程 旭，范建華，高明燕，俞 燕，張 瑩，姜 逸，賈學(xué)波

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚州 225125）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的高度接觸性的傳染病。IBV 主要攻擊呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)，可引起呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋質(zhì)量下降，并具有高病死率，特別是雛雞感染后易誘發(fā)細菌或病毒繼發(fā)感染，混合感染后可導(dǎo)致病死率上升[1-2]。目前世界范圍內(nèi)流行多種IBV血清型，大多數(shù)國家經(jīng)典型和變異型IBV血清型共存，導(dǎo)致IB防控成為一項全球性挑戰(zhàn)。

IB現(xiàn)有防控措施主要是疫苗接種，但在自然選擇和免疫壓力下，新的IBV 血清型不斷出現(xiàn)，目前已有超過50 種血清型，且各血清型之間交叉保護性較差，部分甚至沒有保護[3]。同時由于新的血清型在外部環(huán)境中可能成為主要流行毒株，現(xiàn)有的疫苗株將逐漸被取代，故有必要研究開發(fā)新型疫苗[4]。本文對國內(nèi)外現(xiàn)有的IB 疫苗應(yīng)用情況及新型疫苗的研究進展進行綜述，以期為今后IB疫苗的研發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 弱毒疫苗

IB弱毒疫苗一般是將野生毒株通過雞胚傳代，減弱病毒毒力而獲得，生產(chǎn)成本低且使用方便。IB弱毒疫苗可激發(fā)體液免疫和細胞免疫，是雛雞初次免疫的最佳疫苗。減毒活疫苗接種后的免疫持續(xù)時間較短，接種后2～3周需要使用相同或其他毒株的組合進行強化免疫。

目前世界上應(yīng)用最廣泛的是H120 活疫苗，但該呼吸型疫苗現(xiàn)已無法對IBV 流行株提供足夠保護率。由于IBV存在地區(qū)差異性，應(yīng)選擇與本地區(qū)流行毒株基因型一致的弱毒疫苗株，提供有效的針對性保護，還可降低弱毒苗導(dǎo)致基因重組的風(fēng)險，如美國經(jīng)常使用M41、H120以及阿肯色州、特拉華州、佛羅里達州和JMK衍生的疫苗；澳大利亞使用B株和C株；英國選擇的疫苗株包括M41、4/91和CR88；荷蘭使用D274和D1466進行疫苗接種。

國內(nèi)現(xiàn)有的弱毒疫苗毒株包括H120、H52、M41、W93、Ma5、LDT3，上述疫苗均為Mass血清型，針對呼吸型IBV；此外還有QX 株、4/91 株等非Mass 型疫苗。李玉杰等[5]通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，QX型是我國目前主要流行的基因型。2011年獲批的LDT3-A與國內(nèi)流行的QX株關(guān)系最為接近，2017年獲批的NNA株為4/91型疫苗，2018年獲批的QX87株為國內(nèi)首個QX型活疫苗[6]。雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（LaSota株+QX87株）由流行QX株傳代致弱獲得，是國內(nèi)唯一上市的QX型活疫苗，可獲得良好的臨床保護效果[7]。

2 滅活疫苗

IB 滅活疫苗是將IBV 滅活后加入免疫佐劑制備的油乳劑苗，滅活疫苗可單獨使用，也可與IBV 減毒活疫苗結(jié)合使用。IBV 滅活苗一般與新城疫、禽流感組成多聯(lián)苗，適用于3月齡以上的雞及種雞的免疫。與弱毒苗相比，滅活疫苗可有效激發(fā)體液免疫，但免疫劑量較大，抗體應(yīng)答時間較長[8]。因此，在大多數(shù)情況下，滅活疫苗需要使用弱毒疫苗作初次免疫或多次接種。Ahmad 等[9]對1 日齡的SPF雛雞接種H120減毒活疫苗，并在3周后接種M41滅活疫苗；第二次接種后2 周，采用愛德士（IDEXX）抗體檢測試劑盒檢測，結(jié)果顯示，弱毒苗加滅活苗組抗體水平顯著高于單獨使用H120弱毒苗組。

滅活苗免疫效果與免疫佐劑也具有一定的關(guān)系。Priscila 等[10]比較了殼聚糖納米顆粒與油佐劑制備IBV 滅活苗后的免疫效果，結(jié)果顯示，采用殼聚糖納米顆粒作為疫苗載體佐劑制備的IBV滅活疫苗，在單次免疫雞后可激發(fā)更高水平的免疫球蛋白A（IgA）抗體，并具有更高的記憶表達水平；免疫弱毒疫苗后，采用殼聚糖納米顆粒滅活疫苗加強免疫，可表現(xiàn)出更高的抗體水平和更高的CMI相關(guān)基因表達。

3 基因工程苗

3.1 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是采用一種病毒的免疫基因整合到另一種病毒基因DNA的片段中構(gòu)成重組活載體疫苗。接種動物體內(nèi)后，整合的免疫基因可進行有效表達。常見的載體病毒主要包括腺病毒、新城疫病毒、禽痘病毒、皰疹病毒等。Wang等[11]采用雞痘病毒表達IBV的S1基因構(gòu)建了重組疫苗RFPV-S1，結(jié)果顯示，接種該疫苗的免疫雞能夠產(chǎn)生IBV 特異性抗體；攻毒試驗結(jié)果表明，該重組疫苗能夠有效降低病毒組織載量，緩解氣管組織病變。田占成等[12]研究發(fā)現(xiàn)，采用雞痘病毒重組表達IBV S1基因能夠產(chǎn)生中和抗體，攻毒后能夠提供部分保護，有效降低病理損傷并縮短排毒時間。

NDV是一種合適的病毒載體，廣泛應(yīng)用于動物傳染病疫苗的研發(fā)[13-14]。Abozeid等[15]將埃及IBV流行株的S1基因在NDV上重組表達，攻毒保護試驗結(jié)果顯示，該重組疫苗可對雞群提供有效保護。Tan等[16]使用反向遺傳系統(tǒng)表達了IBV S1 多表位盒，成功構(gòu)建了重組LaSota 候選疫苗株rNDV-IBV-T/B，并將該疫苗株接種于1日齡SPF雛雞；結(jié)果顯示，3周齡時，該疫苗對IBV強毒M41的保護率達到90%，纖毛穩(wěn)定性得分為4.2，顯著高于對照組，表明該重組疫苗有效降低了IBV 對氣管的致病性；RT-PCR 分析顯示，疫苗組氣管內(nèi)病毒載量較低。

Tan等[17]將IBV的多表位盒（S-T/B）與NDV LaSota株重組成耐熱候選活疫苗rLS-T-HN-T/B，將該重組苗免疫1 日齡雛雞，3 周后進行攻擊試驗；結(jié)果表明，與對照組相比，疫苗組IBV保護率為90%。Zhao等[18]采用LX4型IBV的S1基因構(gòu)建了重組LaSota株（rLaSota-S1），通過間接免疫熒光法和Western Blot 發(fā)現(xiàn)S1蛋白能夠有效表達；疫苗接種結(jié)果顯示，接種rLaSota-S1可誘導(dǎo)IBV特異性免疫球蛋白G（IgG）抗體，但單次疫苗接種提供了部分保護，加強免疫后具有更好的保護效力。

3.2 亞單位疫苗

病毒的保護性抗原基因與質(zhì)?；虿《据d體重組后在受體中高效表達，提純的表達產(chǎn)物加入佐劑制成的疫苗即為亞單位疫苗。亞單位疫苗來自病原體蛋白質(zhì)或多糖，不含核酸，無致病性，安全性極高。其中多表位疫苗能夠同時保護兩種或多種病原的感染，具有免疫原性好、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。因此，開發(fā)多表位IBV疫苗對于同時預(yù)防多種亞型IBV具有重要的生產(chǎn)意義。

IBV的主要抗原表位在S1蛋白上，N蛋白上也存在部分中和抗原表位。蘇艷靜等[19]采用昆蟲桿狀表達系統(tǒng)表達IBV S1蛋白，表達后的S1蛋白1 mg與弗氏完全佐劑乳化后皮下注射，2周后加強免疫3次，每次間隔1周，免疫劑量減半，最后一次免疫后10 d采血分離血清；結(jié)果顯示，新西蘭大白兔免疫后產(chǎn)生的特異性抗體反應(yīng)性良好，表明S1蛋白免疫原性良好。陽泰等[20]以IBV SAIBK 株全基因組序列，對結(jié)構(gòu)蛋白S1、S2、N、M進行二級結(jié)構(gòu)分析；抗原表位預(yù)測結(jié)果表明，S1 和N 結(jié)構(gòu)蛋白具有較好的親水性，N結(jié)構(gòu)蛋白抗原指數(shù)最高，能夠激發(fā)CTL 反應(yīng)。Yang 等[21]將免疫原性肽融合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因（GST）的3'末端，并于大腸桿菌中表達；經(jīng)ELISA和Western Blot分析表明，純化的融合蛋白與雞抗IBV 血清具有良好的反應(yīng)活性；在疫苗接種過程中，候選肽疫苗誘導(dǎo)了強烈的體液和細胞反應(yīng)，并提供了80% 的免疫保護，而陰性對照組的雞均表現(xiàn)典型癥狀并出現(xiàn)死亡情況。

雖然S1 蛋白免疫原性良好，但S1 蛋白抗原性對空間結(jié)構(gòu)的依賴程度較大，表達系統(tǒng)對蛋白的修飾可能會削弱亞單位疫苗的免疫保護作用，而N蛋白的保守型及高抗原指數(shù)提示可成為疫苗研發(fā)的備選方案。

4 核酸疫苗

核酸疫苗也稱基因疫苗，是將病原體的DNA 或RNA直接注入動物機體，使動物機體產(chǎn)生針對性抗原，并對該抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而獲得免疫保護。由于核酸疫苗存在誘發(fā)腫瘤以及異常自身免疫的危險，故迄今為止，市場上尚無獲得許可的家禽DNA 疫苗。然而，該技術(shù)已得到了許多關(guān)注，已有幾種產(chǎn)品處于不同的開發(fā)或試驗階段。

Yan 等[22]采用IBV 強毒株SX16 的S1、N 和M 蛋白構(gòu)建 了 質(zhì) 粒pVAX1-16S1、pVAX1-16N、pVAX1-16M、pVAX1-16S1/M/N，對雞進行單價免疫和多價免疫，結(jié)果顯示，pVAX1-16S1/M/N免疫雞的抗體滴度明顯高于單價組，同時對攻毒保護率高達90%。Tian 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，將S1、S2和N通過脂質(zhì)體包裹形成多表位DNA疫苗，肌肉注射至7 日齡雞體內(nèi)，2 周后加強免疫，可有效激發(fā)細胞免疫，增加CD4+、CD3+和CD8+、CD3+細胞數(shù)量；加強免疫后5周采用強毒IBV攻擊，免疫雞獲得80%的保護率。

劉芳等[24]將S1 基因的T 細胞抗原表位盒、Australia T株和M41 株S1 基因的B 細胞抗原表位，定向克隆入真核表達載體pVAX1，構(gòu)建成5個真核表達質(zhì)粒：pVAX-S1T+M41、pVAXS1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1BM41、pVAX-S1T+S1B-T；質(zhì)粒溶液通過腿部肌肉注射7日齡SPF雛雞，28日齡時加強免疫1次，二免后10 d采用IBV 病毒液攻毒測定保護率；結(jié)果顯示，二免后10 d，各免疫組抗體達到最高，4個質(zhì)粒組與PBS組相比差異顯著；攻毒結(jié)果表明，pVAX-S1、pVAX-S1B-T 組的保護率均為75%，表明表位抗原成分能夠有效發(fā)揮保護效力。

5 病毒顆粒樣疫苗

病毒樣顆粒（VLPs）由病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，不含病毒核酸，在結(jié)構(gòu)上和天然病毒相似，具有很強的免疫原性。VLPs 無法在體內(nèi)復(fù)制，因而具有很高的安全性，是研制安全高效IBV候選疫苗的方向。

劉根梅等[25]將IBV 的M、S 蛋白與重組桿狀病毒大量感染昆蟲細胞，通過濃縮純化后獲得VLPs；VLPs頸部皮下注射SPF雞，10 d首免，14 d二免，結(jié)果顯示，該顆粒樣疫苗產(chǎn)生的免疫水平與IBV滅活苗免疫效果相當。Zhang等[26]構(gòu)建了攜帶IBV S、M、E蛋白的SME-VLPs，SME-VLPs誘導(dǎo)的中和抗體與滅活疫苗誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答相當，高于市售活疫苗H120誘導(dǎo)的中和抗體；同時SME VLPs能夠誘導(dǎo)細胞、體液及黏膜免疫應(yīng)答，使CD4+和CD8+T淋巴細胞水平增高，也能夠誘導(dǎo)更高水平的白細胞介素-4（IL-4）和γ干擾素（IFN-γ）。

6 反向遺傳基因疫苗

反向基因疫苗是借助反向遺傳操作技術(shù)對病毒進行人工改造后制備的疫苗。反向遺傳技術(shù)可對所分離的流行毒株進行基因定點改造和修飾，使其能夠滿足作為疫苗候選株的條件，保證其與流行毒株具有很好的抗原匹配性，并具有穩(wěn)定的遺傳特性。

Armesto 等[27]采用致病性M41 和歐洲4/91 株S1 基 因替換無致病性Beau IBV 株的抗原S1 糖蛋白，構(gòu)建了重組BeauR IBV 疫苗，使重組病毒獲得了保護性免疫且不具有致病性。Zhou等[28]構(gòu)建了重組改造的H120（R-H120），在雞胚中經(jīng)過5 次傳代后拯救，結(jié)果顯示，與完整的H120 疫苗接種組相比，使用該疫苗可誘導(dǎo)高水平的血凝抑制抗體滴度，具有更高的保護率。周生等[29]構(gòu)建了以H120 疫苗株為骨架，流行毒株IBYZ 株S 基因替換構(gòu)建了全長cDNA，并借助反向遺傳操作技術(shù)拯救病毒，成功獲得重組H120-ΔS/IBYZ株；經(jīng)試驗，該毒株具有良好的遺傳穩(wěn)定性和免疫原性，以重組病毒免疫SPF 雞后，對同型毒株保護率可達100%。

Jiang 等[30]以H120 疫苗株為骨架，利用反向遺傳系統(tǒng)將致病株ck/CH/IBYZ/2011的S1基因進行替換，構(gòu)建了重組株rH120-S1/YZ。雞胚矮小化、生長動力學(xué)和雞胚病毒滴定的結(jié)果表明，重組病毒的生物學(xué)特性保持不變。將重組病毒接種于SPF雛雞，結(jié)果顯示，與rIBYZ感染組相比，接種rH120-S1/YZ的雛雞未出現(xiàn)臨床癥狀或死亡情況，肺部或腎臟未觀察到病變；且組織、泄殖腔和口腔拭子中的病毒載量較低，表明rH120-S1/YZ毒株在雛雞中安全性很高。疫苗保護評估顯示，rH120-S1/YZ 具有更好的保護性，接種的雛雞存活率為100%，且未觀察到任何疾病癥狀或嚴重損傷。

反向遺傳技術(shù)不僅可以純化毒株，也能夠從全基因組上對病毒進行改造，保留免疫相關(guān)基因，甚至剔除毒力相關(guān)基因，消除病毒毒性反強的危險，可快速研發(fā)針對流行毒株的疫苗，提升疫苗的純度及免疫針對性。

7 結(jié)論

IB目前是繼禽流感、新城疫后影響?zhàn)B雞業(yè)最重要的病毒性傳染病，對于該病的防控主要依靠疫苗接種、環(huán)境消毒、提升飼養(yǎng)管理水平等綜合措施。IBV由于套式轉(zhuǎn)錄方式和RNA酶無校正能力，病毒基因組存在高變異性，導(dǎo)致出現(xiàn)的基因型較多，毒力差異和組織嗜性也存在差異。目前使用的弱毒苗加滅活苗方式已無法提供足夠保護，存在一定的缺陷。弱毒苗由于致弱效果難以控制，可能存在毒力返強的情況，具有一定的致病性和傳播力，且存在毒株的變異及與野毒株的重組危險，故弱毒疫苗的選擇和使用需格外謹慎。滅活苗安全性高，但存在制備成本高、免疫劑量大、無法誘導(dǎo)細胞免疫、免疫效果不理想等缺陷。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，疫苗的研究已不局限于傳統(tǒng)方式，出現(xiàn)了許多基于基因組改造和表達的基因工程疫苗。基因工程疫苗可通過多基因表達提供多種抗原，產(chǎn)生針對多種血清型毒株的細胞和體液免疫應(yīng)答。隨著對IBV免疫機制及免疫相關(guān)蛋白研究的逐步深入，最大限度地表達和組合免疫蛋白，誘導(dǎo)高水平的細胞和體液免疫，應(yīng)成為未來的IB疫苗的研究重點。