張國華，呂思文，金振華，王麗坤，張 備，薛沾枚，張 艷，黃新育

（1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005 ；2. 齊齊哈爾市龍沙區(qū)農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì)，黑龍江齊齊哈爾 161000）

牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙VD-MD）主要特征為發(fā)熱、咳嗽、黏膜病變、消化道線性病變、白細(xì)胞減少、免疫抑制、持續(xù)感染等[1]；妊娠母牛感染該病還可能導(dǎo)致胎兒畸形、產(chǎn)死胎或流產(chǎn)等。BVD-MD 可引起免疫抑制及持續(xù)感染，導(dǎo)致防控難度相對較大[2]。BVD-MD呈世界性分布，尤其在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家分布更廣泛。20 世紀(jì)80 年代，我國首次報(bào)道了BVD-MD的感染情況，截至目前，我國多個(gè)地區(qū)已有該病的相關(guān)報(bào)道，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)牛業(yè)[3]。本文簡述了BVD-MD 的生物學(xué)特征、國內(nèi)外流行情況、臨床類型、診斷方式以及該病的防治方法，為BVD-MD的進(jìn)一步研究提供一定參考。

1 BVD-MD的生物學(xué)特征

BVD-MD 由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起[4]。BVDV 與豬瘟病毒（CSFV）、綿羊邊界病毒（BDV）同屬黃病毒科、瘟病毒屬[5]。BVDV具有包膜，為單股RNA病毒，分子大小約為12.4 kb，編碼的序列主要可分為3 部分：5'UTR、OFR 以及3'UTR[6]。5'UTR 長度約為380 bp，根據(jù)此序列可將BVDV 進(jìn)行基因分型，可分為BVDV1 型和BVDV2 型，其中BVDV1 型已被分為22 個(gè)基因亞型（1a～1v），BVDV2 型分為4 個(gè)基因亞型（4a～1d）[7]。OFR 區(qū)編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。3'UTR的長度約為230 bp 左右，其中包括對病毒復(fù)制具有重要作用的原件，具有較高的保守性。

BVDV 結(jié)構(gòu)近似球形，沉淀系數(shù)約80～90 S，直徑約40～60 nm[8]。BVDV對胰酶、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑具有相對較高的敏感性，酸性環(huán)境下極易失去活性，在堿性環(huán)境下具有一定的耐受能力[9]。BVDV 對于溫度敏感性高，在56 ℃環(huán)境下，30 min 即可失去活性。分離或者傳代的BVDV 在體外培養(yǎng)的難度不高，可在多種細(xì)胞中存活，目前應(yīng)用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室利用牛腎細(xì)胞（MDBK）進(jìn)行的病毒增殖。根據(jù)細(xì)胞接種BVDV病毒后是否會導(dǎo)致病變，又可分為CP 型和NCP 型兩種類型；一般情況下，CP 型與病毒的致病性無關(guān)，自然環(huán)境中NCP型的數(shù)量大于CP型，當(dāng)感染NCP 型病毒時(shí)可引起細(xì)胞發(fā)生核固縮、產(chǎn)生空泡、細(xì)胞溶解、死亡等[10]。

2 國內(nèi)外BVD-MD的流行情況

20 世紀(jì)60 年代，美國首次報(bào)道BVD-MD，之后加拿大、秘魯、法國、羅馬尼亞、英格蘭、澳大利亞也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病。20世紀(jì)90年代，一項(xiàng)血清學(xué)檢測的調(diào)查結(jié)果顯示，北美BVD-MD 的陽性率50%～80%，秘魯50%～90%，法國76%～95%，羅馬尼亞64%～90%，英格蘭62%～85%，澳大利亞89%～95%[11]。其中北美國家以BVDV1a和BVDV1b、2a型等基因型較為常見[12]，歐洲國家以BVDV1b 型較常見，大洋洲則以BVDV1c型較常見[13]。

20 世紀(jì)80 年代，我國分離到第一例BVDV，之后我國的多個(gè)省市自治區(qū)均有BVD-MD 的相關(guān)報(bào)道，逐漸引起了人們對BVDV-MD 的重視。2013 年，李棟梁等[14]對北京地區(qū)的BVD-MD 的發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，BVD-MD 高風(fēng)險(xiǎn)牛場為12 個(gè)。2015 年，譚春萍等[15]對廣西部分地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒流行情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示感染率為3.41%。2016 年，曲萍等[16]對西北地區(qū)BVD-MD流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，所調(diào)查區(qū)域內(nèi)群陽性率為84.38%,個(gè)體陽性率為61.88%。2017 年，Deng等[17]對我國19 個(gè)省的92 個(gè)奶牛場進(jìn)行了BVD-MD 流行情況的調(diào)查，并對5'UTR進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)存在8種不同亞基因型的BVDV-1，包括1a、1b、1c、1d、1m、1q以及暫定為未知亞基因型“BVDV-1v”和“BVDV-1w”。

2019年，郭啟勇等[18]等對寧夏地區(qū)的BVDV流行情況進(jìn)行檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗原陽性率達(dá)到2.71%，且抗體陽性率已超過85%。2021年，王晨豫等[19]對新疆部分規(guī)模奶牛場采集血清和耳組織樣本，并進(jìn)行BVDV 抗原檢測，結(jié)果顯示，血清抗原陽性率1.21%，耳組織檢測陽性率1.17%。我國許多省份均有BVDV感染的情況，需要采取足夠的重視以及相應(yīng)措施，改善目前的情況。

3 BVD-MD的臨床類型

3.1 持續(xù)感染

持續(xù)感染（PI）是BVD-MD 發(fā)生后出現(xiàn)的獨(dú)特臨床類型。NCP型BVDV可有效逃避宿主的免疫應(yīng)答而發(fā)生PI，即妊娠母牛若在妊娠早期感染該病毒，由于胎兒早期免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，無法識別NCP型BVDV并產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[20]，導(dǎo)致與健康牛相比，PI 牛發(fā)育遲緩且攜帶病毒；若PI 牛排出病毒將引起其他牛感染。一般情況下，PI牛在6月齡至2歲因感染黏膜病（MD）而死，未死亡的成年P(guān)I 牛繁殖的后代將一直攜帶BVDV[21]。因此，為控制BVD-MD傳播，養(yǎng)殖場應(yīng)做好PI牛的凈化工作。

3.2 免疫抑制

免疫抑制會在一定程度上損害機(jī)體的免疫能力，降低機(jī)體對其他疾病的抵抗能力。BVDV 引起宿主動物發(fā)生免疫抑制，主要通過改變免疫細(xì)胞功能、降低反應(yīng)能力、影響免疫細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的分布，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，增加了其他病菌侵入機(jī)體的情況，引起繼發(fā)感染[22]。

3.3 MD

MD是BVDV發(fā)生感染而引起的一種最嚴(yán)重的臨床類型，發(fā)病率、病死率高，犢牛以及亞成牛表現(xiàn)為腹瀉、脫水等癥狀。NCP 型BVDV 與CP型BVDV 的變化導(dǎo)致了MD較高的致死率。感染NCP 型BVDV 的妊娠母?？僧a(chǎn)出PI犢牛，PI 犢牛會對自身攜帶的NCP 型BVDV 產(chǎn)生免疫耐受，但再次感染到相同來源的CP 型BVDV 即可引起MD[23]；若感染不同來源的CP型BVDV將刺激動物的機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體抵制新入侵的病毒。因此，在部分PI動物體內(nèi)可檢測到BVDV抗體。

4 BVD-MD的診斷方式

4.1 病毒分離鑒定

病毒分離是病毒診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)動物疑似感染BVDV 時(shí)，將患病動物的組織器官進(jìn)行相應(yīng)的處理，接種于MDBK 中，經(jīng)過3～5 代盲傳后觀察是否出現(xiàn)病變，收集病毒。該方法是BVDV診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于細(xì)胞培養(yǎng)存在難度要求高、試驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)，故在診斷中應(yīng)用較少。

4.2 RT-PCR法

BVDV分為2個(gè)基因型，具有高度保守的5'UTR區(qū)域，以該區(qū)域?yàn)槟康钠卧O(shè)計(jì)引物，運(yùn)用RT-PCR法可以很好地對BVD 進(jìn)行診斷。2017 年，王吉等[24]設(shè)計(jì)的BVDV RT-PCR 檢測方法具有檢測速度快、特異性高、敏感性好等優(yōu)點(diǎn)，檢測BVDV1 型和BVDV2 型DNA 模板濃度低至8.87×102和6.31×102copies/μL。2018 年，李佳暖等[25]建立的BVD 高效納米PCR 檢測方法具有更優(yōu)秀的敏感性，其最小檢出BVDV量為15.2×10-4mg/L。

4.3 熒光定量PCR法

目前，熒光定量PCR 法主要包括SYBR GREEN 法和TapMan探針法，與PCR法相比，具有更好的特異性及靈敏度。2018 年，王艷杰等[26]建立了雙重TapMan 探針法檢測BVDV，Ⅰ型BVDV 檢 測 下 限 為10.0 copies/μL，Ⅱ型BVDV檢測下限為100 copies/μL。2019年，任亞初等[27]建立SYBR GREEN 法檢測BVDV，檢測下限為4.87×10 copies/μL。2021 年，張康等[28]建立了TapMan 探針法檢測BVDV，檢測下限為5.0 copies/μL。熒光定量PCR 法檢測BVDV 具有很多優(yōu)點(diǎn)，對BVD 的早期診斷具有極高的臨床意義。

4.4 ELISA法

ELISA法非常適合大量的BVDV血清樣本的檢測，且目前技術(shù)已經(jīng)相對成熟。2016 年，常敬偉等[29]建立的BVDV 抗體間接ELISA 方法通過表達(dá)E2 蛋白，包被純化的蛋白；結(jié)果顯示，與愛德士間接ELISA BVDV 試劑盒相比，此檢測方法的符合率為91.5%，與其他呼吸道綜合征候群的疾病無交叉反應(yīng)，可進(jìn)行大批量樣本的抗體監(jiān)測以及流行病學(xué)調(diào)查。

4.5 間接免疫熒光

PCR法、熒光定量PCR法等方法主要檢測基因水平的物質(zhì)，無法確定病毒的感染性。2017 年，黃杰等[30]建立了BVDV間接免疫熒光檢測法，以山羊抗牛BVDV抗體作為一抗，熒光素FITC標(biāo)記的兔抗羊免疫球蛋白G（IgG）作為二抗，可以更好地檢測BVDV病毒顆粒。上述間接免疫熒光檢測法可檢測疫苗中是否存在BVDV污染，并且可應(yīng)用于BVDV的定位以及感染情況的研究。

4.6 RT-LAMP法

RT-LAMP 即逆轉(zhuǎn)錄和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification）的結(jié)合，可應(yīng)用于快速擴(kuò)增RNA。此技術(shù)的特異性、靈敏度、檢測范圍優(yōu)于RTPCR 法，同時(shí)還具有操作簡單、無須專業(yè)設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)。2022 年，張宇名等[31]建立了可視化一步RT-LAMP 檢測BVDV的方法，參照GENBANK上BVDV的5'UTR數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了兩組引物，結(jié)果顯示，最低檢測下限為0.021 ng/L，且檢測結(jié)果與商品化ELISA試劑盒相比，符合率為100%，具有良好的特異性、靈敏性，適用于臨床診斷。

5 BVD-MD的預(yù)防與治療

BVD-MD 存在較廣泛，致病機(jī)制復(fù)雜，歐美國家防控BVD-MD 的主要措施為撲殺PI 動物、疫苗接種及加強(qiáng)監(jiān)測。我國目前對該病的防治主要為注射疫苗，但也有部分地區(qū)尚未實(shí)行凈化。

5.1 預(yù)防

目前對BVD-MD等傳染性疾病仍采取預(yù)防為主的方針，在發(fā)生疾病前即采取良好的預(yù)防措施，保證養(yǎng)殖戶、養(yǎng)殖場能夠更安全地進(jìn)行生產(chǎn)活動[30]。應(yīng)重視BVD-MD疫苗注射，保證疫苗的質(zhì)量以及正確的使用方法，達(dá)到最佳的預(yù)防效果，并定期進(jìn)行BVDV 抗體監(jiān)測。為切斷傳染源，應(yīng)對PI牛進(jìn)行抗體檢測，首次檢測后對PI牛進(jìn)行隔離，21 d后若仍檢測為陽性即進(jìn)行淘汰。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保證飼料營養(yǎng)均衡；飼養(yǎng)環(huán)境干燥且具有較好的通風(fēng)性，提高動物的抵抗力，更好地防控BVD-MD[32]。

5.2 治療

目前尚無針對BVD-MD 的特效藥，故治療BVD-MD仍主要在日常飼養(yǎng)管理、疾病預(yù)防等方面加強(qiáng)牛的抵抗力。若發(fā)生了BVD-MD 疫情，需要迅速隔離患病牛并進(jìn)行徹底的消毒，患病牛進(jìn)行對癥治療、補(bǔ)充體液，降低由于抵抗力下降而繼發(fā)感染其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)[33]。圈舍以及飼養(yǎng)用具采用漂白粉進(jìn)行消毒，出現(xiàn)口腔潰瘍癥狀的患病牛采用高錳酸鉀進(jìn)行消毒處理。此外，也可結(jié)合中醫(yī)療法對患病牛進(jìn)行治療[34]。

6 結(jié)論

BVDV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因具有多個(gè)亞型，變異性大，防控難度大。隨著我國畜牧業(yè)不斷發(fā)展，牛的進(jìn)出口愈發(fā)頻繁，促進(jìn)了我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展，但同時(shí)也對BVD-MD的檢測和預(yù)防產(chǎn)生了更大的挑戰(zhàn)。應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理及防疫，以科學(xué)的方法進(jìn)行臨床診斷，預(yù)防BVD-MD發(fā)生。