超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰幼兒輔助食品中多種獸藥殘留

羅瑞漣, 吳正雙, 梁熾瓊, 羅麗婷

(1. 佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心, 廣東 佛山 528051; 2. 佛山市第五人民醫(yī)院, 廣東 佛山 528200)

嬰幼兒作為一類最特殊、最敏感、最容易受到傷害的群體,其食品安全問題尤其需要得到更多的關(guān)注。曾經(jīng)發(fā)生的多起“毒奶粉”事件給人們敲響了食品安全的警鐘,這些年我國也在不斷地加強(qiáng)對(duì)嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量安全監(jiān)管,出臺(tái)了一系列最嚴(yán)格的管理政策[1]。嬰幼兒輔助食品作為一類特殊的膳食食品,是嬰幼兒從斷乳期到適應(yīng)普通食物的必備過渡期食品[2],其安全性同樣應(yīng)該得到重視?！昂嗍稀鄙a(chǎn)的營養(yǎng)米粉因添加豬肝粉導(dǎo)致鉛超標(biāo)的事件,反映出了嬰幼兒輔助食品生產(chǎn)的原料亂象,產(chǎn)品質(zhì)量存在安全隱患。為加強(qiáng)監(jiān)督管理,衛(wèi)生部發(fā)布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒谷類輔助食品》[3]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒罐裝輔助食品》[4],國家食藥監(jiān)總局也先后發(fā)布了《嬰幼兒輔助食品生產(chǎn)許可審查細(xì)則》(2017版)和《關(guān)于落實(shí)嬰幼兒輔助食品生產(chǎn)許可審查細(xì)則 嚴(yán)格生產(chǎn)許可工作的通知》[5,6]。世界各國和組織如國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission, CAC)[7]、歐盟[8]、澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局[9]、美國[10]、日本[11],為保證嬰幼兒輔助食品的質(zhì)量,同樣制定了一些標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)。然而,除CAC規(guī)定抗生素和激素不得檢出外,其他標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)均只規(guī)定了嬰幼兒輔助食品中污染物、部分農(nóng)藥殘留和真菌毒素限量,并未對(duì)抗生素和抗病毒等獸藥殘留制定限量。這意味著各國對(duì)嬰幼兒輔助食品中的獸藥殘留是“零容忍”的[12]。獸藥在畜牧業(yè)中常被用于治療疾病、提高生長(zhǎng)和飼養(yǎng)效率。然而,獸藥的濫用會(huì)使部分藥物殘留在供人食用的動(dòng)物源性食品中,從而給食品安全帶來威脅。生產(chǎn)嬰幼兒輔助食品的原輔料中常常含有魚類、肉類、肝類等動(dòng)物性組織,因此存在獸藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)。而且鑒于國外嬰幼兒輔食品種豐富,特別是含肉食品,海關(guān)總署尚且沒有出臺(tái)相關(guān)的法規(guī)來統(tǒng)一規(guī)范進(jìn)口[13]。我國目前也還沒有發(fā)布針對(duì)嬰幼兒輔食多獸藥殘留的相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),使得這類產(chǎn)品的監(jiān)管工作存在盲點(diǎn)和難點(diǎn)。為此,有必要開發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢出限盡可能低的測(cè)定嬰幼兒輔助食品中多獸藥殘留的方法。

現(xiàn)有的測(cè)定多獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)方法[14,15]和研究[16-23]大多應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS),這是因?yàn)槠渚哂蟹治鲂矢摺㈧`敏度高等優(yōu)勢(shì)。但是,研究對(duì)象多為水產(chǎn)品、畜禽肉、雞蛋、牛奶和奶粉等,針對(duì)嬰幼兒輔助食品中多獸藥殘留的研究相對(duì)較少。如Aguilera-Luiz等[12]采用QuEChERS法檢測(cè)了肉類嬰兒食品和配方奶粉中29種獸藥殘留,發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)品存在少量獸藥殘留;Jia等[24]采用離子阱高分辨質(zhì)譜同時(shí)篩查了嬰幼兒食品中333種農(nóng)藥和獸藥殘留,檢出部分陽性產(chǎn)品;Gómez-Pérez等[25]同樣采用離子阱高分辨質(zhì)譜分析了添加肉類、魚類和蔬菜類的嬰兒食品中的農(nóng)獸藥殘留,所檢測(cè)的樣品均未發(fā)現(xiàn)農(nóng)獸藥殘留。不足的是,這些研究多采用高分辨質(zhì)譜篩查,定量結(jié)果不夠準(zhǔn)確,而且儀器昂貴,不利于推廣。

嬰幼兒輔助食品基質(zhì)復(fù)雜,包含大量蛋白質(zhì)和脂類,為樣品前處理帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。Captiva EMR-Lipid固相萃取柱是一種新型的脂質(zhì)增強(qiáng)型去除產(chǎn)品,其空間排阻和疏水性作用可以選擇性地去除脂類而不吸附目標(biāo)化合物,具有良好的凈化效果,且不影響分析物的回收率。本研究采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱作為凈化手段,對(duì)動(dòng)物源性食品中常有的藥物在嬰幼兒輔助食品中的殘留同時(shí)進(jìn)行了篩查和定量分析,包括喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、硝基咪唑類、抗病毒類和氯霉素類共50種獸藥。該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠,樣品量消耗少,為嬰幼兒輔食風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和隱患排查提供了行之有效的分析方法,對(duì)保障下一代的健康成長(zhǎng)具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

50種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于95%,購自Dr. Ehrenstorfer公司;甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純,購于上海CNW公司;Captiva EMR-Lipid固相萃取柱(3 mL/300 mg)購于安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quard 5500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS),美國SCIEX公司;Milli-Q超純水機(jī),德國Merck公司;MV5多通道平行濃縮儀,美國LabTech公司;電子天平;旋渦混合器;超聲波清洗器;離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取50種分析物標(biāo)準(zhǔn)品各約1.0 mg(以單體計(jì))于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解,得到質(zhì)量濃度約為100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于-18 ℃下保存。準(zhǔn)確吸取上述各儲(chǔ)備液適量,用乙腈定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃下冷藏保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:用乙腈將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋至質(zhì)量濃度為5、10、50、100、500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取陰性樣品按樣品前處理的方法提取,得到空白基質(zhì)溶液。分別精確吸取各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液100 μL于2 mL空白基質(zhì)溶液中,氮?dú)獯蹈?以10%(v/v)乙腈水溶液定容至1 mL,即得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、50 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2樣品前處理

稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入2 mL水于旋渦混合器上充分混勻(若樣品含水量較高,可省略此步),加入4 mL 5%(v/v)甲酸乙腈溶液,置于超聲波清洗器中超聲20 min, 8 000 r/min離心5 min,上清液移至10 mL離心管中,殘?jiān)瓷鲜霾襟E重復(fù)提取1次。合并上述2次提取液,用水定容至10 mL,混勻后取2.5 mL過Captiva EMR-Lipid固相萃取柱,取2 mL凈化液在40 ℃下N2吹干。殘?jiān)?0%乙腈水溶液溶解并定容至1 mL后過0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液用于UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.3UPLC-MS/MS檢測(cè)條件

UPLC條件 色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,購自Waters公司);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流動(dòng)相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為色譜純乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%B; 1.0～5.5 min, 10%B～75%B; 5.5～5.7 min, 75%B～90%B; 5.7～6.5 min, 90%B; 6.5～6.7 min, 90%B～10%B; 6.7～8.0 min, 10%B。

質(zhì)譜參數(shù) 電噴霧電離(ESI),正/負(fù)離子自動(dòng)切換模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);氣簾氣(CUR)241 kPa,碰撞氣(CAD)621 kPa,離子源溫度(TEM)500 ℃,離子源氣壓(GS1, GS2)均為345 kPa,正/負(fù)離子噴霧電壓(IS)分別為5 500 V和-4 500 V,正/負(fù)離子碰撞室入口電壓(EP)分別為8 V和-10 V,碰撞室出口電壓(CXP)分別為15 V和-14 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在化合物優(yōu)化模式下,采用注射器直接進(jìn)樣,分別在正離子和負(fù)離子模式下對(duì)母離子和子離子進(jìn)行掃描,確定定量和定性離子對(duì),在MRM模式下對(duì)去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)、碰撞室入口電壓和碰撞室出口電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,表1列出了主要的優(yōu)化參數(shù)。50種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖如圖1所示,可以看出,50種分析物均在5.5 min內(nèi)被洗脫出來,達(dá)到了快速檢測(cè)的目的。

圖1 50種分析物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 50 compound mixed standard solution

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

根據(jù)所發(fā)布的食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn),食品中獸藥提取所使用的有機(jī)溶劑通常為甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。鑒于乙腈對(duì)大多數(shù)藥物的提取效果較好,且具有沉淀蛋白質(zhì)的能力,本工作選取乙腈為考察對(duì)象。另外,本工作所研究的獸藥大多為堿性化合物,在堿性條件下較易發(fā)生開環(huán)反應(yīng),因此本方法研究了50種分析物在酸性條件下的提取效果。以嬰幼兒米粉基質(zhì)為例,對(duì)比了乙腈中分別加入0.1%、0.5%、1%、5%甲酸時(shí)6大類獸藥的回收率(見表2)。結(jié)果顯示,隨著甲酸添加量增多,大部分化合物的回收率都顯著提升,特別是磺胺類藥物,當(dāng)甲酸濃度較低時(shí),回收率不足60%。當(dāng)甲酸濃度增加到5%時(shí),50種分析物的回收率均穩(wěn)定在70%～115%之間。綜合考慮,以5%(v/v)甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.2.2凈化方法的選擇

QuEChERS法[12,18,25]是目前使用最多的食品中多獸藥殘留檢測(cè)的樣品前處理方法,因其簡(jiǎn)單、快速高效而被大多數(shù)研究者青睞。本工作以嬰幼兒米粉基質(zhì)為例,對(duì)比了QuEChERS[12]和Captiva EMR-Lipid固相萃取柱的凈化效果。

表1 50種分析物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)

表2 不同酸性條件下6大類獸藥的回收率

圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用QuEChERS凈化,50種獸藥的回收率明顯偏低,回收率不到80%,部分藥物回收率還不足60%,可能是該法除雜效果不理想,基質(zhì)抑制效應(yīng)嚴(yán)重;也可能是吸附劑吸附了部分化合物,導(dǎo)致回收率偏低。而使用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱的效果更好,各種分析物的回收率均在70%～115%的范圍內(nèi)。

2.2.3基質(zhì)效應(yīng)(ME)

為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,基質(zhì)效應(yīng)是必須考察的一個(gè)重要因素。依據(jù)文獻(xiàn)[16,24], ME=[基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1]×100%,當(dāng)|ME|為0～20%時(shí),說明存在弱基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí),則存在中等基質(zhì)效應(yīng);若|ME|大于50%,表明存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。圖3列出了50種藥物在嬰幼兒米粉中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,喹諾酮類既有弱基質(zhì)抑制效應(yīng)又有弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),其中達(dá)氟沙星存在中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);磺胺類藥物大部分存在中等基質(zhì)抑制效應(yīng),少數(shù)存在弱基質(zhì)抑制效應(yīng);硝基咪唑類藥物存在弱基質(zhì)抑制效應(yīng);大環(huán)內(nèi)酯類和抗病毒類存在弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),氯霉素類除氟苯尼考胺有中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)外,其余表現(xiàn)為弱基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正,以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。

圖2 不同凈化方法下50種分析物的回收率Fig. 2 Recoveries of the 50 compounds using different purification methods

圖3 50種獸藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 3 Matrix effects of the 50 veterinary drugs

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

采用基質(zhì)匹配外標(biāo)校正的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)(Y)為各待測(cè)獸藥定量離子的色譜峰面積,橫坐標(biāo)(X)為相應(yīng)的質(zhì)量濃度(μg/L),結(jié)果列于表3。結(jié)果表明,在0.5～50 μg/L范圍內(nèi),50種藥物均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均不低于0.995。

本實(shí)驗(yàn)在陰性嬰幼兒輔助食品基質(zhì)中添加低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3.2節(jié)的方法處理后,采用1.3.3節(jié)的條件進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)各化合物的特征色譜峰的信噪比(S/N)=3和S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ),得到嬰幼兒輔助食品中50種獸藥的LOD為0.03～0.70 μg/kg,LOQ為0.09～2.33 μg/kg。50種藥物在嬰幼兒米粉基質(zhì)中的線性關(guān)系、LOD和LOQ見表3。

表3 50種獸藥的線性關(guān)系、LOD和LOQ

表3 (續(xù))

2.3.2回收率與精密度

以不含目標(biāo)化合物的嬰幼兒輔助食品(米粉、肉泥、魚泥)為基質(zhì),加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使目標(biāo)化合物在樣品中的含量分別為5和50 μg/kg,按1.3.2節(jié)方法處理,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,以相對(duì)應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果(見表4)表明,在高低兩個(gè)加標(biāo)水平下,各分析物在3種基質(zhì)中的平均回收率為64.37%～119.3%,方法的RSD小于15%,能夠滿足獸藥殘留分析的要求。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市面上購買的20份嬰幼兒輔助食品(米粉7份、肉泥7份、魚泥6份)進(jìn)行檢測(cè),其中3份肉泥和3份魚泥為從網(wǎng)上購買的進(jìn)口產(chǎn)品,其余產(chǎn)品均為國內(nèi)生產(chǎn)。

定量分析采用的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以成分相近的陰性樣品制備所得的空白基質(zhì)溶液來配制。雖然定量分析采用的相近基質(zhì)可能無法與待測(cè)樣品的基質(zhì)性質(zhì)完全匹配,但是樣品中獸藥殘留含量的測(cè)定結(jié)果也存在一定的參考意義。而且本方法檢出限較低,靈敏度高,采用成分相近的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量,不會(huì)造成假陽性或假陰性的結(jié)果。

檢測(cè)結(jié)果顯示,國內(nèi)生產(chǎn)的嬰幼兒輔助食品中未檢測(cè)出本方法中的50種獸藥殘留。然而,一個(gè)進(jìn)口的肉泥樣品中檢測(cè)出了磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶和替米考星,檢出值分別為8.2、10.3、15.8 μg/kg。由此可見,嬰幼兒輔助食品的獸藥殘留監(jiān)管應(yīng)得到更多的重視,尤其是針對(duì)進(jìn)口的嬰幼兒輔助食品。

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可行性,針對(duì)此肉泥檢出的獸藥,選擇適用范圍較合適的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè),其中,磺胺喹噁啉和磺胺二甲嘧啶采用農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-23-2008[26]方法測(cè)定,替米考星采用GB/T 20762-2006[27]方法測(cè)定。結(jié)果顯示,磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶和替米考星的檢出值分別為7.9、11.0、15.1 μg/kg,與本方法得到的結(jié)果基本一致,表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表4 50種獸藥在3種基質(zhì)中的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表4 (續(xù))

表4 (續(xù))

3 結(jié)論

本工作采用酸化乙腈超聲提取樣品,提取液經(jīng)脂質(zhì)增強(qiáng)型固相萃取柱凈化,然后經(jīng)超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀檢測(cè),建立了嬰幼兒輔助食品中50種獸藥殘留的檢測(cè)方法。該方法下50種獸藥均具有較低的檢出限和定量限,且回收率較高,重復(fù)性好。本方法前處理簡(jiǎn)單快速,沒有繁瑣的步驟,經(jīng)濟(jì)可靠,準(zhǔn)確度和靈敏度高,樣品量消耗少,適用于嬰幼兒輔助食品中多獸藥殘留的定性定量分析。