孵化后開(kāi)始運(yùn)動(dòng), 這些神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)量顯著升高。除此之外, 速激肽受體家族TKR, 膽囊收縮素受體CKR, 神經(jīng)調(diào)節(jié)肽NMUR, NMDA 類谷氨酸受體NMR, 代謝型谷氨酸受體家族MGL 等神經(jīng)遞質(zhì)在L1 期表達(dá)量較EM均發(fā)生顯著上調(diào)。在秀麗線蟲(chóng)中, 相比于胚胎期, 多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽受體基因也均在L1 期轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al,2020)。據(jù)此推測(cè), 海洋線蟲(chóng)和秀麗線蟲(chóng)在L1 幼蟲(chóng)發(fā)育階段神經(jīng)受體調(diào)控方面可能具有類似的機(jī)制。

3.3 海洋線蟲(chóng)L. marina 胚胎期復(fù)制與修復(fù)和細(xì)胞分化調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)

DNA 復(fù)制是細(xì)胞分裂周期的一個(gè)重要方面, 發(fā)生在細(xì)胞周期的合成階段(S 期), 準(zhǔn)確無(wú)誤的DNA 復(fù)制對(duì)于保持基因組的完整性必不可少(Bellet al, 2002;Ariaset al, 2007)。在海洋線蟲(chóng)中DNA 復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)通路中的多個(gè)基因, 與胚胎期相比, 在L1 幼蟲(chóng)期顯著下調(diào)(圖7)。研究發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)RPA 蛋白(編碼復(fù)制蛋白A)參與有絲分裂復(fù)制、減數(shù)分裂、同源重組和修復(fù)等多個(gè)過(guò)程,對(duì)于DNA 復(fù)制過(guò)程至關(guān)重要, CRISPR/Cas9 敲除rpa-1會(huì)導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)早期幼蟲(chóng)致死(Hefelet al,2021)。在酵母和哺乳動(dòng)物中, RFC 蛋白(編碼DNA 復(fù)制因子)參與將某些DNA 聚合酶加工因子加載到單鏈DNA 上, 調(diào)控DNA 復(fù)制過(guò)程(Venclovaset al, 2000;Griffithet al, 2002; Bermudezet al, 2003)。秀麗線蟲(chóng)中,6 個(gè)mcm-基因(mcm-2、mcm-3、mcm-4、mcm-5、mcm-6和mcm-7)編碼的6 個(gè)MCM 蛋白(微小染色體維持蛋白)形成六聚體復(fù)合體, 作為DNA 復(fù)制前起始復(fù)合體的關(guān)鍵組分, 在DNA 復(fù)制中起到DNA 解旋酶的作用(Korzeliuset al, 2011)。RNAi 抑制秀麗線蟲(chóng)dna-2的功能會(huì)降低胚胎發(fā)育速率、縮短壽命, 其編碼的DNA解旋酶/核酸內(nèi)切酶可以維持基因組的穩(wěn)定性, 在細(xì)胞分裂和DNA 復(fù)制中都具有非常重要的作用(Leeet al, 2011)。秀麗線蟲(chóng)div-1、pola-1、pri-1和pri-2編碼的DNA 聚合酶α-引發(fā)酶復(fù)合物啟動(dòng)增殖細(xì)胞的DNA 復(fù)制, RNAi 抑制這些基因的功能會(huì)使得胚胎致死率升高, 此外, 增殖細(xì)胞命運(yùn)的維持需要pola-1、pri-1、pri-2(Yoonet al, 2018)。我們推測(cè), 與之相關(guān)基因在胚胎期的高表達(dá)可能反映了胚胎期較高的DNA 復(fù)制率和細(xì)胞分裂, 因此, 相較于L1, 胚胎期細(xì)胞分裂速度可能更快, 從而需要復(fù)制與修復(fù)相關(guān)基因的高表達(dá)。這些基因在秀麗線蟲(chóng)中, 相較于胚胎期, 其轉(zhuǎn)錄水平在L1 期也均顯著下降(Rünet al, 2014;Boecket al, 2016; Liet al, 2020), 因此L.marina和秀麗線蟲(chóng)類似, 胚胎時(shí)期復(fù)制和修復(fù)等多個(gè)通路基因表達(dá)顯著上調(diào)可能用以支持快速、精準(zhǔn)的細(xì)胞分裂和增殖。

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)海洋線蟲(chóng)在L1 期, Notch、Hippo 和Hedgehog 信號(hào)通路中多個(gè)基因, 與胚胎期相比, 在L1 期轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。lag-1編碼Notch信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子LAG-1, 在發(fā)育過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用, RNAi 敲降lag-1會(huì)導(dǎo)致孵化后的L1 秀麗線蟲(chóng)發(fā)育停滯(Maicaset al, 2021)。Hippo信號(hào)通路中,yap-1(編碼Yes 相關(guān)蛋白)參與秀麗線蟲(chóng)Wnt 介導(dǎo)的神經(jīng)元極化(Leeet al, 2018), 也與秀麗線蟲(chóng)的耐熱性和衰老有關(guān)(Iwasaet al, 2013)。通過(guò)秀麗線蟲(chóng)EMS 誘變發(fā)現(xiàn),zyx-1(編碼含LIM 結(jié)構(gòu)域的黏著斑蛋白)調(diào)節(jié)秀麗線蟲(chóng)突觸維持(Luoet al, 2014)。Hedgehog 信號(hào)通路中,ptc-3(編碼PTC 蛋白)在秀麗線蟲(chóng)中的表達(dá)是高度動(dòng)態(tài)的, 通過(guò)RNAi 抑制秀麗線蟲(chóng)ptc-3基因的功能會(huì)導(dǎo)致致死、不完全蛻皮、體型縮小、vulva 發(fā)育缺陷等(Solovievet al, 2011)。秀麗線蟲(chóng)wrt-8(編碼Hedgehog 相關(guān)蛋白)的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致軸突缺陷(Riveiroet al, 2017)。三個(gè)通路中在秀麗線蟲(chóng)中的大多數(shù)同源基因, 相較于胚胎期, L1 期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也均發(fā)生了顯著下調(diào)(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。因此, 我們推測(cè)海洋線蟲(chóng)和秀麗線蟲(chóng)在胚胎期均需要更高的發(fā)育和細(xì)胞分化調(diào)控因子表達(dá)水平。

KEGG 富集分析表明, 相比于胚胎期, 海洋線蟲(chóng)在L1 期多個(gè)剪切體通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。剪切因子對(duì)于RNA 的加工過(guò)程至關(guān)重要(Mortonet al, 2011)。研究表明prp-40調(diào)控秀麗線蟲(chóng)可變剪切,其編碼的PRP-40 mRNA 前體加工因子是剪接體的重要組成之一(Choudharyet al, 2021)。通過(guò)RNAi 抑制prp-8的功能導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)剪切異常, 其對(duì)于維持整個(gè)胚胎發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞分裂周期調(diào)控起重要作用(Hebeisenet al, 2008)。sftb-1編碼剪切因子3B 亞基,mCherry 標(biāo)記秀麗線蟲(chóng)sftb-1發(fā)現(xiàn)其是一種普遍表達(dá)的發(fā)育必需基因(Serratet al, 2019)。在秀麗線蟲(chóng)中,這些剪切因子的基因L1 期表達(dá)量也均低于胚胎期(Grünet al, 2014; Boecket al, 2016; Liet al, 2020)。最近報(bào)道發(fā)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)胚胎轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度比胚胎后幼蟲(chóng)階段的較長(zhǎng)(Liet al, 2020), 因此推測(cè)海洋線蟲(chóng)與秀麗線蟲(chóng)在胚胎發(fā)育的過(guò)程中, 需要更高的剪切因子相關(guān)基因表達(dá), 可能與胚胎期較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本特征維持和細(xì)胞的快速分裂和分化等相關(guān)。

4 結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明, 與胚胎期相比, 孵化后早期L.marinaL1 幼蟲(chóng)的多個(gè)通路如核糖體、核糖體生物發(fā)生、糖酵解/糖原異生、TCA 循環(huán)和氧化磷酸化通路相關(guān)基因發(fā)生了顯著上調(diào); 多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽受體基因如dop-、npr-和frpr-等在L1 期轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)。與胚胎期相比, L1 幼蟲(chóng)DNA 復(fù)制和修復(fù)相關(guān)、Notch、Hippo 和Hedgehog 信號(hào)通路和剪切體調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生了顯著下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)的海洋線蟲(chóng)早期發(fā)育轉(zhuǎn)錄組變化模式與陸生模式生物秀麗線蟲(chóng)高度相似, 但同一上調(diào)或下調(diào)通路中具體發(fā)生表達(dá)變化的基因有些不同。另外,L.marinaL1 幼蟲(chóng)顯著上調(diào)的核糖體生物發(fā)生通路相關(guān)基因在秀麗線蟲(chóng)中發(fā)生了顯著下調(diào)。因此,L.marina與秀麗線蟲(chóng)早期發(fā)育的表達(dá)調(diào)控機(jī)制高度保守, 秀麗線蟲(chóng)豐富的生物信息學(xué)和突變體庫(kù)等資源和成熟的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究手段將極大地輔助海洋線蟲(chóng)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究, 并推動(dòng)模式海洋線蟲(chóng)體系和平臺(tái)構(gòu)建。結(jié)合秀麗線蟲(chóng)成熟的研究方法, 在L.marina中進(jìn)一步優(yōu)化基因編輯等遺傳操作將會(huì)為海-陸近緣線蟲(chóng)間的發(fā)育進(jìn)化機(jī)制, 海洋線蟲(chóng)對(duì)潮間帶環(huán)境適應(yīng)以及海洋動(dòng)物如何應(yīng)答和適應(yīng)全球氣候變化的分子機(jī)制研究提供新認(rèn)知, 也可為蛻皮類經(jīng)濟(jì)物種如蝦蟹的遺傳育種與產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供重要理論和技術(shù)支持。