基于氣質(zhì)聯(lián)用法研究黃瑞香種子的化學成分

朱高，陳葉，杜濤非，閆芳，張春云，王海平，王建東，王家強，王恩軍

（1.河西學院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學院，甘肅 張掖 734000；2.肅南明海林場，甘肅 張掖 734000；3.甘肅泰康制藥有限責任公司，甘肅 武威 735000；4.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000；5.祖師麻基源植物應用技術(shù)研究所，甘肅 張掖 734000）

黃瑞香（Daphne giraldiiNitsche）為瑞香科落葉小灌木，分布于甘肅、寧夏、陜西、青海等省區(qū)［1］。以莖皮和根皮入藥，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗瘧、抗腫瘤等功效［2］。黃瑞香為中藥祖師麻的基源植物，現(xiàn)已被國家列為三級保護中藥材［3］。而祖師麻是北方地區(qū)的民間藥方，曾收錄于《重修定西縣志》中，特別在甘肅民間使用歷史久遠［4］。周光雄等［5］、廖時余等［6］從黃瑞香根、莖的皮中分離出香豆素類、黃酮類、木質(zhì)素類、萜類等化合物；前人從黃瑞香的根莖中分離得到了20個香豆素類化合物，15個黃酮類化合物，13個木質(zhì)素類化合物，二萜類化合物和三萜類化合物［7-10］，但未見有關(guān)黃瑞香種子內(nèi)有機物的報道，因此采用GC-MS法對黃瑞香種子內(nèi)有機化合物成分進行了分析研究，可為更好地合理利用黃瑞香資源提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

Trace GC200氣相色譜儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；TraceDSQ和TraceGC2000氣質(zhì)聯(lián)用分析儀（美國菲尼根質(zhì)譜公司）；JY10001電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；KDW調(diào)溫電熱套1000 mL（山東城華魯電熱儀器有限公司）；石油醚、乙醚、乙酸乙酯及甲醇均為分析純。黃瑞香種子采集于武威市天祝縣祁連鄉(xiāng)布爾草原（103°33＇26″E，38°43＇31″N），共得1700 g凈種子，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學陳垣教授鑒定為黃瑞香種子。

2 方法

2.1 種皮、胚中的有機物提取

從采集的黃瑞香種子中選擇飽滿種子，將種皮和胚分開，各稱取500 g。用研缽磨碎后置于燒杯中，分別加入80%的甲醇500 mL浸提（4℃下），每隔3 h攪拌一次。24 h后用布氏漏斗過濾，收集濾液；將濾渣重新加入500 mL 80%的甲醇繼續(xù)多次浸提至近無色為止，合并其濾液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 種皮和胚的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相及甲醇相提取物的制備

采用系統(tǒng)溶劑法將所得的浸提液分別在35℃下減壓濃縮，離心（4000 r/min）20 min后，取上清液用石油醚萃取3次，得到石油醚相；將所得水相用乙醚萃取3次，得到乙醚相；將所得水相用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相；將所得水相在65℃減壓蒸干后，用甲醇溶解過濾，得到甲醇相［11］。將各有機相定容至200 mL，置于冰箱中（5℃）保存。

2.3 樣品檢測

GC-MS分析條件：氣相色譜條件見參考文獻；DB-5石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫35℃穩(wěn)定4 min，以5℃/min程序升溫至90℃，再以8℃/min程序升溫至240℃穩(wěn)定2 min，傳輸線250℃；載氣為高He（99.99%），氣化室溫度為250℃；質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，電離方式EI；離子源200℃；掃描范圍29～550 u。利用氣質(zhì)聯(lián)用儀計算機的譜庫檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并參考NIST（2008）等有關(guān)標準圖譜進行核對和補充檢索，用色譜峰面積歸一化法計算各色譜峰占揮發(fā)油總量的相對含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃瑞香種子種皮提取的有機物種類

將提取的種皮石油醚相濃縮樣品進行氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，得到總離子流程峰值（見圖1）。經(jīng)計算機質(zhì)譜系統(tǒng)檢索，將樣品的質(zhì)譜圖與標準譜圖進行核對，鑒定出相似度和相對含量較大的6種有機物（見表1），分別為亞油酸（30.42%）、檸檬酸三丁酯（27.6%）、辛烷（13.8%）、鄰苯二甲酸二丁酯（7.1%）、棕櫚酸甲酯（3.82%）和乙酰檸檬酸三丁酯（2.4%）［11］，6種有機物占總峰面積的85.14%。

圖1 黃瑞香種皮石油醚相總離子流程圖Fig.1 The total ion flow chart of petroleum ether extract solution of D.giraldii seed spermoderm

表1 黃瑞香種皮各相浸提液的有機物種類Tab.1 The kinds of organics in D.giraldii seed spermoderm with various phase extract solutions

將種皮的乙醚相濃縮樣品經(jīng)氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析后，其總離子流程峰值如圖2所示。經(jīng)計算機質(zhì)譜系統(tǒng)檢索，質(zhì)譜圖與標準譜圖進行核對，鑒定出的有機物為：鄰苯二甲酸二丁酯（40.77%）、瑞香素（12.43%）、油酸酰胺（11.65%）、豆甾醇（7.59%）和十八烷（3.37%），有一物未鑒定出，占8.03%［11］（表1）。主要有機物的相對含量占總峰面積的83.84%。

圖2 黃瑞香種皮乙醚相總離子流程圖Fig.2 The total ion flow chart of aether extract solution of D.giraldii seed spermoderm

用氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀將種皮的乙酸乙酯相樣品分析，其總離子流程中鑒定出峰面積較大的有機物有8種（圖3）：鄰苯二甲酸二丁酯（40.64%）、亞油酸（15.93%）、十六甲基環(huán)辛硅氧烷（8.89%）、十四甲基環(huán)七硅氧烷（6.53%）、檸檬酸三乙酯（5.91%）、硬脂酸（5.63%）、醋酸（4.85%）和丙酸乙酯（2.91%）［11］（表1）。相對含量占總峰面積的91.29%。

圖3 黃瑞香種皮乙酸乙酯相總離子流程圖Fig.3 The total ion flow chart of ethyl acetate extract solution of D.giraldii seed spermoderm

經(jīng)氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析種皮的甲醇相濃縮樣品，總離子流程分離出14個明顯的峰（圖4）。鑒定出相對含量較多、相似度高的有機物10種（表1）：5-羥 甲 基 糠 醛（11.67%）、乙 酸（9.1%）、瑞 香 素（8.87%）、吡喃酮（8.52%）、鄰苯二甲酸二丁酯（7.26%）、油酸（3.14%）、糠醛（3.69%）、丙三醇（2.88%）、羥基丙酮（2.84%）和糠醇（2.54%）［11］。相對含量占總峰面積的60.51%。

圖4 黃瑞香種皮甲醇相提取物的總離子流程圖Fig.4 The total ion flow chart of methanol extract solution of D.giraldii seed spermoderm

3.2 黃瑞香種胚中提取的有機物種類

經(jīng)氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析黃瑞香種胚的石油醚相濃縮樣后，得到了8個峰值（圖5）。鑒定出的有機物有：鄰苯二甲酸二丁酯（33.85%）、甲基環(huán)己烷（20.17%）、庚烷（14.81%）、亞油酸（12.61%）、棕櫚酸甲酯（4.16%）和辛烷（3.15%）［11］（表2）。含量為總峰面積的88.75%。

圖5 黃瑞香種胚石油醚相提取物的總離子流程圖Fig.5 The total ion flow chart of petroleum ether extract solution of D.giraldii seed embryo

經(jīng)氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析種胚的乙醚相濃縮樣品后，在總離子流程中得到8個峰（圖6）。鑒定出主要的有機物（表2）有：鄰苯二甲酸二丁酯（24.07%）、亞油酸（13.33%）、苯甲酸（9.82%）、未知3（7.68%）、油酸酰胺（5.13%）和肉桂酸（2.06%）［11］，含量為總峰面積的62.09%。

圖6 黃瑞香種胚乙醚相提取物總離子流程圖Fig.6 The total ion flow chart of aether extract solution of D.giraldii seed embryo

經(jīng)氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析黃瑞香種胚的乙酸乙酯相濃縮樣，得到的總離子流程（圖7），得到6個峰。鑒定出有機物：鄰苯二甲酸二丁酯（22.89%）、檸檬酸三乙酯（6.38%）、亞油酸（5.97%）、丙酸乙酯（2.11%）和乙酸丁酯（0.26%）［11］（見表2）。這些物質(zhì)主要為酯類和有機酸類物質(zhì)，含量為總峰面積的37.61%。

圖7 黃瑞香種胚乙酸乙酯相提取物的總離子流程圖Fig.7 The total ion flow chart of ethyl acetate extract solution of D.giraldii seed embryo

經(jīng)氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析種胚所提取的甲醇相濃縮樣品后，從總離子流程中分離出8個峰（圖8）。經(jīng)鑒定有機物主要有6種（表2）：5-羥甲基糠醛（10.77%）、鄰苯二甲酸二丁酯（7.23%）、2，3-二氫-3，5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（6.79%）、呋喃酮（2.28%）、3-糠醛（1.40%）和甲基環(huán)戊烯醇酮（1.23%）［11］。主要為酮類、醛類物質(zhì)和酯類物質(zhì)，含量為總峰面積的29.70%。

表2 黃瑞香種胚各相浸提液的有機物種類Tab.2 The kinds of organics in D.giraldii seed embryo with various phase extract solutions

圖8 黃瑞香種胚甲醇相提取物的總離子流程圖Fig.8 The total ion flow chart of methanol extract solution of D.giraldii seed embryo

4 結(jié)論與討論

經(jīng)GC-MS分析和計算機質(zhì)譜系統(tǒng)檢索核對，結(jié)果表明，種皮中共有25種有機物，鑒定出23種，未鑒定出的有2種，其中質(zhì)量分數(shù)較高的有鄰苯二甲酸二丁酯、檸檬酸三丁酯、油酸酰胺、亞油酸、瑞香素、辛烷和5-羥甲基糠醛；在種胚中鑒定出了18種有機物，未鑒定出的有機物有1種，其中質(zhì)量分數(shù)較高的有鄰苯二甲酸二丁酯、甲基環(huán)己烷、亞油酸、苯甲酸、肉桂酸和5-羥甲基糠醛。本實驗鑒定的黃瑞香種子中共有32種有機物，其中質(zhì)量分數(shù)較高的有機物有鄰苯二甲酸二丁酯、亞油酸、檸檬酸三丁酯、瑞香素、甲基環(huán)己烷、油酸酰胺、辛烷、庚烷、5-羥甲基糠醛。有機物主要以酯類、有機酸類、烴類、醛酮類和醇類為主。且種皮和種胚中的共有組分和專一組分差異較大，種皮中的有機物種類多于種胚。

廖時余等［6］從黃瑞香莖皮中分離得到7個化合物，分別鑒定為正丁基丁香苷、β-香樹脂酮、β-谷甾醇棕櫚酸酯、β-香樹脂醇乙酸酯、瑞香多林A、狼毒雙香豆素、木犀草素。與本實驗相比除均含香豆素類外，其它成分則為專一組分；蘇娟等［9］從黃瑞香根中分離鑒定出了β-谷甾醇、胡蘿卜苷、齊墩果酸、十八碳酸單甘油酯、十八烷基咖啡酸酯、白樺酸、瑞香素、齊墩果瑞香醛等10個化合物，除與本實驗均含共有組分瑞香素外，其它均為專一組分；而張和平等［10］從黃瑞香葉中分離出3-己烯-1-醇、順式-α，α，5-三甲基-5-四氫呋喃-2-甲醇、天然壬醛、十六烷、二噻吩乙酸、3-三癸酯、柏木腦等化學成分，與本實驗的成分無一類同，這可能與不同部位次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運和積累相關(guān)。最為關(guān)鍵的是種子中含有大量的有機酸、酮類化合物、酯類、亞油酸、瑞香素和5-羥甲基糠醛，Abdul等［12］發(fā)現(xiàn)有機酸、酮類化合物和酯類能增強抗炎和鎮(zhèn)痛效力；張春娥等［13］認為亞油酸能降膽固醇，預防動脈粥樣硬化等功效；瑞香素又名祖師麻甲素，是香豆素類化合物的代表性單體成分，為我國首創(chuàng)的心腦血管新藥，且有多種藥理作用［14］，Liu等［15］認為瑞香素對胰腺炎有控制作用，且其抗氧化活性突出［16］，Du等［17］發(fā)現(xiàn)瑞香素通過抑制坐骨神經(jīng)損傷小鼠L4-6脊髓中NF-6激活，促進坐骨神經(jīng)再生及功能恢復；5-羥甲基糠醛具抗氧化［18］，改善血液流變學［19］等藥理作用。這些活性成分在種子中含量高，是潛在的藥用資源，故應研究開發(fā)。

黃瑞香以莖皮和根皮入藥，核心成分是瑞香素，而在獲得原料時，常采用砍伐枝條和挖根，對資源和生態(tài)破壞極大，這也是該資源面臨瀕危的主要因素。本試驗首次從種子中發(fā)現(xiàn)了獨特成分-瑞香素，且只存在于種皮，本發(fā)現(xiàn)將為核心成分的獲取開辟新路徑，為此，可通過收獲較多的種子來獲取“靶標”物，同時為頻危資源的保護和繁延起到積極的影響。種皮特性可引種子的休眠［20-21］，而黃瑞香種子的休眠是否與種皮的主要物質(zhì)相關(guān)，有待于今后進一步研究。