于 奇鄭冉張怡李波劉達(dá) 李宜平 焦麗麗

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春130117； 2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院， 吉林 長(zhǎng)春130117）

東北林蛙Rana dybowskiiGuenther 為蛙科林蛙屬兩棲動(dòng)物，俗稱(chēng)“哈士蟆”［1］，廣泛分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地區(qū)，主產(chǎn)于長(zhǎng)白山區(qū)域，是我國(guó)著名的藥食兩用藥材［2］。東北蛙皮中具有一定量的糖胺聚糖，在抗氧化［3］、抗凝血［4］、抗腫瘤［5］及免疫調(diào)節(jié)［6］方面呈現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。近年來(lái)，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)林蛙皮多糖的研究主要集中在提取、分離純化及抗氧化［7?9］活性等方面，但對(duì)其結(jié)構(gòu)特征仍不清楚?；诖?，本研究以東北林蛙皮為原料，采用水提醇沉法分離純化得到林蛙皮多糖DGP 和DGPA，初步分析兩者基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，并對(duì)其體外免疫活性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究該成分結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑、藥物與動(dòng)物 東北林蛙皮采自吉林省舒蘭市上營(yíng)森林經(jīng)營(yíng)局桃園林場(chǎng)（東經(jīng)127°25′36.18＂，北緯44°09′41.7＂，海拔338 m），經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)李宜平教授鑒定為東北林蛙Rana dybowskiiGuenther 的干燥皮膚。8～10周齡ICR 雄性小鼠，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2020?0001，在相對(duì)濕度40%～60%，溫度22～25 ℃的無(wú)菌動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。研究獲長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方針。SepharoseTMCL?6B 凝膠柱購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare 公司。標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖、單糖對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；脂多糖（LPS）、半刀豆蛋白（ConA）、青霉素、鏈霉素、二甲基亞砜、MTT 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、三氟乙酸、三氯甲烷、正丁醇、氨基磺酸、鹽酸、苯酚、硫酸等試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 Model 680 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad 公司；真空干燥箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫磁力攪拌器購(gòu)自杭州儀表電機(jī)有限公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；循環(huán)水式真空泵購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo 公司；UV?8000 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海元析儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司。

2 方法

2.1 多糖制備 林蛙皮經(jīng)水提［10］、醇沉后得粗多糖DGP，采用Sevage 法［7］脫蛋白后進(jìn)一步用Sepharose CL?6B 瓊脂糖凝膠柱層析，得純化后多糖DGPA。

2.2 多糖理化性質(zhì)分析 采用考馬斯亮藍(lán)法、間羥基聯(lián)苯法對(duì)DGP、DGPA 總蛋白及糖醛酸水平進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 多糖分子量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道，色譜條件為T(mén)SKgel G3000 PWXL 色譜柱（7.8 mm×30.0 cm，5 μm）；流動(dòng)相超純水；體積流量0.5 mL／min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。采用視差折射檢測(cè)器，用流動(dòng)相配制不同分子量對(duì)照品溶液，多糖配制為10 mg／mL 溶液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。

2.4 多糖傅里葉變換紅外光譜分析 2～3 mg 多糖與適量KBr 混合研細(xì)后壓片，在4 000～500 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

2.5 單糖組成分析 多糖經(jīng)三氟乙酸（TFA）水解后進(jìn)行PMP 衍生。參考文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道，色譜條件為C18Thermo hyperil ODS?2 色譜柱（4.6 mm×25 cm，5 μm）；流動(dòng)相17%乙腈?83% PBS；體積流量1 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

2.6 體外免疫活性檢測(cè)

2.6.1 多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的影響 小鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下解剖并取出脾臟，研磨制成脾細(xì)胞懸液，1 500 r／min離心5 min，棄上清，Tris?NH4Cl 低滲液裂解紅細(xì)胞，離心，D?Hanks 緩沖液洗滌，培養(yǎng)液將細(xì)胞密度稀釋至1×106／mL，制成單細(xì)胞懸液［12］，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，隨機(jī)分為空白 組、ConA 組（5 μg／mL ConA）、LPS 組（10 μg／mL LPS）、DGP 組（50、100、200、400 μg／mL 多糖溶 液）、DGPA 組（50、100、200、400 μg／mL 糖胺聚糖溶液）、陽(yáng)性對(duì)照組（5 μg／mL ConA或10 μg／mL LPS），培養(yǎng)液補(bǔ)至200 μL，混勻，重復(fù)3孔，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)44 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL 二甲基亞砜，于570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.6.2 多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的影響 小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉2 mL，3 d 后處死，10 mL D?Hanks 緩沖液清洗腹腔，收集液體，4 ℃離心后棄上清，1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106／mL，取100 μL 接種至96 孔板，在5% CO2、37 ℃下預(yù)孵3 h，PBS 清洗2～3次，除去貼壁細(xì)胞，制得純化巨噬細(xì)胞。

2.6.2.1 多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 將純化后的巨噬細(xì)胞加到待測(cè)糖樣（200 μL／孔）中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清，每孔加入100 μL 0.075%中性紅溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h，pH 7.4 PBS 洗去剩余中性紅后，加入100 μL 細(xì)胞裂解液，24 h 后采用酶標(biāo)儀于550 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

2.6.2.2 多糖對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞NO 水平的影響 配制6 個(gè)不同濃度的NaNO2溶液，分別加到96 孔板中，加入等體積Griess 試劑，10 min 后于540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。細(xì)胞以2×106／mL 密度接種至24 孔板，加入多糖培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清100 μL 加到另一培養(yǎng)板中，加入等體積Griess 試劑，10 min 后在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO 水平。

2.6.2.3 TNF?α 水平檢測(cè) 腹腔巨噬細(xì)胞與多糖一起培養(yǎng)，取上清液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清TNF?α水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖胺聚糖柱層析純化 圖1 顯示，DGP 過(guò)SepharoseTMCL?6B 柱后得到單一、對(duì)稱(chēng)的洗脫峰，收集相應(yīng)多糖洗脫液，即為糖胺聚糖DGPA。

圖1 糖胺聚糖DGPA SepharoseTMCL?6B 柱層析

3.2 多糖理化性質(zhì) DGP、DGPA 總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.93%、6.24%。采用間羥基聯(lián)苯法，以D?半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.010 7X＋0.059 2（R2＝0.998 3），DGP、DGPA糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.5%、18.6%。DGPA 經(jīng)高效凝膠滲透色譜法分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），標(biāo)準(zhǔn)分子量為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝－0.354 1X＋9.392 7（R2＝0.996 7），測(cè)得DGPA 分子量為141 kDa。

3.3 單糖組成 圖2～3 顯示，DGP、DGPA 單糖組成相同，均由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖組成，前者摩爾比為0.30∶2.05∶0.17∶1∶0.23，以葡萄糖醛酸、氨基半乳糖為主，表達(dá)為81.3%；后者摩爾比為0.41∶2.67∶0.16∶1∶0.25，以糖醛酸為主，表達(dá)為59.4%。

圖2 DGP 單糖HPLC 色譜圖

3.4 多糖紅外光譜分析 圖4 顯示，3 370.38 cm－1左右的吸收峰為糖類(lèi)?OH 的特征吸收峰，2 936.27 cm－1處的吸收峰為C?H 鍵強(qiáng)伸縮振動(dòng)，1 653.10、1 544.57 cm－1左右的吸收峰說(shuō)明有乙酰氨基（?NH2COCH3）存在，1 408.12 cm－1處的吸收峰為?COO－的特征吸收峰。綜上所述，?OH、?C?H鏈、?NH2COCH3、?COO 是糖的特征基團(tuán)，故DGPA 為糖胺聚糖。

圖3 DGPA 單糖HPLC 色譜圖

圖4 DGPA 紅外光譜圖

3.5 多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 圖5 顯示，與空白組比較，DGP 組、DGPA 組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），并均呈劑量依賴(lài)性；與DGP 組比較，DGPA 組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）。圖6～7 顯示，在50～400 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DGP組、DGPA 組協(xié)同ConA 作用小鼠脾淋巴細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖能力高于ConA 組（P＜0.01），表明兩者均能促進(jìn)誘導(dǎo)ConA 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴(lài)性，在400 μg／mL時(shí)作用最強(qiáng)，為空白組的3～4 倍；在50～100 μg／mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DGP 組、DGPA 組協(xié)同LPS作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖能力低于LPS 組（P＜0.05），表明兩者均能抑制LPS 誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞增殖；在200～400 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖能力高于LPS組（P＜0.01），表明兩者促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞增殖，并且在相同質(zhì)量濃度下DGPA 組作用更優(yōu)。

圖5 多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（，n＝10）

圖6 多糖對(duì)ConA 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（，n＝10）

3.6 多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 巨噬細(xì)胞的主要功能是吞噬病原體等異物［13］。圖8 顯示，與空白組比較，DGPA 組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴(lài)性；當(dāng)質(zhì)量濃度為400 μg／mL時(shí)，DGP 組、DGPA 組均能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，效果分別為空白組的1.25、2 倍。

圖7 多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響（，n＝10）

圖8 多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（，n＝10）

3.7 多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO 水平的影響 圖9 顯示，與空白組比較，DGPA 組小鼠巨噬細(xì)胞NO 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴(lài)性；當(dāng)質(zhì)量濃度為400 μg／mL時(shí)，DGP 組、DGPA 組均能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 的能力，效果分別為空白組的3、5 倍。

圖9 多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO 水平的影響（，n＝10）

3.8 多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TNF?α 水平的影響 圖10 顯示，在100～400 μg／mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DGPA 組能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF?α 能力（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴(lài)性；當(dāng)質(zhì)量濃度大于100 μg／mL時(shí)，DGPA組增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF?α 的能力大于DGP 組（P＜0.05）。

圖10 多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF?α 水平的影響（，n＝10）

4 討論

通過(guò)對(duì)分子量、單糖組成、特殊基團(tuán)的研究，確定了DGPA 為糖胺聚糖類(lèi)化合物。已有研究表明，糖胺聚糖類(lèi)化合物等具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，其功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［14］，楊潔［15］發(fā)現(xiàn)仿刺參糖胺聚糖能促進(jìn)DC 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IL?12、TNF?α 的分泌。多種糖胺聚糖，例如仿刺參糖胺聚糖［12］、菲律賓蛤仔糖胺聚糖［16］、珠貝母糖胺聚糖［17］、近江牡蠣糖胺聚糖［14］等均被證明具有顯著的有免疫活性。本研究發(fā)現(xiàn)，林蛙皮糖胺聚糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，且純化后的林蛙皮多糖DGPA 對(duì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活作用明顯優(yōu)于粗多糖DGP，而這2 種多糖的單糖組成存在一定差異，尤其是純化后多糖DGPA 的氨基半乳糖和葡萄糖醛酸的相對(duì)水平高于粗多糖DGP，而單糖組成是影響多糖活性的重要因素。因此，林蛙皮多糖DGPA 組與DGP 組的免疫活性差異可能與其單糖組成的差異有關(guān)，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。