偏頭痛藥理實驗模型研究進展*

張澤鵬 ，郭穎 ，李霖 ，劉虹 ，房士明 ，，張晗

（1.天津中醫(yī)藥大學，方劑學教育部重點實驗室，天津 301617；2.天津市南開醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300100；3.天津中醫(yī)藥大學，天津現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 301617）

偏頭痛是一種嚴重影響患者生活質(zhì)量的原發(fā)性神經(jīng)血管疾病，中醫(yī)稱為“厥頭痛”“頭風”“腦風”等，《黃帝內(nèi)經(jīng)》《東恒十書》和《傷寒雜病論》等典籍均有記載[1]。偏頭痛嚴重危害患者身心健康，全球年發(fā)病率達10%以上，2015年世界衛(wèi)生組織全球疾病負擔調(diào)查報告顯示偏頭痛已成為人類第六位常見疾病[2]。一般認為偏頭痛與血管、神經(jīng)、基因等多種因素相關(guān)，偏頭痛發(fā)病機制理論主要學說包括血管學說、神經(jīng)學說以及三叉神經(jīng)血管學說，其中三叉神經(jīng)血管學說獲得廣泛認可。中醫(yī)認為偏頭痛是由于風、瘀、痰、虛雜合而致，風邪侵襲、肝陽上擾、瘀血阻滯導致頭脈經(jīng)絡絀痛[3]。對于肝陽上亢型偏頭痛的治療多選用疏肝解郁、清肝瀉熱和平肝熄風等功效的方劑，如柴胡疏肝散、天麻鉤藤飲和鎮(zhèn)肝熄風湯。對于氣滯淤血型偏頭痛的治療多選用活血化瘀和補益氣血功效的方劑，如通竅活血湯與川芎當歸湯。對于風寒、風熱外邪侵擾的偏頭痛的治療可分別選用川芎茶調(diào)散和芎芷石膏湯[4]。在治療偏頭痛的方劑中使用頻率較高的單味中藥包括天麻、川芎、蔓荊子、黃芩、細辛等。研究偏頭痛需要根據(jù)其發(fā)病機制選擇合適的藥理模型，目前使用較多的偏頭痛模型包括依據(jù)前述3種學說建立的模型，以及根據(jù)中醫(yī)證候特點所建立的模型。上述不同偏頭痛模型的完善與發(fā)展為開發(fā)治療偏頭痛的藥物奠定了堅實的基礎(chǔ)。筆者在本文中對偏頭痛實驗模型進行歸納總結(jié)，詳細介紹了常用的動物實驗模型、發(fā)病原理、造模方法、評價標準以及使用利弊，同時闡述腦腸軸與偏頭痛的關(guān)系，以期為開展偏頭痛研究選擇合適的模型提供參考表格見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

1 刺激三叉神經(jīng)的動物模型

此類模型是依據(jù)三叉神經(jīng)血管學說建立的，當顱內(nèi)外神經(jīng)血管受到電擊、化學試劑等外界刺激，刺激信號由三叉神經(jīng)節(jié)傳遞至三叉神經(jīng)尾核，經(jīng)聯(lián)合腦干和下丘腦核將信號映射到丘腦，造成偏頭痛[5]。目前常用的有三種模型：電刺激三叉神經(jīng)模型、電刺激硬腦膜神經(jīng)末梢模型和炎癥物質(zhì)刺激硬腦膜模型。

1.1 電刺激三叉神經(jīng)模型 該模型發(fā)病原理是電擊使三叉神經(jīng)傳出的信號受阻，誘發(fā)偏頭痛。造模需將大鼠麻醉固定，頭部中央去毛消毒后切開暴露顱骨，以顱中線冠狀縫交叉點前4 mm為前界，交叉點后6mm為后界，鉆開兩個相距1cm的直徑約1mm圓孔，暴露上矢狀竇上硬腦膜，用與線接口連接好的單極電極置于鉆好的圓孔中，直至三叉神經(jīng)節(jié)，選用低頻率電極刺激大鼠[6]。麻醉消失后若觀察到大鼠口鼻分泌物會明顯增加，咀嚼肌收縮劇烈，說明造模成功。亦通過檢測硬腦膜血漿蛋白、血液中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和原癌基因c-Fos蛋白mRNA表達變化判斷造模成功與否[6]。劉婷[7]觀察頭痛寧對電刺激三叉神經(jīng)節(jié)偏頭痛大鼠模型硬腦膜動脈血流和外周血中CGRP的調(diào)節(jié)作用，探究偏頭痛的發(fā)生與CGRP及硬腦膜血流量的關(guān)系，明確了頭痛寧能夠抑制CGRP的表達與減少腦膜血流量，從而有效地治療偏頭痛。張金璐等[8]研究電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)偏頭痛模型發(fā)現(xiàn)c-Jun氨基末端激酶信號轉(zhuǎn)導通路可調(diào)控CGRP的表達，而CGRP表達升高會導致大鼠前肢撓頭、爬籠次數(shù)等行為學發(fā)生變化。

1.2 電刺激硬腦膜神經(jīng)末梢模型 該模型與偏頭痛發(fā)作時病理生理特征類似，采用電位刺激上矢狀竇區(qū)的硬腦膜，刺激信號傳入大鼠三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，造成硬腦膜神經(jīng)源性炎癥，形成模型[9]。實驗選用腹腔注射10%戊巴比妥鈉（用量規(guī)格3.5～4.0mL/kg）的方法麻醉固定大鼠，于頭部中央處去毛消毒并切開皮膚，使顱骨暴露。在距顱中線與冠狀縫交叉點4 mm和6 mm處用臺式牙科鉆分別鉆開直徑約1 mm圓孔，暴露上矢狀竇旁硬腦膜后插入電極，刺激大鼠。電刺激參數(shù)設(shè)置為低頻率電極，電流2.0mA，脈寬0.5 ms，波形方波，刺激時間15～20 min?？疾熘笜税獫{和腦組織的CGRP、P物質(zhì)、去甲腎上腺素（NE）等[10]。孫曉萍等[11]選用電刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜偏頭痛模型研究天舒膠囊對偏頭痛的影響，發(fā)現(xiàn)天舒膠囊可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，緩解疼痛。周莉[12]選用電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜偏頭痛大鼠模型，觀察實驗動物在電刺激前后的行為表現(xiàn)及Fos陽性細胞在中腦導水管周圍灰質(zhì)的分布情況，驗證了電刺激硬腦膜神經(jīng)末梢模型的可靠性。

1.3 炎癥物質(zhì)刺激硬腦膜模型 炎癥物質(zhì)刺激硬腦膜模型的造模原理與電刺激硬腦膜神經(jīng)末梢機理相同。在保護硬腦膜不受損壞的情況下，于前后囟中點右側(cè)旁5 mm處鉆一直徑1 mm的小孔并導入內(nèi)置管，待麻醉的大鼠恢復意識，使用內(nèi)置管輸入“炎癥湯”[inflammatory soup，IS：含 1 mmol/L 前列腺素 E2、1 mmol/L 緩激肽、1 mmol/L 組胺、1 mmol/L 5-羥色胺（5-HT）的磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4][13]。通常檢測血液中CGRP及c-Fos蛋白變化、測量動物的機械性刺激痛閾值和溫度痛閾值判斷是否造模成功[14]。Qu等[15]通過針灸刺激炎癥物質(zhì)模型鼠的風池穴位，驗證針灸對預防偏頭痛發(fā)作具有良好功效。何超[16]利用炎癥物質(zhì)刺激硬腦膜模型研究瞬時受體電位香草酸亞型1通道（TRPV1）在偏頭痛發(fā)病機制中的作用，驗證了TRPV1參與偏頭痛的發(fā)作過程，推測TRPV1可能成為治療偏頭痛新靶點。

在三種刺激三叉神經(jīng)的動物模型中，電刺激三叉神經(jīng)模型、電刺激硬腦膜神經(jīng)末梢模型的發(fā)病機理與人類偏頭痛發(fā)作時的病理表現(xiàn)相似，其中電刺激三叉神經(jīng)模型更利于解釋疾病發(fā)生時生物學的復雜性。不足的是刺激三叉神經(jīng)的動物模型易受到開顱手術(shù)和組織暴露的限制影響，對實驗環(huán)境的衛(wèi)生與操作人員的技術(shù)水平也需一定要求。此外，大鼠經(jīng)麻醉后會在一定程度上減弱刺激造成的偏頭痛的反應，因此不能確切反映偏頭痛的發(fā)病過程。對于此，Burgos-Vega等[17]開發(fā)了一種非入侵性炎癥物質(zhì)的注射方法，在小鼠人字縫和矢狀縫交界處的軟組織處注射炎癥物質(zhì)進行造模，避免了常規(guī)造模時易出現(xiàn)的神經(jīng)損傷風險。

2 體外注射偏頭痛物質(zhì)的動物模型

2.1 硝酸甘油誘導偏頭痛模型 硝酸甘油模型是依據(jù)血管學說建立的，造模原理是注射硝酸甘油后，體內(nèi)產(chǎn)生的一氧化氮（NO）引發(fā)腦部血管擴張，誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥從而產(chǎn)生偏頭痛[18]。實驗采用皮下注射硝酸甘油注射液（5.0 mg/mL）（注射量為10 mg/kg）大鼠模型，40 min后大鼠若出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多和煩躁不安等，則證明造模成功[19]。除根據(jù)行為變化判斷造模成功與否外，亦可檢測大鼠血液中c-Fos、c-Jun基因表達陽性細胞數(shù)及陽性細胞面積和灰度、血管活性物質(zhì)CGRP、血管內(nèi)皮素以及神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的含量變化進行判斷。姜維等[20]發(fā)現(xiàn)使用無水乙醇配置的硝酸甘油溶液（5 mg/mL）易對偏頭痛模型的均勻性產(chǎn)生干擾，而采用添加適量水后形成的硝酸甘油與乙醇混懸液進行造模，能夠降低皮下注射的刺激性影響，造模效果均一，有效改進了硝酸甘油動物模型。Guo等[21]利用硝酸甘油模型檢測川芎、蘇鐵中能夠緩解偏頭痛的有效成分。硝酸甘油偏頭痛模型經(jīng)濟易復制，且不需做開顱手術(shù)，便于觀察意識清晰偏頭痛模型大鼠的行為，是目前研究藥物對偏頭痛作用的常用模型。不足之處是使用硝酸甘油誘導偏頭痛無法直接針對顱內(nèi)血管神經(jīng)產(chǎn)生效果，具有全身的干擾性。

2.2 利血平低化5-HT偏頭痛模型 5-HT偏頭痛模型是依據(jù)神經(jīng)遞質(zhì)假說、皮層抑制擴散（CSD）學說建立的，5-HT代謝紊亂會導致偏頭痛的發(fā)生，而利血平能使血管擴張，消耗腦內(nèi)的兒茶酚胺和5-HT，造成5-HT突然變化。當血漿5-HT濃度下降時，大動脈張力性、收縮性消失，血管壁擴張從而引發(fā)偏頭痛。造模采用利血平生理鹽水溶液，以0.1 mg/kg的劑量對小鼠背部進行皮下注射，連續(xù)注射7 d。每日注射時，需根據(jù)小鼠每日體質(zhì)量變化調(diào)整利血平用量。第8天小鼠出現(xiàn)閉目、四肢無力、體溫下降、厭食疲倦和抽搐等行為說明造模成功[22]。檢測方法除監(jiān)測偏頭痛行為外，還有采用熱板法測痛閾值、測定大腦臟器系數(shù)和對大腦血凝塊吸收情況、測血管內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的含量等方法[23]。段浩博等[24]利用注射利血平模型研究清腦止痛膠囊對偏頭痛模型大鼠血漿和中腦組織相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及炎性因子的影響，測量了大鼠血漿和中腦組織5-HT、前列環(huán)素E2、腫瘤壞死因子α等含量水平，發(fā)現(xiàn)藥效與調(diào)節(jié)神經(jīng)源性炎癥和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)。王晶等[25]利用此模型研究芎附方對小鼠模型的治療作用，觀察小鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及血清中NO、NO酶的影響，發(fā)現(xiàn)芎附方能夠調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)的釋放，緩解偏頭痛癥狀。注射利血平后的模型小鼠會因5-HT急劇減少導致顱外動脈病理性擴張，腦血流增加，引發(fā)劇烈頭痛，符合偏頭痛發(fā)病相關(guān)病理特征，但不足的是造模時間長、操作復雜。

2.3 注射CGRP誘導偏頭痛模型 CGRP誘導偏頭痛模型的建立依據(jù)是神經(jīng)遞質(zhì)假說，三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中約含有50%的CGRP，CGRP紊亂是造成偏頭痛的重要原因。Araya等[26]采用腹腔注射麻醉固定大鼠的方法，將一根無菌的針頭插入眼眶顴部，針頭連接的0.5 mL注射器需與頭部中線成10°，待針頭接觸右三叉神經(jīng)節(jié)后，注射CGRP造模。注射后大鼠會出現(xiàn)眶周機械性疼痛、光敏感和焦慮樣行為，說明造模成功。Avona等[27]在研究注射CGRP誘導偏頭痛模型中發(fā)現(xiàn)雌性大鼠更易受到GCRP的影響，證明了CGRP信號具有一定的二型性，有利于從兩性角度分析偏頭痛的作用機制。該模型便于理解神經(jīng)遞質(zhì)的作用機制，但涉及成本較高，模型不易復制。

3 基因敲除偏頭痛模型

基因工程偏頭痛鼠模型主要是利用基因敲除技術(shù)而建立的，關(guān)于基因工程模型鼠的偏頭痛類別目前主流還是家族性偏癱型偏頭痛（FHM）[28]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3種基因會誘發(fā)家族性偏癱型偏頭痛，分別為：CACNA1A（位于19p13，基因編碼腦特異性P/Q型鈣通道α1A亞單位[29]）、ATP1A2（位于1q23，基因編碼Na+/K+泵的α2亞單位[30]）和SCN1A（位于2q24.3基因編碼神經(jīng)元鈉離子通道Nav1.1的α2亞單位[31]），針對前兩種基因敲除研發(fā)出了兩種較為常用的模型：FHM-1模型（Familial Hemiplegic Migraine Type 1）、FHM-2 模型（Familial Hemiplegic Migraine Type 2）。

3.1 FHM-1模型 FHM-1模型是孟德爾遺傳學的先兆性偏頭痛的亞型，具有獨特的生物學遺傳特征，該癥狀是由CACNA1A基因的編碼神經(jīng)元Cav2.1鈣離子通道里的1個亞基缺失突變引起的[32]。研究FHM-1模型發(fā)現(xiàn)基因缺失能夠增加小腦神經(jīng)元的Cav2.1電流密度，增強了神經(jīng)肌肉接點的神經(jīng)傳遞，降低了動物全身部位的閾值，增加了CSD的速度，與人類先兆性偏頭痛的發(fā)病機制類似[33]。FHM-1小鼠是研究偏頭痛機制和治療方法可靠的基因遺傳改造動物模型。Adam等[34]就曾發(fā)現(xiàn)FHM-1偏頭痛模型消化道運動表現(xiàn)障礙行為與人類偏頭痛患者在消化道表現(xiàn)具有相似性。Balkaya M等[35]利用FHM-1模型發(fā)現(xiàn)小鼠心理壓力能夠影響CSD易感性，以及探究偏頭痛、壓力與遺傳因素的關(guān)系。

3.2 FHM-2模型 FHM-2模型與編碼Na+/K+泵的α2亞基的基因ATP1A2中的突變和染色體1q23（OMIM 602481）有關(guān)，發(fā)病機制是由ATP1A2單個等位基因功能喪失引起的[36]。張美辰等[37]以人類患病者基因檢測對比，提出FHM2型一個新型的突變位點，發(fā)現(xiàn)在ATP1A2基因上存在一個新型致病突變位點p.G762S。

FHM模型不但適用于偏癱型頭痛，還適用于普通型偏頭痛，除了表現(xiàn)出偏癱型的行為，其他癥狀均與普通型偏頭痛相符，癥狀多出現(xiàn)于單側(cè)或雙側(cè)額疼痛。目前在已建立的FHM模型中，F(xiàn)HM-1模型和FHM-2模型均屬于常用類型，它們支持了CSD學說這一觀點。此外也存在位于2q24.3基因編碼神經(jīng)元鈉離子通道Nav1.1的α2亞單位SCN1A相關(guān)的FHM-3模型，以及與第四或第五基因相關(guān)的FHM-4或FHM-5模型，任何相關(guān)基因的改變或缺失都會引發(fā)嚴重的偏頭痛癥狀，但目前對FMH-3、FHM-4和FHM-5模型基因突變研究單一且較少，有待開發(fā)。

4 體外細胞模型

用于研究偏頭痛的細胞模型均為神經(jīng)節(jié)分離培養(yǎng)模型，主要通過檢測CGRP變化來反映偏頭痛發(fā)作過程。該模型尤其適合單一靶點藥物研究，模型優(yōu)點是易復制，周期短。Wang等[38]使用體外培養(yǎng)的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)的原代細胞模型，首次證明5-羥色胺7（5-HT7）受體直接參與三叉神經(jīng)元釋放CGRP和P物質(zhì)。體外細胞造模操作精細，需較高技術(shù)水平支持，但實驗脫離動物本身整體性進行，神經(jīng)信號的傳導機制這一方面無法解釋。

5 中醫(yī)證候偏頭痛模型

中醫(yī)證候是指疾病發(fā)生和演變過程中某階段以及患者個體當時所處特定內(nèi)、外環(huán)境本質(zhì)的反映，能夠揭示偏頭痛的病因、病位、病性等。中醫(yī)臨床偏頭痛證候表現(xiàn)常為肝陽上亢、氣滯血瘀或肝風挾瘀等，但因造模技術(shù)及經(jīng)驗的缺乏，應用于中醫(yī)證候偏頭痛模型的主要為肝陽上亢和血瘀證。王美靜等[39]采用連續(xù)21天給大鼠灌胃附子湯[2 g/（kg·d）]，然后給藥硝酸甘油誘導偏頭痛，建立肝陽上亢偏頭痛模型。附子湯具有燥熱功效，易灼傷肝腎之陰，大鼠灌胃后所產(chǎn)生的臨床發(fā)病表現(xiàn)符合中醫(yī)認為的肝陽上亢證候[40]。中醫(yī)認為“寒則凝，凝則成瘀”，趙啟鵬[41]建立血瘀型偏頭痛模型，采用動物皮下注射腎上腺素（1.6 mg/kg）和冰水浴聯(lián)合構(gòu)建，該方法中冷水刺激血管收縮，促進血栓形成，腎上腺素可使外周血管強烈收縮，心臟負荷加重，促使血液運行障礙。

6 潛在新型偏頭痛實驗模型建立

近年來發(fā)現(xiàn)與一般人群相比，患有胃腸道疾病人群出現(xiàn)偏頭痛頻率會增加[41]，例如幽門螺旋桿菌感染和腸易激綜合征、胃輕癱、腹腔疾病以及微生物群的改變都會引發(fā)偏頭痛[43-44]。腸道菌群是腦腸網(wǎng)絡的重要組成部分，它能通過腦腸軸與大腦進行交流，與內(nèi)臟和大腦同步發(fā)育。炎癥因子和血管活性介質(zhì)（5-HT、神經(jīng)肽、P物質(zhì)等）傳遞到循環(huán)系統(tǒng)引發(fā)的慢性炎癥反應、腸內(nèi)微生物群對腸內(nèi)免疫環(huán)境的調(diào)節(jié)以及自主神經(jīng)對腸內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)，這些作用都證明了腸道菌群能夠影響神經(jīng)系統(tǒng)和偏頭痛[45-46]。此外腸道菌群與心理過程和心理現(xiàn)象也存在聯(lián)系，參與了許多精神和神經(jīng)疾病致使偏頭痛的病理生理過程。Zhu等[47]在研究治療胃腸道菌群感染誘發(fā)抑郁癥偏頭痛的過程中，采用慢性應激和抑郁大鼠模型，觀察胃腸道組織病理和胃腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)高濃度小檗堿對于抑郁癥所致偏頭痛癥狀有緩解作用。微生物-腸-腦軸是研究偏頭痛新發(fā)病機制的重要方向，但實驗干擾腸道菌群對大腦所產(chǎn)生反應的機制尚不明確，因而未來可嘗試依據(jù)腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂誘發(fā)偏頭痛建立模型，幫助探究偏頭痛相關(guān)發(fā)病機制。

7 總結(jié)

依據(jù)不同的理論和發(fā)病機制建立偏頭痛藥理模型各有其優(yōu)缺點，在研究偏頭痛藥物及中藥方劑過程中應根據(jù)偏頭痛的分型選用合適的動物模型。其中刺激三叉神經(jīng)模型和硝酸甘油模型比較成熟，應用較多。隨著分子生物學技術(shù)的進步，近年來相繼報道了有關(guān)針對偏頭痛特定靶點的基因工程動物模型?；蚬こ虅游锬Ｐ涂捎糜诰_研究偏頭痛藥物的作用靶點和機制，是極具發(fā)展前景動物模型。此外關(guān)于中醫(yī)證候偏頭痛模型研究的興起，極大促進了中醫(yī)理論指導下中藥治療偏頭痛的研究。偏頭痛的中醫(yī)證型分類廣，但目前只開發(fā)出肝陽上亢和血瘀證候模型，對于其他中醫(yī)證型相關(guān)的偏頭痛模型則研究較少，因此更有必要更進一步研究符合中醫(yī)證候特點偏頭痛模型，促進防治偏頭痛中藥的開發(fā)。