eEF2K在癲癇突觸可塑性的研究進(jìn)展*

楊茜3

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院病理診斷與疾病中心，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理科，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000)

癲癇是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腦部神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過7000萬人受累[1]。癲癇發(fā)作是由于興奮性和/或抑制性突觸傳遞失調(diào)引起的神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種抑制性神經(jīng)元，通過超極化抑制其突觸后靶點(diǎn)，為興奮性神經(jīng)傳遞提供必要平衡。Heise C等[2]通過eEF2K基因敲除小鼠和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，eEF2K可以負(fù)向調(diào)控GABA，打破神經(jīng)元興奮性與抑制性之間的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)癲癇的發(fā)生。激活eEF2K，不僅可以誘發(fā)癲癇發(fā)作，還參與了學(xué)習(xí)和記憶能力的調(diào)節(jié)。目前可用的癲癇藥物雖然可以緩解癲癇發(fā)作，但沒有改變潛在致病過程。長(zhǎng)期反復(fù)癲癇發(fā)作的患者仍伴有學(xué)習(xí)、記憶能力的下降，而背后的分子信號(hào)機(jī)制卻令人難以捉摸。

突觸可塑性是指突觸對(duì)其神經(jīng)元回路中的活動(dòng)做出適應(yīng)改變的能力。長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(long-term depression，LTD)是兩種編碼記憶的突觸可塑性形式。這種突觸傳遞強(qiáng)度的長(zhǎng)期變化被假設(shè)為支持信息存儲(chǔ)，因此突觸可塑性被認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)與記憶的基礎(chǔ)。大量證據(jù)表明，蛋白質(zhì)從頭合成和mRNA翻譯是持久記憶和突觸可塑性形成的必要條件[3]。激活eEF2K誘導(dǎo)eEF2磷酸化并抑制eEF2活性，阻礙核糖體沿著mRNA移動(dòng)合成蛋白質(zhì)[4]。因此，eEF2作為蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子，是突觸可塑性、記憶鞏固作用的潛在調(diào)節(jié)因子[5]。最近研究表明，阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)存在LTP功能減弱，這是由于AD中存在eEF2過度磷酸化，導(dǎo)致海馬CA1區(qū)LTP損傷加重學(xué)習(xí)和記憶缺陷[6-7]。癲癇與AD存在共病——學(xué)習(xí)和記憶能力下降，我們有理由認(rèn)為癲癇患者中學(xué)習(xí)和記憶能力下降是eEF2/eEF2K通過調(diào)節(jié)突觸可塑性功能來發(fā)揮了重要的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 eEF2K結(jié)構(gòu)與功能

eEF2K活性依賴于鈣/鈣調(diào)蛋白(Ca/CaM)的調(diào)節(jié)，又被稱為鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅲ(CaMKⅢ)。eEF2K的結(jié)構(gòu)與常規(guī)的蛋白激酶不同，在序列上與主要的蛋白激酶超家族(絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶)具有有限的相似性和同源性[8]。

細(xì)胞和生物體的生存都需要蛋白質(zhì)合成來維持，而eEF2K使eEF2在Thr56位點(diǎn)上發(fā)生磷酸化，抑制其與核糖體的相互作用，阻礙蛋白的合成[4]。eEF2磷酸化與蛋白質(zhì)從頭合成的減少有關(guān)，Beckelman BC等[6]在證明Tg19959 AD模型小鼠中存在p-eEF2高表達(dá)的情況下通過翻譯表面?zhèn)鞲?SUnSET)方法檢測(cè)到小鼠海馬區(qū)蛋白質(zhì)從頭合成顯著減少。這進(jìn)一步驗(yàn)證了eEF2/eEF2K在mRNA翻譯的延伸期調(diào)控中發(fā)揮核心作用，eEF2去磷酸化是促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的重要角色。

2 eEF2K活性的調(diào)節(jié)

eEF2K的活性除受鈣離子調(diào)節(jié)外，還受多種通路的調(diào)控。目前已知的影響eEF2K活性的上游分子有mTOR、AMPK和ERK[8]。mTOR是細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及能量維持的重要傳感器，是eEF2K重要的上游分子，可以負(fù)向調(diào)節(jié)eEF2K活性，解除對(duì)eEF2的抑制[9]。mTORC1在Ser70、Ser78、Ser359、Ser392、Ser396、Ser470、Ser2448和Ser2481位點(diǎn)上抑制eEF2K的活性，阻止eEF2磷酸化，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成[10-11]。mTORC1還可能激活核糖體蛋白S6激酶(S6K)，促進(jìn)eEF2K在Ser366處被S6K磷酸化[12]。有趣的是，抑制eEF2K活性不能反向影響mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)，p-mTOR(S2448)及其2個(gè)已知的下游底物p-70S6K(Thr389)和p-4EBP1水平?jīng)]有改變[13]。

ERK是eEF2K另一個(gè)的負(fù)向調(diào)控因子，包括ERK1和ERK2，在細(xì)胞周期中起到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和G1/S轉(zhuǎn)換作用[14]。ERK可以通過兩種不同的方式調(diào)節(jié)eEF2K的活性，第一種涉及eEF2K在Ser359的直接磷酸化，導(dǎo)致eEF2K失活[14]。第二種方式是ERK通過誘導(dǎo)p90核糖體蛋白S6激酶(p90RSK)使eEF2K的Ser366位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致其失活[12]。在2007年一項(xiàng)研究中，eEF2K的Ser377位點(diǎn)也被ERK信號(hào)磷酸化[14]。此外，ERK1/2通過激活CDKs和mTOR途徑驅(qū)動(dòng)某些癌癥的發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)展和蛋白質(zhì)合成。反之，ERK1/2的過度激活可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯、細(xì)胞凋亡、自噬和衰老。ERK1/2的活性不僅受外源正信號(hào)的介導(dǎo)，還受內(nèi)源性負(fù)信號(hào)的介導(dǎo)，如AMPK[15]。ERK通路在神經(jīng)性疾病受到的關(guān)注相對(duì)較少，在癌癥中有更深入的研究。

除Ca2+/CaM可以正向調(diào)節(jié)eEF2K外，AMPK也被認(rèn)為是eEF2K活性的正調(diào)控因子[16]。AMPK是一種關(guān)鍵的能量傳感器，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝來維持能量穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)AMPK激活后通過磷酸化eEF2K來抑制蛋白質(zhì)延伸以保存能量，它還可以促進(jìn)p53的磷酸化，阻止DNA合成，導(dǎo)致G1期細(xì)胞周期停滯[17]。在細(xì)胞ATP低下的情況下，AMPK可通過多個(gè)位點(diǎn)磷酸化激活eEF2K，而新發(fā)現(xiàn)的Ser398[18]或Ser491/Ser492[19]對(duì)eEF2K在Ser366的磷酸化產(chǎn)生負(fù)面影響[14]。多種細(xì)胞應(yīng)激可以激活A(yù)MPK并增加eEF2 Thr56磷酸化，比如已被證實(shí)的有營(yíng)養(yǎng)剝奪[14]、核糖體應(yīng)激[20]和pH值的變化[21]。其中營(yíng)養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)的AMPK激活阻斷了eEF2K和雙特異性絲裂絲溶蛋白激酶(MEK)1/2之間的相互作用，導(dǎo)致MEK1/2-ERK1/2核糖體蛋白S6激酶α-1(P90RSK)-eEF2K-MEK1/2信號(hào)環(huán)被破壞，從而導(dǎo)致ERK1/2的失活[14]。

eEF2K似乎還參與了關(guān)鍵信號(hào)分子的激活，如PI3K/Akt、Src/FAK、MAPK、整合素β1、MCP1、細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc以及腫瘤微環(huán)境[22]。除外在的信號(hào)通路調(diào)節(jié)外，eEF2K也受自身磷酸化調(diào)節(jié)，Ser78、Ser359和Ser366磷酸化導(dǎo)致p-eEF2水平降低，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成增加，而Ser392、Ser398和Ser499殘基的磷酸化導(dǎo)致eEF2K激活和蛋白質(zhì)合成減少[22]。上述表明，eEF2K的活性受不同途徑的密切調(diào)控，但目前活性調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚不清楚。

3 eEF2/eEF2K在突觸可塑性改變的作用

eEF2/eEF2K信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)突觸可塑性的形式來影響記憶形成，常見調(diào)節(jié)類型為代謝型谷氨酸受體依賴性LTD(deficiency of metabotropic glutamate receptor 5-dependent LTD,mGluRLTD)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(drain-derived neurotrophic factor，BDNF)誘導(dǎo)LTP[23-24]。在老年APP/PS1 AD模型小鼠中，加用eEF2K基因的抑制劑NH125后降低了eEF2磷酸化，挽救了小鼠海馬mGluR-LTD缺陷[25]。eEF2K另一高度選擇性抑制劑A484954不僅通過抑制eEF2K活性來增強(qiáng)海馬突觸傳遞，還增加海馬神經(jīng)元的活性[26]。Beckelman BC[6]在eEF2K+/-和Tg19959 /eEF2K+/-AD模型中同樣發(fā)現(xiàn)eEF2K基因減少抑制eEF2過度磷酸化，改善Tg19959AD模型LTP的損傷，但不影響β-淀粉樣蛋白病理改變。目前與X染色體相關(guān)的智力障礙蛋白聚谷氨酰胺結(jié)合蛋白1(PQBP1)被定為翻譯延伸和mGluR-LTD的新型調(diào)節(jié)劑，特異性結(jié)合非磷酸化eEF2并抑制eEF2K介導(dǎo)的磷酸化來調(diào)節(jié)海馬mGluR-LTD和mGluR-LTD相關(guān)行為[27]。老年小鼠隨著年齡增加，LTP也會(huì)減弱，而抑制eEF2K，減低eEF2的磷酸化，可以緩解AD小鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(new object recognition，NOR)和水迷宮實(shí)驗(yàn)(morris water maze，MWM)任務(wù)中的記憶缺陷[6]。在前期研究中，給予小鼠腹腔注射鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作，并對(duì)其進(jìn)行了場(chǎng)景恐懼行為學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示慢性癲癇小鼠恐懼記憶的形成及對(duì)場(chǎng)景恐懼記憶的回憶均受到了損害，而且LTP明顯減弱[28]。這些數(shù)據(jù)表明，不管是AD或癲癇小鼠，eEF2/eEF2K分子通過改變突觸可塑性來損害了學(xué)習(xí)記憶能力。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是調(diào)節(jié)突觸可塑性的核心因子，調(diào)節(jié)著海馬體和其他腦區(qū)LTP[24]。當(dāng)eEF2K失活，eEF2去磷酸化增加海馬BDNF蛋白合成[5]。靶向破壞BDNF基因的小鼠表現(xiàn)出SC-CA1突觸的基礎(chǔ)突觸傳遞和LTP改變，這可以通過外源性應(yīng)用重組BDNF來挽救。在PD患者和PD動(dòng)物模型中也存在突觸可塑性改變和認(rèn)知障礙現(xiàn)象，檢測(cè)海馬(CA1和CA2區(qū))中eEF2K活性增加，紋狀體、黑質(zhì)內(nèi)側(cè)核和迷走神經(jīng)背核(DMX)的eEF2K表達(dá)增加[7]，在黑質(zhì)紋狀體通路中發(fā)現(xiàn)BDNF水平降低[29]。AD模型小鼠也表現(xiàn)出一致的現(xiàn)象，但經(jīng)過八臂迷宮和Y-maze水迷宮訓(xùn)練后，空間記憶的提高增加了海馬的BDNF mRNA水平，也改善了LTP的損傷[30]。eEF2K減少抑制AD小鼠相關(guān)的eEF2過度磷酸化，改善了記憶缺陷和海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的損傷,從而挽救突觸收縮。

樹突棘是神經(jīng)元突觸輸入的主要位點(diǎn)，神經(jīng)元可塑性的形態(tài)相關(guān)性由樹突棘的密度和形態(tài)表示。樹突棘的數(shù)量或形狀的變化與突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶密切聯(lián)系[31]。eEF2K的減少減輕了樹突棘形態(tài)、突觸后密度形成、從頭蛋白質(zhì)合成和樹突多核糖體組裝方面的AD相關(guān)缺陷[6]。BDNF通過激活翻譯起始和延伸過程誘導(dǎo)樹突中的局部蛋白質(zhì)合成[32]。這是由mTORC1-真核引發(fā)因子4E結(jié)合蛋白(4EBP)信號(hào)傳導(dǎo)和mTORC1- eEF2信號(hào)傳導(dǎo)的介導(dǎo)的[33]。綜上認(rèn)為，eEF2/eEF2K路通對(duì)學(xué)習(xí)、記憶的影響主要體現(xiàn)在改變突觸可塑性的活性和形態(tài)及從頭蛋白合成，并通過多條通路實(shí)現(xiàn)。

4 eEF2/eEF2K在癲癇中的作用

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，除表現(xiàn)出復(fù)雜的癲癇發(fā)作外，認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)/記憶、行為靈活性、精神疾病(如抑郁癥、焦慮癥、精神病和自閉癥譜系障礙)可合并存在[34]。GABA的紊亂被認(rèn)為是癲癇發(fā)作的關(guān)鍵，eEF2K負(fù)向調(diào)控GABA釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性和抑制性突觸傳遞之間的不平衡，增加癲癇的易感性[2]。另一項(xiàng)研究描述了在原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞中特異性抑制eEF2K導(dǎo)致不規(guī)則神經(jīng)元活動(dòng)變得同步化[42]。

眾所周知，慢性癲癇患者除反復(fù)癲癇發(fā)作外還合并有學(xué)習(xí)和記憶能力減弱現(xiàn)象。激活eEF2K活性誘導(dǎo)癲癇發(fā)生同時(shí)，還抑制相關(guān)蛋白合成及導(dǎo)致突觸可塑性失調(diào)，加重認(rèn)知障礙。突觸蛋白(synapsins)在神經(jīng)傳遞中受到阻礙，突觸功能、突觸形態(tài)的選擇性分布都可導(dǎo)致興奮性和抑制性突觸傳遞之間的紊亂，導(dǎo)致癲癇發(fā)生[22]。eEF2/eEF2K通路在mRNA翻譯水平上調(diào)節(jié)海馬區(qū)興奮性/抑制性平衡，該通路的抑制將平衡推向抑制性一側(cè)，而Synapsin1-KO小鼠eEF2K的遺傳或藥理學(xué)缺失可能挽救該小鼠的癲癇發(fā)作[2]。確實(shí)，與WT小鼠以及synapsin1/eEF2K雙KO小鼠相比，Synapsin1-KO小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)烈的癲癇表型[2]。有趣的是，磷酸化eEF2的水平在Synapsin1-KO中含量比WT高3倍多，當(dāng)它經(jīng)eEF2k抑制劑NH125處理后磷酸化eEF2歸一化到WT水平時(shí)，Synapsin1-KO小鼠的癲癇表現(xiàn)得到解救[2]。Guo D等[35]研究人員發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后繼發(fā)性癲癇小鼠組中，mTOR信號(hào)通路異常激活。給予雷帕霉素治療后，在長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月的視頻追蹤過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以緩解甚至逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷后繼發(fā)性癲癇小鼠的癲癇發(fā)作。Yang F等[36]建立了一個(gè)黑素細(xì)胞系mTOR過度激活的小鼠模型(Mitf-M-CreTsc2KO mice；cKOmice))，研究mTOR通路在黑色素生成中的調(diào)節(jié)作用，令人意外的是，這個(gè)小鼠模型出現(xiàn)了自發(fā)性復(fù)發(fā)性癲癇。eEF2K是 mTOR 信號(hào)通路中重要的靶物之一，并與蛋白質(zhì)翻譯密切相關(guān)，因此，mTOR-eEF2K分子信號(hào)傳導(dǎo)通路可能是研究癲癇發(fā)病機(jī)制的重要的候選通路之一。

Taha E等[8]發(fā)現(xiàn)eEF2/eEF2K通路是海馬神經(jīng)發(fā)生的上游，eEF2控制海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)中神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白的表達(dá)。當(dāng)DG興奮性成熟神經(jīng)元中eEF2K-KO可增加幼齡小鼠神經(jīng)發(fā)生水平，改善海馬依賴性行為，并使老齡小鼠的認(rèn)知能力恢復(fù)至幼齡小鼠的認(rèn)知能力[8]，說明eEF2/eEF2K信號(hào)對(duì)于成熟DG的神經(jīng)發(fā)生和特定相關(guān)行為能力起著關(guān)鍵作用。而調(diào)控eEF2磷酸化可以改變DG的興奮/抑制平衡，同時(shí)改善對(duì)癲癇的抵抗[2]。eEF2/eEF2K也可定位于突觸后間隙，Ca2+通過突觸后通道內(nèi)流，以及從內(nèi)部?jī)?chǔ)存釋放，激活神經(jīng)元樹突中eEF2/eEF2K通路，在過程中NMDA受體與谷氨酸結(jié)合介導(dǎo)的突觸后Ca2+內(nèi)流[5]，這也就是說明激活NMDA受體可提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，引起神經(jīng)元興奮性增加，誘發(fā)癲癇發(fā)作，而eEF2K介導(dǎo)的eEF2磷酸化參與其中。突觸活動(dòng)中除了NMDA型谷氨酸受體之外，MEK/ERK和mTORC1通路的調(diào)節(jié)，以及AMP激酶的調(diào)節(jié)，也可導(dǎo)致eEF2K活性快速而短暫的增加[4]。重要的是，突觸活動(dòng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元mTORC1和MEK/ERK的刺激需要Ca2+內(nèi)流。綜合起來，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明eEF2K通過影響興奮/抑制平衡，成為治療疾病系統(tǒng)疾病，包括但不限于癲癇[2]。

5 結(jié)語

eEF2K在調(diào)整蛋白質(zhì)合成和特定mRNAs的翻譯中的作用越來越清楚。人們對(duì)于eEF2/eEF2K在癲癇/致癇發(fā)生和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究越來越深入，但仍缺乏關(guān)于癲癇發(fā)生及反復(fù)抽搐導(dǎo)致的學(xué)習(xí)和記憶能力的下降神經(jīng)病理生理學(xué)的確切機(jī)制的信息，以及這種獨(dú)特的激酶及其底物在神經(jīng)系統(tǒng)疾病蛋白翻譯功能障礙的作用。目前存在很多eEF2K有效的抑制劑，但作用仍是局限的。為了將eEF2/eEF2K靶向治療藥物用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究，開發(fā)更多的分子抑制劑在內(nèi)的高效、特異的治療策略仍然是當(dāng)務(wù)之急。