趙云鵬，張浩林，熊倩倩，李雨婷，王娟

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部，北京 100124

細胞自噬是細胞內循環(huán)和降解過程，從酵母到哺乳動物都高度保守，對能量代謝、脂質代謝、應激和發(fā)育具有重要作用［1］。其主要過程是將細胞質成分包裹入具有新月形膜結構的自噬隔離膜，自噬隔離膜經擴張和封閉形成閉合的雙層膜結構——自噬體，自噬體與溶酶體融合生成的自噬溶酶體致使內容物降解［2］。營養(yǎng)匱乏誘導的巨自噬通路對自噬體中的內容物沒有選擇性，線粒體自噬等選擇性自噬通路僅對進入自噬體的特定物質進行降解。細胞自噬對細胞質成分的降解、蛋白質聚集物的清除、受損細胞器的循環(huán)以及對抗細胞內病原體等過程至關重要［3］，自噬缺陷與許多人類疾病有關，包括傳染病、神經退行性疾病和癌癥等［4］。

來自酵母和其他真核生物的研究初步揭示了自噬相關蛋白在自噬過程中的重要作用［2］。自噬的發(fā)生需要一組專門的自噬相關蛋白ATGs（autophagy-related proteins）組裝成功能復合物，這些復合物被有序招募到自噬體形成位點進而調控自噬通路的不同步驟。自噬相關復合物包括：①ULK1/ATG1復 合 物（ULK1/ULK2、ATG13、FIP200、ATG101），這是一種自噬啟動所必需的絲氨酸/蘇氨酸激酶復合物［5］；②Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激 酶（PI3KC3）復 合 物（VPS34、P150、BECN1、ATG14），對隔離膜的成核至關重要［6］；③ATG9相關蛋白（ATG2、WIPI 1-4），它是唯一的跨膜核心ATG蛋白，作用于自噬體早期階段［7-8］；④ATG12泛 素 樣 系 統(tǒng)（ATG12、ATG5、ATG16L1、ATG7、ATG10）［9］；⑤LC3/ATG8泛素樣系統(tǒng)（LC3、ATG7、ATG3、ATG4、ATG12、ATG5、ATG16L1）［10］。后兩個泛素樣系統(tǒng)，它們在自噬膜結構延伸過程中發(fā)揮作用。大多數ATG蛋白在自噬體形成后會從自噬膜結構解離，但LC3/ATG8的酯化形式在所有階段都與自噬結構相關聯(lián)，因此，LC3/ATG8是自噬隔離膜和自噬體的重要標記物［11-13］。

自噬體的形成涉及多種膜來源［14］，源自內質網的COPII囊泡（coat protein complex II，COPII）是其中之一［15-17］。非饑餓條件下，COPII囊泡由ER的特殊區(qū)域內質網出口位點（ER exit sites，ERES）產生，主要功能是介導內質網向高爾基體的物質運輸［18］。在營養(yǎng)匱乏條件下，內質網向高爾基體的運輸途徑受到抑制［19-20］，ERES沿著內質網—高爾基中間室（ER-golgi intermediate compartment，ERGIC）擴大來幫助自噬體形成［21-23］。由ULK1激活的PI3KC3復合物促進COPII組分向ERGIC招募［24］，從ERGIC出芽的特異性COPII囊泡作為LC3酯化的前體，這是自噬體生物發(fā)生的關鍵步驟［22，25］。COPII衣被蛋白復合物是一種多亞基蛋白復合物，內層由SEC23-SEC24蛋白組成，外層由SEC13-SEC31組成，它能夠使高度彎曲的ER膜變形產生載貨運輸中間體［26］。釀酒酵母中SEC24在巨自噬通路中的重要作用已被報道［15］，但哺乳動物細胞中SEC24各亞型在自噬中的功能尚不清晰，本文明確了SEC24其中一個重要亞型SEC24A在巨自噬通路中的關鍵作用，鑒定了SEC24A的作用位點及與其互作的自噬相關蛋白，以期為揭示自噬相關的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系及細胞培養(yǎng)條件

HeLa細胞由中國科學院生物物理所惠贈，Hela細胞在添加了10 %胎牛血清（Gibco，16000-044）和1 %青霉素/鏈霉素溶液的DMEM（dulbecco's modified eagle medium，Gibco，SH30022.01B）中培養(yǎng)，復合培養(yǎng)基放置于37℃，5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱（Thermo，F(xiàn)orm Series 3）。

1.2 siRNA干擾

將細胞接種于24孔板中，當細胞密度在30%～50%時進行轉染實驗。將100μL opti-MEM（Thermo，31985-070）加入RNase-free離心管中，取40 pmol待轉染的siRNA（由吉瑪公司合成）和2μL siRNA-Mate（吉瑪，G04003），充分混勻后室溫靜置10 min，將混勻的試劑懸空滴加于相應孔中。siRNA序列如下，NC：Sense-5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，Antisense-5'-ACGUGACACGUU CGGAGAATT-3'；siSEC24A：Sense-5'-GAGUCAGU GAGCCAAGGAUTT-3'，Antisense-5'-AUCCUUGG CUCACUGACUCTT-3'。

1.3 Real-time PCR

參照RNA提取試劑盒（天根公司，DP430）說明書提取不同樣品的總RNA，利用反轉錄試劑盒（天根公司，KR106）獲得cDNA。qPCR反應體系為：7μL H2O，10μL Real-time PCR試劑（諾唯贊公司，Q712-02），正反向引物各1.5μL（擎科公司），1μL cDNA。引物序列如 下；siGAPDH：F-5'-TGCACCACCAACTGCTTA-

3'，R-5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'；siSEC24A：F-5'-GAATCCACCTCTGCCTACAAC-3'，R-5'-TGCCAATAAGCCACCTCC-3'。每組細胞檢測SEC24A、GAPDH兩個基因，且每次3個平行試驗。Realtime PCR運行程序為：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸32 s，共41個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達水平。

1.4 蛋白質Western blot分析

蛋白樣品和Marker加入8%或12%SDS聚丙烯酰胺凝膠孔中，分離膠80 V電泳30 min，濃縮膠120 V電泳70 min。使用甲醇激活的PVDF膜進行轉膜，100 V電泳73 min。使用5%的脫脂奶粉封閉2 h。加入不同一抗后4℃孵育過夜，加入TBST緩沖液洗脫3次，每次10 min。anti-ATG9A兔源（MBL，PD042），1∶1 000稀釋；anti-p62兔源（MBL，PM045），1∶1 000稀 釋；anti-LC3II兔 源（CST，2775），1∶1 000稀釋；anti-ACTIN兔源（索萊寶，K101527P），1∶1 000稀釋；anti-SEC24A兔源（CST，9678），1∶1 000稀釋。加入二抗室溫孵育1 h，兔二抗（Proteintech，SA00001-2）和鼠二抗（Proteintech，SA00001-1）均按1∶5 000比例稀釋，然后用TBST洗脫液洗3次，每次10 min。滴加顯影液后使用化學發(fā)光成像儀顯影，圖像通過Image J軟件進行灰度分析。

1.5 蛋白酶K保護實驗

NC組和SEC24A敲低組細胞分別使用EBSS（earle's balanced salt solution，索萊寶，H2040）饑餓處理2 h，用100 nmol·L-1洛霉素A1處理6 h后懸浮在冷凍的勻漿緩沖液（20 mmol·L-1HEPES pH7.4、0.22 mol·L-1甘露醇、0.07 mol·L-1蔗糖和蛋白酶抑制劑）中。然后利用1 mL注射器使細胞反復通過27號針頭20次以裂解細胞，4℃，4 500 r·min-1離心10 min后收集上清液（post-nuclearsupernatant，PNS）。然后將上清液再次以36 500 r·min-1離心30 min以獲得沉淀（pellet，P）部分。將沉淀重懸于勻漿緩沖液中，然后分別用含有和不含有0.5% TritonX-100的100 mg·mL-1蛋白酶K（ProK，索萊寶，P1120）處理。冰上孵育20 min后加入10%三氯乙酸（TCA，麥克林，T818878），所得樣品以12 638 r·min-1離心10 min。用冰冷的丙酮洗滌沉淀，重新懸浮在SDS-PAGE樣品緩沖液中，并在100℃下煮沸10 min。通過Western blot檢測蛋白酶K消化產物。

1.6 串聯(lián)熒光質粒轉染實驗

將細胞接種于24孔板中，當細胞密度在30%～50%時進行siRNA轉染實驗，當細胞密度在70%～80%時進行串聯(lián)熒光質粒RFP-GFP-LC3轉染實驗。準備兩個無菌離心管，一個加入50μL opti-MEM和2μL lipo2000（Thermo公司，11668019），另一個加入50μL opti-MEM和1μgRFP-GFP-LC3質粒。將稀釋的質粒加入稀釋的轉染試劑中混勻，室溫靜置15 min。向細胞培養(yǎng)板中加入新鮮的培養(yǎng)基，將100μL混勻的試劑懸空滴加。24 h后使用激光共聚焦掃描顯微鏡（Olympus，F(xiàn)V3000）觀察記錄熒光表達情況。

1.7 免疫熒光實驗

將細胞接種在放有細胞爬片的24孔板中，在siRNA轉染48 h后使用EBSS饑餓處理2 h，使用4%多聚甲醛固定20 min。在25℃下，細胞在10 mg·mL-1洋地黃皂苷（Sigma公司，11024-24-1）中透化15 min。在25℃下用5%山羊血清封閉60 min后，細胞中加入相應的一抗在4℃下孵育過夜。用PBS洗滌3次后，用FITC或羅丹明標記的二抗在室溫下將細胞染色1 h。細胞核用0.2%Hoechst33258染色30 min，使用激光共聚焦掃描顯微鏡拍攝。

1.8 免疫共沉淀實驗

收集EBSS饑餓處理2 h的HeLa細胞，用PBS洗2次后加入650μL裂解液（50 mmol·L-1Tris HCl pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，1%Triton X-100蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min。12 000 r·min-1，離心30 min，收集上清。取50μL細胞裂解液保存為整個細胞裂解液（Input），加入上樣緩沖液，煮沸10 min。分別取1μg ATG9A抗體（MBL，PD042）以及1μg IgG兔抗（Proteintech，B900610）加入含有20μL磁珠的100μL裂解液中，室溫孵育1 h，然后分別加入600μL細胞裂解，室溫滾柱孵育2 h。利用磁力架分離磁珠棄上清，沉淀用洗滌緩沖液（50 mmol·L-1Tris HCl pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.2%Triton X-100，蛋白酶抑制劑）洗滌3次，每次5 min。最后加入20μL上樣緩沖液，煮沸10 min，Western blot分析樣品。

1.9 統(tǒng)計分析

實驗獲得的數據使用GraphPad Prism軟件進行分析畫圖，統(tǒng)計均經過3次獨立實驗，采用t檢驗，描述性統(tǒng)計結果用平均值±標準差表示，ns代表P>0.05，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，P＜0.05即被認為其有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 SEC24A在巨自噬通路中的作用

為了確定SEC24A在巨自噬通路中的作用，利用siRNA干擾技術敲低SEC24A基因，siRNA轉染24 h后，換成EBSS培養(yǎng)基饑餓處理2 h，經Western blot和免疫熒光檢測SEC24A敲低細胞和對照細胞中自噬底物p62蛋白和自噬標記蛋白LC3的 蛋 白水 平，以確 定 自噬 通 量［13］。qPCR（圖1A）和Western blot（圖1B）顯示SEC24A已經被顯著敲低。SEC24A敲低細胞中p62蛋白水平顯著增加（圖1C，D），LC3-II蛋白水平顯著減少（圖1C，E），提示自噬通路受阻，表明SEC24A敲低會導致巨自噬活性降低。

隨后利用免疫熒光實驗驗證內源p62和LC3的表達情況，獲得了與Western blot一致的結果。EBSS饑餓處理2 h后，敲低SEC24A細胞中p62的表達量高于對照組細胞（圖1F，G），表明自噬通路被阻斷。在誘導自噬后，非酯化形式的LC3（LC3-I）與PE結合形成酯化形式的LC3-II，其與自噬膜結構結合并形成點狀結構。LC3免疫熒光顯示敲低SEC24A細胞中LC3成點的數量減少（圖1H，I），同樣證明饑餓條件下SEC24A敲低細胞中自噬活性降低，說明SEC24A在巨自噬通路中起重要作用。

圖1 SEC24A敲低后細胞內p62和LC3變化情況Fig.1 Changes of intracellular p62 and LC3 after SEC24A knockdown

2.2 SEC24A在自噬通路中的作用時期

為了確定SEC24A在自噬中的功能，我們通過RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光實驗檢測SEC24A敲低細胞中自噬體及自噬溶酶體的數量變化情況。由于綠色熒光蛋白GFP對酸性環(huán)境比較敏感，當GFP蛋白進入溶酶體的酸性環(huán)境時熒光信號會淬滅，因此，與溶酶體融合之前RFP-GFP-LC3修飾的隔離膜和未成熟的自噬體表現(xiàn)為黃色斑點，而紅色斑點則代表酸化的自噬溶酶體［27-28］。在NC組和SEC24A敲低組HeLa細胞中轉染RFP-GFPLC3串聯(lián)熒光質粒，熒光觀察發(fā)現(xiàn)，饑餓2 h后，SEC24A敲低的細胞中黃色斑點和紅色斑點均減少（圖2A，B），且SEC24A敲低后自噬隔離膜、自噬體、自噬溶酶體均顯著減少（圖2C，D），表明SEC24A敲低作用于自噬通路早期的自噬體形成階段。

圖2 敲低SEC24A后細胞中RFP-GFP-LC3熒光信號變化Fig.2 Changes in RFP-GFP-LC3 fluorescence signal in cells after knockdown of SEC24A

2.3 SEC24A在自噬體閉合過程中的作用時期

為了明確SEC24A在巨自噬通路中的作用位點，進一步通過蛋白酶K保護實驗研究SEC24A作用于自噬體閉合前還是閉合后，該實驗基于自噬體中隔離的p62和GFP-LC3對蛋白酶的敏感性［13］，當p62和GFP-LC3被封閉的自噬體包裹時，p62和GFP-LC3受自噬體保護不被蛋白酶K降解，而p62和GFP-LC3位于細胞質中不被自噬體包裹時則會被蛋白酶K降解。對照組和SEC24A敲低組HeLa細胞使用EBSS饑餓處理2 h，自噬阻斷劑洛霉素A1處理6 h，按照1.5中的方法進行蛋白酶K保護實驗，經Western blot檢測，當SEC24A被敲低后p62和GFP-LC3對蛋白酶K的敏感性增強，被保護的p62和GFP-LC3蛋白均顯著減少（圖3），表明SEC24A作用于自噬體閉合前。

圖3 敲低SEC24A的蛋白酶K保護實驗結果Fig.3 Proteinase K assay results after knockdown of SEC24A

2.4 SEC24A的作用位點

當自噬發(fā)生時ATG蛋白按層次順序被招募到自噬體形成位點，隨著自噬體的閉合，大多數ATG蛋白從自噬膜結構中分離。2.3中已經確定了SEC24A作用于自噬閉合前，為了進一步精確SEC24A的作用位點，通過免疫熒光實驗檢測了SEC24A敲低后多種ATG蛋白（包括ATG9A、ATG14L和ATG16L1）的點狀結構數量變化情況。如 圖4所 示，HeLa細 胞 中 敲 低SEC24A導 致ATG14L和ATG16L1點狀結構減少，而ATG9A點狀結構的數量相比對照組沒有明顯變化，表明SEC24A作用于ATG14L和ATG16L1上游。

圖4 敲低SEC24A后細胞內ATG9A、ATG14L和ATG16L1點狀結構數量變化Fig.4 Changes in the number of punctate structures of ATG9A,ATG14L and ATG16L1 in cells after SEC24A knockdown

2.5 SEC24A與ATG9A的相互作用

有文獻報道，在酵母細胞中SEC24與ATG9存在相互作用［15］，在哺乳動物細胞中存在酵母ATG9的兩種同源亞型ATG9A和ATG9B，ATG9A在所有組織中都有表達，而ATG9B在胎盤和垂體中富集［29-30］，因此本研究在哺乳動物細胞中利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）實驗驗證饑餓條件下哺乳動物細胞中SEC24A與ATG9A是否存在相互作用。收集EBSS饑餓處理2 h的細胞，使用非變性裂解液裂解細胞，利用磁珠免疫沉淀ATG9A，發(fā)現(xiàn)SEC24A與ATG9A共沉淀，且對照IgG處沒有條帶（圖5），說明饑餓條件下ATG9A與SEC24A存在體內相互作用。

圖5 ATG9A與SEC24A免疫共沉淀結果Fig.5 Co-immunoprecipitation results of ATG9A and SEC24A

3 討論

細胞自噬是一種將細胞質成分和細胞器運輸到溶酶體內并進行降解的過程，對于維持正?；驂毫ο碌募毎竟δ芫哂兄匾饔茫?］。當細胞處于饑餓狀態(tài)時自噬發(fā)生，自噬體的形成需要大量的細胞內膜重排［21，31-32］。內質網來源的COPII囊泡成為自噬體形成過程中膜的來源［15，33-34］，并且COPII囊泡關鍵衣被蛋白SEC24 C端的磷酸化是控制囊泡運輸與自噬轉換的開關［15］，目前哺乳動物細胞中COPII囊泡衣被蛋白SEC24各亞型在細胞自噬中的作用尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)在饑餓條件下，與對照細胞相比，SEC24A敲低細胞內自噬底物p62積累，且自噬標志蛋白LC3-II減少，表明SEC24A參與巨自噬通路，這與酵母中SEC24缺陷造成自噬受阻的結論一致［35］。此外，也有文獻證明了磷酸化的SEC23B通過與SEC24A和SEC24B相互作用促進自噬通量［33］。RFP-GFP-LC3串聯(lián)熒光實驗［28］顯示敲低SEC24A后自噬體及自噬溶酶體的數目均減少。蛋白酶K實驗顯示敲低SEC24A后被膜結構保護的p62和GFP-LC3均減少，提示SEC24A作用位點在自噬體閉合之前。敲低SEC24A導致ATG14L和ATG16L1點狀結構減少，表明SEC24A作用于ATG14L和ATG16L1上游。

免疫熒光實驗顯示SEC24A敲低細胞中，ATG9A點狀結構數量相比對照組沒有明顯變化。免疫共沉淀實驗結果顯示哺乳動物細胞中SEC24A與ATG9A存在相互作用，但與酵母相比，其相互作用較弱?？赡艿脑蛞皇墙湍负筒溉閯游锛毎蠥TG9囊泡與自噬膜結構結合的密切程度有區(qū)別，COPII囊泡作為自噬體膜來源之一［17，36-37］，與ATG9互作緊密程度可能會受到相應的影響。在酵母細胞中，自噬形成于自噬前體結構（pre-autophagosomal structure，PAS），ATG9在PAS處與ATG13［38］、ATG2和ATG18［39］等自噬相關蛋白相互作用，并且融入自噬體雙層膜的外膜［40］，使ATG9與自噬體緊密結合；而在哺乳動物細胞中，活細胞成像顯示ATG9囊泡在細胞質中動態(tài)移動，僅與部分自噬蛋白（如LC3和DFCP1）標記的陽性區(qū)域短暫接觸［41-42］，并不融入自噬體。因此，哺乳動物細胞中SEC24A與ATG9A的結合表現(xiàn)得不如酵母細胞緊密，可能與ATG9囊泡和自噬體處于動態(tài)結合相關。二是哺乳動物細胞中ATG9A在質膜修復等非自噬通路中也起重要作用［43］，這 些 通 路 沒 有SEC24A參 與，因 此 與SEC24A互作的ATG9A比例會相應降低。

本研究確定了SEC24A參與哺乳動物細胞巨自噬，并且解析了參與巨自噬通路的作用位點，為全面解讀COPII囊泡及其衣被蛋白在自噬中的重要作用提供了信息。在酵母細胞中，饑餓處理導致SEC24在自噬過程中被HRR25蛋白激酶磷酸化，且磷酸化的SEC24增加與ATG9之間的相互作用［15］，然而哺乳動物細胞中是否存在同樣的機制，以及哺乳細胞饑餓誘導自噬過程中激發(fā)SEC24A與ATG9A的相互作用機制，仍需要進一步探索。