朱 濤，馬艷竹，程艷婷△,李俊蓮，李健豪

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030600；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001)

惡性腫瘤是嚴重危害人們生命健康的疾病之一，中國每年死亡率高達30%，且仍有上漲趨勢[1-2]。目前，環(huán)磷酰胺(CTX)仍然是治療腫瘤的重要手段之一，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，艾灸腧穴組方“大椎”“足三里”“三陰交”穴具有改善化療藥CTX不良反應(yīng)的作用[3]。麥粒灸屬于艾灸療法中直接灸的一種，以“體積小、滲透性強”著稱[4]。在腫瘤治療過程中，麥粒灸與CTX合用是否具有協(xié)同增效的作用是本實驗關(guān)注的一個焦點?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡異常密切相關(guān)，而誘導(dǎo)細胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要方式之一[5]。而Bax、Bcl-2是細胞凋亡家族中最經(jīng)典的因子，在腫瘤細胞凋亡中扮演著重要角色[6]?；诖?，本實驗從腫瘤細胞凋亡相關(guān)角度，通過建立Hepa1-6荷瘤小鼠模型，觀察麥粒灸荷瘤小鼠對腫瘤組織中Bax及Bcl-2表達水平，以期為艾灸抑制腫瘤提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，體質(zhì)量(16±2)g，6～8周齡[由北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點實驗室。所有小鼠均自由取食(予以常規(guī)飼料)和飲水，明暗周期為12/12 h，環(huán)境溫度22～25℃，濕度(45±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。將小鼠按隨機數(shù)字表分為對照組、麥粒灸組、CTX組與麥粒灸+CTX組，每組10只。實驗過程嚴格遵守中華人民共和國2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑 Hepa1-6腫瘤細胞株(由鄭州云笛生物科技有限公司惠贈);注射用環(huán)磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，生產(chǎn)批號:9L353A);精細艾絨(南陽宜康艾艾草制品有限公司);石蠟、無水乙醇、0.9%生理鹽水注射液和HE染液(Servicebio公司，生產(chǎn)批號：G1005-500ML);牛血清白蛋白(Servicebio公司，生產(chǎn)批號：G5001-5G);BCL-2Antibody(Cusabio，生產(chǎn)批號：CSB-RA002611A0HU);Bax Antibody(Cusabio，生產(chǎn)批號：CSB-PA000976)。

1.2.2 儀器 電子天平LT1002(沈陽龍騰電子有限公司);細胞培養(yǎng)箱(上海力申股份有限公司);MX3000qPCR儀(德國LAICA公司);EG1160包埋機(德國LAICA公司);RM2126病理切片機(德國LAICA公司);組織切片全景掃描儀(匈牙利3DHISTECH);ImageJ圖像分析軟件。

1.3 植瘤方法

在參考相關(guān)文獻[7]的基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題組前期造模方法優(yōu)化改進，將復(fù)蘇后的Hepa1-6腫瘤細胞株進行復(fù)蘇、培養(yǎng)并接種于昆明種小鼠腹腔，1周后形成腹水，抽出腹水并離心，調(diào)整細胞密度為3×106/mL，抽取0.2 mL接種于C57BL/6小鼠右側(cè)腋后皮下建立Hepa1-6荷瘤模型。接種5 d后，以肉眼可見腫塊及病理檢測作為植瘤成功的標(biāo)準。

1.4 穴位選取及干預(yù)治療

腧穴定位參考李忠仁主編《實驗針灸學(xué)》[8]，選取“大椎”“足三里”(雙側(cè))“三陰交”(雙側(cè))作為施灸穴位。麥粒灸大小以及施灸方法為將小鼠固定后，對施灸穴位脫毛，艾絨制成麥粒大小(1.5g/粒)的艾炷，置于涂抹凡士林的穴位上，線香引燃，當(dāng)艾炷燒至3/4時，用鑷子快速取下殘存艾炷，并灸下一壯，每穴時間約25～30 s[9]。

植瘤成功后，對照組給予腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d，1次/d，連續(xù)3 d；CTX組、麥粒灸+CTX組按荷瘤小鼠體質(zhì)量給予腹腔注射CTX 30 mg/kg[10]，1次/d，連續(xù)3 d；麥粒灸組、麥粒灸+CTX組給予麥粒灸“足三里”(雙側(cè))、“三陰交”(雙側(cè))和“大椎”，每穴5壯，1次/d，連續(xù)10 d。麥粒灸組和麥粒灸+CTX組于每日同一時間行麥粒灸治療。

末次治療后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剝離出腫瘤組織放入-80 ℃冰箱進行保存，待檢測。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 觀察各組荷瘤小鼠干預(yù)前后一般情況 包括毛色光亮度、反應(yīng)靈敏度、活動程度、精神狀態(tài)及體質(zhì)量等。

1.5.2 檢測瘤體質(zhì)量及抑瘤率 將剝離出的瘤體用無菌濾紙吸干血液后稱重并計算抑瘤率。公式:抑瘤率(%)=(對照組平均瘤體質(zhì)量-治療組平均瘤體質(zhì)量)/對照組平均瘤體質(zhì)量×100%。

1.5.3 HE染色法觀察腫瘤組織病理學(xué)變化 將固定好的腫瘤組織進行脫水、常規(guī)石蠟包埋。切成約5 μm厚度的石蠟切片，滴加蘇木精，染色5 min后沖洗，滴加伊紅染色3 min，使用乙醇脫水，自然晾干后，二甲苯中透明10 min，中性樹膠封片，置于全景掃描儀下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。

1.5.4 實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織Bax、Bcl-2 mRNA的表達水平 選用Trizol試劑盒提取腫瘤組織總RNA，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA。引物設(shè)計及合成均由上海生物工程股份有限公司完成，以總mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時熒光定量PCR擴增，反應(yīng)在20 μL體系中進行，反應(yīng)體系：1 μL qPCR引物，1 μL cDNA產(chǎn)物，10 μL SYBR Green qPCRMaster Mix(2×)。擴增條件：預(yù)變性95 ℃-10 min，95 ℃-15 s，60 ℃-60 s，循環(huán)40次。溶解曲線60-95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.5.5 Western blot法檢測腫瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白表達水平 提取各組小鼠腫瘤組織蛋白，測定蛋白濃度。通過配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜和脫脂牛奶封閉，加入兔抗鼠lgG Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶5 000)及β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃冰箱封閉過夜，PBS-T洗滌，加入二抗，室溫2 h。PBS-T洗滌，ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描圖像入計算機。運用ImageJ軟件分析處理Bax、Bcl-2條帶灰度值，以Bax、Bcl-2與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示其相對表達量。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組荷瘤小鼠干預(yù)前后日常情況對比

干預(yù)前，各組荷瘤小鼠精神狀態(tài)一般，活動較自如，毛色較光亮，對外界刺激反應(yīng)較靈敏，飲食無異常，體質(zhì)量稍有增加。干預(yù)后，對照組反應(yīng)靈敏度明顯下降，毛質(zhì)粗澀，體質(zhì)量下降幅度較??；麥粒灸組能站立行走，但步態(tài)緩慢，毛色較光亮，反應(yīng)稍靈敏，體質(zhì)量增長較少；CTX組對外界刺激反應(yīng)遲鈍,背毛聳立，步態(tài)不穩(wěn)，鼠毛脫落多，體質(zhì)量大幅度下降;麥粒灸+CTX組意識較清楚，反應(yīng)靈敏度有所增加，部分鼠毛脫落，體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，增長幅度較小。

2.2 各組小鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率變化

與對照組比較，麥粒灸組、CTX組和麥粒灸+CTX組瘤體質(zhì)量顯著減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，抑制率分別為23.9%、45.9%和67.1%，其中麥粒灸+CTX組抑瘤效果最好；與CTX組比較，麥粒灸+CTX組瘤體質(zhì)量顯著減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

注：A.對照組;B.麥粒灸組;C.CTX組;D.麥粒灸+CTX組。圖1 各組荷瘤小鼠瘤體圖

表2 各組小鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較

2.3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)比較

鏡下見：對照組腫瘤細胞大小、形態(tài)各異，核膜核仁清晰，分裂細胞多；麥粒灸組腫瘤細胞核分裂較少，腫瘤壞死區(qū)明顯增多；CTX組腫瘤細胞結(jié)構(gòu)較模糊，核分裂減少；麥粒灸+CTX組腫瘤細胞排列松散，核膜、核仁模糊，核分裂顯著減少。見圖2。

圖2 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)比較(HE染色,400×)

2.4 各組小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2 mRNA的表達水平比較

與對照組比較，CTX組、麥粒灸組和麥粒灸+CTX組Bax mRNA表達水平均顯著升高、Bcl-2 mRNA表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與CTX組比較，麥粒灸+CTX組Bax mRNA表達水平顯著升高、Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3和圖3。

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2 mRNA的表達水平

2.5 各組小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2蛋白表達比較

與對照組比較，CTX組、麥粒灸組和麥粒灸+CTX組Bax蛋白表達顯著升高、Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與CTX組比較，麥粒灸+CTX組Bax蛋白表達顯著升高、Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖4、表4。

注：A.對照組;B.麥粒灸組;C.CTX組;D.麥粒灸+CTX組。圖4 各組小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2蛋白條帶圖

表4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中Bax、Bcl-2蛋白表達

3 討論

腫瘤在中醫(yī)學(xué)中被歸屬為“癥瘕”“積聚”等范疇[11]?！鹅`樞·百病始生》曰：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣”，《備急千金要方》引《藥對》中亦言:“夫眾病積聚，皆起于虛”[12]，故中醫(yī)學(xué)認為腫瘤的形成與機體受寒、陽氣虧虛有關(guān)。目前，以CTX為主的化療藥仍然是治療腫瘤的重要手段之一，可通過破壞腫瘤細胞DNA或終止細胞周期抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其苦寒之性會傷及脾陽、損及正氣[13]。正如《景岳全書》指出：“脾胃不足及虛弱失調(diào)之人，多有積聚之病”，故溫陽補脾、健運中州對腫瘤的治療至關(guān)重要。灸法治療腫瘤歷史悠久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》一書中就有用灸法治療癥瘕、積聚(腫瘤)的記載[14],《景岳全書》提出:“大結(jié)大滯者，最不易散，必欲散之，非借火力不能速也，所以極宜用灸”。麥粒灸是艾炷直接灸最經(jīng)典的方法，具有熱力高、滲透強和療效突出等優(yōu)點，在防治疑難病過程中具有獨特效應(yīng)，為當(dāng)代著名灸法大師謝錫亮先生畢生所倡導(dǎo)[15]。

課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)麥粒灸對荷瘤小鼠化療后可明顯提高白細胞數(shù)量、改善骨髓抑制狀態(tài)和提高機體免疫力，起到減毒作用[16]。且李麗君等[17]發(fā)現(xiàn)通過艾灸溫?zé)嵝?yīng)能明顯降低肉瘤微環(huán)境中FGFR1和VEGFR2的表達，抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長。上述證實了麥粒灸溫補、溫通之能對腫瘤的“虛”“寒”起到重要治療作用，故以“虛者補之、寒者溫之”為原則取穴。大椎為諸陽之會，灸之可振奮陽氣?，F(xiàn)代研究表明麥粒灸大椎穴能提高機體免疫力，起到抑瘤作用[18-19]。足三里乃足陽明胃經(jīng)下合穴，是強壯保健要穴，具有補益脾胃之功。黃文娟等[10]發(fā)現(xiàn)艾灸荷瘤小鼠“后三里穴”可促進Th1型細胞因子產(chǎn)生，糾正荷瘤導(dǎo)致的Th1/Th2失衡，有效抑制腫瘤的生長。三陰交乃肝、脾和腎三陰經(jīng)交會穴，灸之可溫陽健脾、培元固本，故本實驗采用麥粒灸大椎、足三里與三陰交對荷瘤小鼠進行干預(yù)治療。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡形式，可有序有效地去除受損細胞[20-21]。異常的細胞凋亡導(dǎo)致細胞內(nèi)部環(huán)境紊亂,進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而誘導(dǎo)細胞凋亡是抑制腫瘤生長的主要方式之一[22-23]。在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程中，諸多抑癌基因發(fā)揮著不同的作用，如控制細胞自主、有序死亡的P53、caspase家族和Bcl-2家族等，其功能異常與多種疾病相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫疾病等[24-25]。而Bcl-2蛋白家族是線粒體滲透能力轉(zhuǎn)換的重要調(diào)節(jié)者，直接或間接影響線粒體的通透性以調(diào)節(jié)或破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和死亡，從而在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。Bax蛋白作為促凋亡調(diào)節(jié)因子，通過與Bcl-2和其他Bcl-2蛋白家族成員的同二聚和異二聚作用誘導(dǎo)細胞死亡；Bcl-2蛋白作為抗凋亡調(diào)節(jié)因子，通過線粒體外膜通透性促進細胞死亡[27]。換言之，當(dāng)Bax形成同源二聚體或Bax過度表達時，均可拮抗Bcl-2的保護作用而使細胞趨于凋亡[28-29]。因此，Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡成員之間的平衡可以決定細胞的增殖與凋亡。本實驗研究結(jié)果顯示，Hepa1-6荷瘤小鼠經(jīng)CTX或麥粒灸治療后，腫瘤組織中Bax表達呈上升趨勢，Bcl-2表達呈下降趨勢，尤以CTX組最為顯著，提示麥粒灸或CTX均能促進腫瘤細胞凋亡。此外，實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)麥粒灸+CTX組Bax、Bcl-2表達水平最為顯著，抑瘤率優(yōu)于單獨應(yīng)用麥粒灸或CTX治療組，表明麥粒灸與CTX合用治療腫瘤可起到協(xié)同增效的作用。

綜上所述，麥粒灸對腫瘤有明顯的抑制作用，并在一定程度上能夠改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)；與CTX聯(lián)用時，抑瘤作用更佳。二者聯(lián)合使用在促進腫瘤細胞凋亡的同時又能改善小鼠的生存狀態(tài)，起協(xié)同增效作用，其機制可能與調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2的表達有關(guān)。由于Bcl-2家族蛋白功能及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，加之Hepa1-6荷瘤小鼠腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與臨床患者自身腫瘤細胞之間存在差異，因此，麥粒灸對荷瘤小鼠腫瘤細胞的抑瘤作用機制尚需進一步深入研究。