一株解磷青霉菌在土壤中的定殖動態(tài)和解磷效果分析

許昌超，張俊濤，蘇 楊，冼卓慧

（廣州市林業(yè)和園林科學研究院，廣東 廣州 510405）

【研究意義】磷是植物生長的必需大量元素，土壤中有相當一部分的磷經(jīng)過土壤化學途徑被固定下來，無法被植物直接利用，限制了土壤磷素的有效性以及磷肥的肥效。在我國南方紅壤區(qū)，土壤磷元素已經(jīng)成為農(nóng)林生產(chǎn)過程中的重要限制性因子［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在一類微生物，可將土壤中被固定下來的磷轉(zhuǎn)化為有效磷，這類微生物被稱作解磷微生物，該發(fā)現(xiàn)為提升土壤有效磷含量開辟了新的途徑［3-4］。前期，從紅壤中篩選出一株可提高土壤有效磷含量的解磷菌株Penicillium brocae（咖啡果小蠹青霉菌），對小白菜（Brassica chinensisL.）和矮牽牛（Petunia hybrida）具有顯著的促生效果［5-6］。目前，國外已有解磷青霉菌進入商業(yè)化生產(chǎn)和應用，如以拜萊青霉菌為原料的解磷菌劑JumpStart?［7］。關于解磷菌的研究報道并不鮮見，主要集中在液體培養(yǎng)條件下的溶磷能力檢測和小分子有機酸分泌相關的溶磷機理闡釋，但要真正了解解磷菌在土壤環(huán)境中的作用效果，還需要加強其在土壤中定殖動態(tài)和解磷能力方面的研究，相關研究成果對推進解磷菌劑的實際應用具有積極意義。【前人研究進展】外源接種的解磷菌在土壤中能夠定殖是發(fā)揮解磷作用的前提，土壤中復雜的微生物環(huán)境給研究特定解磷菌在數(shù)量上的動態(tài)變化帶來困難［8］。張小蘭等［8］和Nacoon等［9］利用平板計數(shù)法研究了解磷菌株在無菌土壤環(huán)境中的定殖情況，并發(fā)現(xiàn)土壤定殖能力強的菌株在溶磷效果方面表現(xiàn)更好，該方法對評估解磷菌的應用潛力具有參考意義，但尚不能反映出實際應用過程中土壤環(huán)境微生物對解磷菌定殖的影響。也有研究人員利用非滅菌土壤開展了解磷菌定殖方面的研究，如龔明波等［10］利用解磷菌篩選平板研究了解磷青霉菌P.aculeatum在自然土壤中的定殖動態(tài)，該方法要求能夠準確判斷P.aculeatum與其他土壤解磷菌在形態(tài)上的差異，通用程度上存在一定的局限性；王向英等［11］通過質(zhì)粒將氨芐和四環(huán)素抗性基因?qū)氲絻芍杲饬准毦?，并利用含有相應抗生素的篩選平板對兩株解磷菌在自然土壤中的定殖動態(tài)進行了研究，并發(fā)現(xiàn)解磷菌定殖數(shù)量和解磷效果存在一定關聯(lián)。除平板計數(shù)法以外，Gómez-Mu?oz等［12］利用qPCR 對接種到土壤中的P.aculeatum群落豐度進行定量，qPCR 是目前常用的土壤微生物群落豐度定量分析技術(shù)，但是要精確定量某一種功能菌則還需要保證設計引物的高度特異性，且qPCR 用于土壤中微生物定量也存在一些異議，有研究人員認為利用qPCR 會將微生物殘體的DNA 也擴增出來，進而對研究土壤中微生物的消長動態(tài)變化造成干擾［13］。因此，平板計數(shù)法仍然是當前菌落計數(shù)最直觀和可靠的方法，該方法用于解磷菌定殖動態(tài)分析的關鍵在于如何提高平板的篩選特異性?！颈狙芯壳腥朦c】獲得具有篩選標記的P.brocea菌株，并利用篩選標記更為準確地對P.brocea在自然土壤中的存活數(shù)量進行計數(shù)，同時分析解磷菌定殖對土壤有效磷含量的影響?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬重點解決兩個問題，即如何排除土壤環(huán)境中的雜菌對解磷菌P.brocea計數(shù)的干擾以及外源接種到土壤中的P.brocea在數(shù)量上是如何消長變化的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 解磷菌P.brocae為本實驗室前期從土壤中篩選出來的解磷菌株，能夠提升鈣鎂磷肥肥效和土壤有效磷含量，并促進小白菜和矮牽牛植株生長［5-6］。同時，利用農(nóng)桿菌介導的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系將含有綠色熒光基因（gfp）、潮霉素抗性基因（hph）及β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）的T-DNA 片段插入到P.brocae基因組中，獲得大量轉(zhuǎn)化子并構(gòu)建了文庫［6］。P.brocae轉(zhuǎn)化子Z3 即挑選自文庫并用于本研究，與野生型菌株在表觀上無明顯差異。

1.1.2 培養(yǎng)基 解磷菌培養(yǎng)和生長量監(jiān)測采用馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基，解磷能力測定和群落計數(shù)采用Pikovskaya（PVK）培養(yǎng)基［5，14］。

1.1.3 供試土壤 解磷菌接種土壤采集自增城苗場苗木栽培地塊，為南方地區(qū)常見紅壤。土壤pH 值為4.90±0.04，有機質(zhì)含量為34.4(±0.5) g/kg，全氮含量1.22 (±0.04) g/kg，全磷含量1.06 (±0.02) g/kg，全鉀含量9.45 (±0.02) g/kg，水解氮含量120.6 (±0.2) mg/kg，有效磷含量10.4 (±0.1) mg/kg，速效鉀含量53.3 (±0.6) mg/kg。

1.1.4 主要試劑和儀器 潮霉素B（羅氏）和鏈霉素購自廣州研信生物，真菌DNA 提取試劑盒（Omega HP Fungal DNA Kit）購自廣州飛揚生物，Taq 酶和dNTP 購自天根生化科技（北京）有限公司，即用型GUS 染色液購自飛凈生物科技公司，利用Leica 熒光顯微鏡觀察菌體綠色熒光。

1.2 測定項目及方法

1.2.1gfp和hph基因片段檢測 利用試劑盒提取解磷菌P.brocae野生型及轉(zhuǎn)化子Z3 基因組，并以此為模版分別用引物gfpF/gfpR（5′-ACTGGAGTTGTCCCAATTCTTG-3′/ 5′-CATCCATGCCATGTGTAATCCC-3′）和hphF/hphR（5′-TACACAGCCATCGGTCCAGACG-3′/ 5′-CCGATTCCGGAAGTGCTTGACA-3′）擴增gfp和hph基因片段。擴增程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min（32 cycles）；72 ℃3 min；4 ℃ forever。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳后，觀察目的片段大小并切膠回收后送華大基因測序確認。

1.2.2 GUS 染色和熒光觀察 將GUS 染色液稀釋到工作濃度。用手術(shù)刀切取菌落邊緣帶有菌絲的固體培養(yǎng)基團塊，放入1.5 mL 離心管并添加0.5 mL GUS 染色液。搖床振蕩（往復140 r/min，37 ℃）30 min 左右即可觀察著色。用移液槍頭挑取少量液體條件下培養(yǎng)獲得的菌絲體，均勻涂布在載玻片上并利用熒光顯微鏡觀察（激發(fā)波長488 nm）綠色熒光。

1.2.3 解磷菌生長量和解磷能力測定 將解磷菌接種到PDA 平板上培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，收集孢子并稀釋至106CFU/mL。將50 mL PDB 培養(yǎng)基分裝到250 mL 錐形瓶中，并接種0.5 mL 上述孢子懸液（5 個重復）。將錐形瓶置于搖床培養(yǎng)（160 r/min，28 ℃），分別于培養(yǎng)后2、4、6、8、10 d 進行取樣，抽濾收集菌體，并在60 ℃條件下烘干至恒重。

另外，將1×106CFU/mL 解磷菌孢子懸液接種到PVK 液體培養(yǎng)基中（5 個重復），置于溫控搖床培養(yǎng)（160 r/min，28 ℃），分別于培養(yǎng)后2、4、6、8、10 d 進行取樣，用磷鉬藍比色法測定上清有效磷含量。

1.2.4 解磷菌在土壤中的定殖動態(tài) 于2021 年8 月在廣州市林業(yè)和園林科學研究院3 號實驗樓樓頂大棚內(nèi)開展解磷菌土壤接種試驗。將供試土壤充分均質(zhì)化后，向其中接種解磷菌孢子懸液至終濃度為1×106CFU/g 土壤，維持土壤濕度30%～50%（3 個重復）。每隔7 d 采集1 次土壤樣本，連續(xù)采集10 次。取1 g 土壤樣本，用無菌水按102～105梯度稀釋后涂布到PVK 固體平板上（含200 mg/L 潮霉素B 和100 mg/L 鏈霉素），28 ℃靜置培養(yǎng)至平板上出現(xiàn)菌落，統(tǒng)計產(chǎn)生溶磷圈的真菌菌落數(shù)量，對存疑的菌落進行GUS 染色或GFP 觀察確認，每個平板上的菌落計數(shù)在10～80 CFU 的為有效計數(shù)結(jié)果［10］。

1.2.5 土壤有效磷含量測定 對接種解磷菌的土壤有效磷含量進行動態(tài)監(jiān)測，每隔7 d 采集1 次土壤樣本，連續(xù)采集10 次。土壤經(jīng)風干研磨后，過孔徑2 mm 篩，用NaHCO3浸提法測定有效磷含量。

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表制作采用Microsoft Office Excel 2016 和SPSS 22.0 軟件，采用最小顯著性差異法（LSD）進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化子Z3 攜帶的分子標記檢測

圖1 為解磷菌P.brocae轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株Wt 在PVK 平板上生長7 d 后菌落形態(tài)，表觀上看轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株無太大差異（圖1A）。另外，轉(zhuǎn)化子Z3 可以在含有200 mg/L 潮霉素B 的PVK 平板上正常生長，而野生型菌株則無法產(chǎn)生菌落，說明轉(zhuǎn)化子Z3 具有潮霉素抗性，可以作為接下來菌株的篩選標記（圖1A）。通過PCR 從轉(zhuǎn)化子Z3 基因組上擴增出符合預期大小的hph和gfp基因片段，約分布在700 bp 左右，并通過片段測序驗證，表明轉(zhuǎn)化子Z3 中含有hph和gfp基因（圖1B）。最后，利用GUS 染色劑和熒光顯微鏡分別在轉(zhuǎn)化子Z3 菌絲上檢測到染料著色和綠色熒光，表明gfp和gus基因在轉(zhuǎn)化子Z3 中均可以正常表達（圖1C）。

圖1 轉(zhuǎn)化子Z3 及其攜帶的分子標記檢測Fig.1 Detection of transformant Z3 and its molecular markers

2.2 轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株的生長速率和解磷能力比較

為進一步論證轉(zhuǎn)化子Z3 可以用于解磷菌P.brocae在土壤中的定殖動態(tài)和解磷效果分析，對轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株的生長速率和溶磷能力進行比較。連續(xù)10 d 的菌絲體干質(zhì)量監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株具有趨勢相近的生長曲線，并且二者在各監(jiān)測時間節(jié)點上的菌絲體干質(zhì)量均無顯著差異，培養(yǎng)后10 d 轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株的菌絲體干質(zhì)量分別達到12.91 (±0.50)、12.76 (±0.17) mg/L（圖2）。另外，溶磷能力分析表明轉(zhuǎn)化子Z3和野生型菌株培養(yǎng)10 d 內(nèi)具有相近的溶磷曲線，二者的溶磷量亦無顯著差異，且轉(zhuǎn)化子Z3和野生型菌株在培養(yǎng)10 d 內(nèi)的溶磷峰值分別可達到392.82 (±5.11)、395.38 (±19.94) mg/L（圖3）。

圖2 轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株Wt 的生長曲線Fig.2 Growth curves of transformant Z3 and Wt

圖3 轉(zhuǎn)化子Z3 和野生型菌株Wt 的解磷曲線Fig.3 Phosphate solubilization curves of transformant Z3 and Wt

上述研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化操作對轉(zhuǎn)化子Z3的菌體生長速率和溶磷能力未產(chǎn)生顯著影響，可替代野生型菌株用于P.brocae在土壤中的定殖動態(tài)和解磷效果分析。

2.3 轉(zhuǎn)化子Z3 在土壤中的定殖動態(tài)和解磷效果

對轉(zhuǎn)化子Z3 在土壤中的菌落數(shù)量進行為期70 d 的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子Z3 接種后的前兩周土壤中存活的菌落數(shù)量呈下降趨勢，由預先接種的1×106CFU/g 土壤分別下降到接種后1 周的2.2×105CFU/g 土壤和接種后2 周的1×105CFU/g土壤（圖4）。接種后3 周土壤中轉(zhuǎn)化子Z3 的數(shù)量大幅提升并達到峰值（4.3×106CFU/g），接種后3 周到接種后7 周解磷菌在土壤中的定殖數(shù)量開始緩慢下降，并維持在1×105CFU/g 土壤數(shù)量級以上（圖4）。從接種后7 周開始，轉(zhuǎn)化子Z3 在土壤中的定殖數(shù)量開始快速下降，從接種后7 周的3.4×105CFU/g 土壤降至接種后10 周的1.4×103CFU/g 土壤（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)化子Z3 在土壤中的定殖數(shù)量和土壤有效磷含量曲線Fig.4 Colony number of transformant Z3 in soil and soil available phosphate content curve

同時，本研究對轉(zhuǎn)化子Z3 接種后土壤有效磷含量進行跟蹤研究。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，從接種后1 周開始土壤有效磷含量從10.6 mg/L 逐步提升，至接種后7 周達到峰值14.7 mg/L，土壤有效磷較本底值增加41.3%。接種7 周后土壤有效磷含量逐步下降，至接種后10 周降至12.7 mg/L，較土壤本底值有效磷含量仍高出22.1%（圖4）。

通過轉(zhuǎn)化子Z3 定殖數(shù)量變化曲線和土壤有效磷含量變化曲線的綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷含量上升階段，轉(zhuǎn)化子Z3 在土壤中的檢出數(shù)量均維持在1×105CFU/g 土壤數(shù)量級左右或以上，當土壤解磷菌數(shù)量呈下降趨勢并明顯低于1×105CFU/g 時，土壤有效磷含量也隨之降低（圖4）。

3 討論

隨著研究的深入，越來越多的高效解磷菌被篩選出來。劉春菊等［15］和李豆豆等［16］從土壤中獲得的解磷真菌在液體培養(yǎng)條件下對磷酸鈣的溶解量分別高達1 386.93、869.62 mg/L。另有報道，培養(yǎng)條件經(jīng)過優(yōu)化的解磷細菌在實驗室條件下對磷酸鈣的解磷能力也可達到424.14 mg/L［17］。然而，解磷菌施入到土壤環(huán)境后會因微生物間的拮抗、競爭作用或貧瘠的營養(yǎng)環(huán)境造成生長和解磷能力上的變化，往往達不到實驗室條件下的理想狀態(tài)［18］。因此，很有必要加強解磷菌在土壤中的定殖動態(tài)和解磷效果的研究，為實際生產(chǎn)應用提供參考［19］。

土壤中含有大量的雜菌，利用平板計數(shù)法對接種到土壤中的特定解磷菌進行定量時存在較多難點，一方面要盡量減少雜菌數(shù)量，另一方面要能準確甄別外觀形態(tài)上類似的雜菌。利用無菌土壤進行解磷菌定殖動態(tài)方面的研究雖然可以避免雜菌干擾，但無法反映出土壤原生微生物對菌株定殖的影響，研究表明菌株在滅菌土壤中的定殖數(shù)量和續(xù)存時間要顯著高于非滅菌土壤［11,20］。本研究利用鏈霉素和潮霉素增強了解磷菌PVK 篩選平板的特異性，鏈霉素可大大減少平板上細菌菌落的數(shù)量，潮霉素則可篩選掉大量解磷真菌。最后，利用轉(zhuǎn)化子Z3 攜帶的綠色熒光或GUS 活性對存疑的菌落進一步甄別，提高了平板計數(shù)的效率和準確性。Xian等［21］通過類似方法實現(xiàn)了對土壤中生防菌棘孢木霉的定量，李穎等［22］也通過利福平標記實現(xiàn)了植物促生細菌在土壤中的定殖情況分析。此外，許昌超等［6］還利用菌株攜帶的GUS 標記研究了該解磷菌在植物根部組織中的定殖情況。目前，通過T-DNA 插入或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方式將外源基因?qū)胨拗骶菍崿F(xiàn)宿主菌株分子標記的兩種便捷途徑，但二者各有優(yōu)缺點。相較后者，前者雖然更穩(wěn)定（不易隨著傳代次數(shù)增加而丟失），但容易造成宿主基因發(fā)生插入突變［23］。另外，在宿主菌中引入外源基因很容易導致宿主菌的生長和代謝狀態(tài)發(fā)生改變。因此，在利用這些方法時應確認相關操作不會對菌株的生長和相應功能產(chǎn)生顯著影響。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子Z3 在生長速率和解磷能力上與野生型菌株并無顯著差異，猜測T-DNA 的插入位點位于基因組的非編碼序列區(qū)域，未直接影響到基因的表達，在真核生物中非編碼區(qū)域的占比可能超過基因組的98%［24］。

總體來看，外源微生物接種到土壤后的定殖動態(tài)變化情況還受到菌株自身遺傳特性、土壤理化環(huán)境、土著微生物種類、地表植物類別及其根系分泌物情況等諸多因素影響，并且各因素之間的關聯(lián)較為復雜，制約了當前功能菌株在土壤中定殖機制的研究進展。

另外，本研究結(jié)果表明，接種到土壤環(huán)境中的解磷菌轉(zhuǎn)化子Z3 在數(shù)量上呈先下降、后上升和再下降的總體趨勢。菌種接種到土壤后數(shù)量上的先降后升，可能與菌株對土壤環(huán)境的適應性調(diào)整有關，在對一株生防木霉的土壤定殖動態(tài)研究過程中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象［25］。后期數(shù)量上的衰減則可能因種群數(shù)量擴大受到土著微生物的拮抗或相互間養(yǎng)分和空間的競爭有關。龔明波等［10］研究發(fā)現(xiàn)在30 ℃正常環(huán)境溫度下，解磷菌P.aculeatum定殖數(shù)量在接種到土壤后14 d 達到峰值，接種后49 d 基本消亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌轉(zhuǎn)化子Z3 接種后能提高土壤有效磷含量。在監(jiān)測時段內(nèi)，土壤有效磷呈先升后降的趨勢，即當解磷菌數(shù)量呈下降趨勢并明顯低于105CFU/g 土壤時，土壤有效磷含量也隨之降低。該現(xiàn)象表明，轉(zhuǎn)化子Z3 的定殖數(shù)量對維持解磷效果可能具有重要作用，土壤中被解磷菌釋放出來的有效磷可能會隨著解磷菌數(shù)量的衰減而被重新固定下來。因此，優(yōu)化解磷條件，提升解磷菌在土壤中的定殖數(shù)量以及定殖穩(wěn)定性是解磷菌劑開發(fā)和應用的重點研究方向［19,26］。

4 結(jié)論

本研究利用潮霉素抗性基因和GUS 基因等篩選標記的插入和表達，解決了從土壤環(huán)境中特異地分離和鑒定解磷菌P.brocae菌落的技術(shù)問題，并利用該技術(shù)研究解磷菌接種土壤后在數(shù)量上的動態(tài)變化過程。轉(zhuǎn)化子Z3 接種土壤后在數(shù)量上呈下降-上升-下降的總體趨勢，定殖數(shù)量在接種后10 周仍可維持在1.4×103CFU/g 土壤的水平，說明轉(zhuǎn)化子Z3 具有良好的土壤環(huán)境適應能力。轉(zhuǎn)化子Z3 接種可顯著提高有效磷含量，最高可較接種前提升41.3%（接種后7 周），至接種后10 周較初始土壤有效磷含量仍高出22.1%。最后，轉(zhuǎn)化子Z3 土壤定殖數(shù)量維持在105CFU/g 土壤的水平或以上時，土壤有效磷含量總體呈增加趨勢，且隨著后期解磷菌土壤定殖數(shù)量上的衰減，有效磷含量也呈下降趨勢，間接表明解磷菌在土壤中的解磷效果可能依賴解磷菌的定殖數(shù)量。