穴位電刺激對卒中后抑郁大鼠行為學及神經(jīng)遞質水平影響

馬伊笛，孫曉偉，運 鋒△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

卒中后抑郁(Post-Stroke Depression，PSD)是卒中患者患病后常見并發(fā)癥之一，其臨床表現(xiàn)除卒中癥狀外，還伴有乏力、嗜睡、焦慮、情緒低落和興趣缺失等情感障礙及軀體癥狀。有研究表明，卒中患者中約有33.3%的幸存者患有PSD[1]。在我國，卒中后14 d PSD發(fā)病率約28.4%，卒中后1年，發(fā)病率可高達41.8%[2]。

PSD不僅不利于卒中患者機體功能恢復，其發(fā)病也與卒中幸存者死亡率升高密切相關[3]。關于PSD的發(fā)病機制，目前有下丘腦-垂體-腎上腺 (HPA) 軸功能障礙、炎癥反應、單胺類神經(jīng)遞質水平降低、谷氨酸水平升高引發(fā)興奮性毒性和神經(jīng)可塑性降低等多種假說。目前，針對PSD的治療主要有3種方式，即藥物治療、心理治療和社會干預。所有治療方法中又以藥物治療為主，常用藥物包括三環(huán)類藥物(TCA)、選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)、5-HT和NE再攝取抑制劑(SNRIs)以及MAO抑制劑等。但有研究表明，常用的抗抑郁藥有導致包括出血性并發(fā)癥、跌撲和藥物依賴等不良后果的風險[4]。針灸是中醫(yī)傳統(tǒng)非藥物治療手段之一，在卒中后遺癥治療領域應用廣泛，且具有良好臨床療效。多項臨床研究均表明針刺可有效治療PSD，但其起效機制尚需系統(tǒng)研究。本研究通過建立大鼠PSD模型，觀察電刺激百會、內關、大椎與太沖對模型大鼠抑郁樣行為及神經(jīng)遞質水平的影響，并探究其作用機制與CREB/BDNF/TrkB信號通路的關系，以期以實驗室病理生理數(shù)據(jù)結果為電刺激法針灸治療PSD的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

36只健康SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量180～220 g，來源為黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證編號：SCXK(黑)2018-001。大鼠于恒溫(22～25℃)、恒濕(65%～70%)、自然采光和充足自由飲水條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境及方法參考《動物實驗管理條例》，嚴格遵循要求。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 儀器 敞箱(100 cm×100 cm×50cm，友誠嘉業(yè)生物科技有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI7000，Applied Biosystems，賽默飛世爾科技有限公司)；酶標儀(VersaMax，美谷分子儀器有限公司)；臺式冷凍離心機(Biofugestratos，Heraeus科技有限公司)；渦旋混勻儀(Vortex-QL-901，其林貝爾儀器制造有限公司)；大腦中動脈阻塞模型線栓(MSRC43B260PK50，瑞沃德生命科技有限公司)；無菌針灸針(環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司，規(guī)格：0.30 mm×25 mm)；華佗電子針療儀(SDZ-Ⅱ型，蘇州醫(yī)療用品有限公司)；非吸收性外科縫線(3-0，華翔醫(yī)療器械廠有限公司)；一次性窄刀片(LEICA819，德國LEICA公司)。

1.2.2 試劑 總RNA提取試劑、RT-PCR技術盒(寶日醫(yī)生物技術有限公司)；PCR Mix(升博生物科技有限公司)；BDNF ELISA試劑盒(SP12323，賽培生物科技有限公司)；5-HT ELISA試劑盒(SP12579，賽培生物科技有限公司)；蔗糖(S8271，索萊寶科技有限公司)；注射用青霉素鈉(批號F7032124，國藥準字 H13020657,華北制藥股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 模型建立

模型組、治療組大鼠采用改良Zea Longa線栓法聯(lián)合慢性不可預知溫和刺激法建立PSD模型。假手術組大鼠區(qū)別于模型組及治療組，僅對動脈進行分離但不結扎，消毒后直接進行常規(guī)縫合。

2.1.1 卒中模型構建 參考已有實驗案例，采用改良Zea Longa線栓法對模型組及治療組大鼠進行造模[5]。大鼠采用腹腔注射法進行麻醉，麻醉后于左側頸部剪開，對頸部肌群進行鈍性分離，同時分離頸總動脈及頸內、外動脈。將頸總動脈近心端和頸外動脈結扎，于遠端夾閉頸內動脈后，在頸總動脈附近約1 cm處剪開，沿切口插入尼龍線至頸內動脈，插入深度約2 cm。完成線栓插入后扎緊動脈殘端，消毒后進行常規(guī)縫合。術后對大鼠給予青霉素腹腔注射以預防感染。注射劑量4萬U/d，連續(xù)3 d。

2.1.2 卒中后抑郁模型構建 抑郁模型構建采用慢性不可預知溫和刺激法(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)[6]。模型組及治療組大鼠于清醒后第7天開始，每天選擇一種應激方法進行刺激。應激方法共選用7種，包括水平振蕩(時長30 min，頻率160次/min)、夾尾(時長1 min)、晝夜顛倒(周期24 h)、4 ℃冰水游泳(時長5 min)、禁水(時長24 h)、禁食(時長24 h)和足底電擊(時長30 min，電流強度1 mA，每次電擊1 s，頻率1次/min)。造模過程中同一種方法不連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)刺激3周。

PSD造模結束后第2天對模型構建情況進行評價，模型構建成功標準為Zea Longa神經(jīng)行為學評分1～3分，敞箱實驗評分及糖水消耗百分比低于假手術組且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 干預方法

造模1 d后開始干預。治療組采用百會、內關、大椎和太沖電針刺激進行干預，腧穴定位參考《實驗針灸學》和《實驗動物常用穴位名稱與定位》中百會穴、內關穴、大椎穴與太沖穴位置[7-8]。通過自制大鼠固定器將大鼠進行固定，大鼠清醒狀態(tài)下，選用直徑0.3 mm無菌針灸針分別針刺百會、內關、大椎與太沖。其中大椎直刺，百會、太沖與內關向后平刺入皮膚，針刺深度約2 mm。進針后連接電針儀，設置疏密波，電壓峰值6 V，頻率1/20 Hz，以針體輕抖且動物耐受為得氣，持續(xù)治療15 min。治療頻率1次/d，連續(xù)治療21 d。假手術組、模型組大鼠正常飼養(yǎng)，每天與治療組大鼠同時捆綁固定15 min，但不進行電針干預。

2.3 行為學指標檢測方法

各組大鼠于PSD造模結束后第2天和干預4周后分別進行行為學指標檢測。

2.3.1 Zea Longa神經(jīng)行為學評分 評分標準：活動自如，無明顯神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，視為無缺損，計0分；活動基本自如，但提尾時左側前肢屈曲且不能伸展，視為輕度缺損，計1分；爬行時出現(xiàn)活動障礙，具體表現(xiàn)為追尾或向左側劃圈情況，視為中度缺損，計2分；爬行困難，出現(xiàn)嚴重障礙，身體向左側傾倒，視為重度缺損，計3分；意識喪失，完全不能爬行，視為無神經(jīng)功能，計4分[9]。

2.3.2 糖水消耗實驗 于各組鼠籠兩側分別放置1個水瓶，1瓶為純凈水，另一瓶為1%蔗糖水。大鼠自由飲水48 h，每12 h對換1次水瓶位置。實驗測定前，大鼠禁食禁水24 h，再次于鼠籠兩側放置純凈水和糖水，3 h后記錄各組純凈水和糖水消耗量，依據(jù)公式計算糖水消耗百分比并記錄。(計算方法：糖水消耗百分比=[糖水消耗量/(糖水消耗量+純凈水消耗量)]×100%)[10]。

2.3.3 敞箱實驗 選用100 cm×100 cm×50 cm的敞箱，將各組大鼠依次放入敞箱對邊中線交點，大鼠自由活動，5 min內分別記錄各組大鼠水平及垂直活動情況。水平活動計分以大鼠三足跨入鄰格為標準，1次計1分;垂直活動以大鼠雙前肢離開地面為身體直立標準，1次計1分[11]。

2.4 取材及生化指標檢測方法

2.4.1 取材方法 行為學測試結束后，對大鼠進行腹腔注射麻醉。大鼠進入麻醉狀態(tài)后，采用腹主動脈取血法，每只大鼠取血5 mL。將采血管靜置2 h后經(jīng)冷凍離心機以離心溫度4 ℃，功率3 000 r/min，離心半徑10 cm為條件離心15 min。離心后取上層血清放入凍存管，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙罅⒓磾囝^取腦，在冰盤上迅速剝離海馬組織，沖洗后液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 ELISA法檢測大鼠血清5-HT、BDNF含量 依據(jù)大鼠5-HT、BDNF ELISA試劑盒說明書，取-80 ℃保存的血清于恒溫水浴鍋中復溫。復溫后，分別根據(jù)試劑盒要求依次添加已配置好的試劑操作，反應終止后采用多功能酶標儀于450 nm波長處對OD值進行檢測。

2.4.3 實時熒光定量PCR法檢測大鼠海馬BDNF、TrkB及CREB mRNA表達水平 取液氮中保存的大鼠海馬組織，采用Trizol法提取總RNA后進行反轉錄，測定BDNF、TrkB及CREB mRNA的相對表達量。反應條件依次為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s和72 ℃ 30 s循環(huán)40次，54 ℃ 5 min。內參選用GAPDH，按照2-△△Ct法分析BDNF、TrkB及CREB mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計學處理

表1 BDNF、TrkB及CREB mRNA引物序列

3 結果

模型制備過程中有4只大鼠因操作不當死亡，1只大鼠模型構建失敗，予以剔除。最終假手術組10只、模型組9只和治療組12只大鼠納入觀察。

3.1 各組大鼠行為學指標比較

造模后，模型組、治療組大鼠與假手術組大鼠比較，Zea Longa神經(jīng)行為學評分升高、蔗糖消耗百分比降低、敞箱實驗水平及垂直評分均降低，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示大鼠PSD模型構建成功。見表2。

干預后，與假手術組比較，模型組大鼠Zea Longa神經(jīng)行為學評分升高、蔗糖消耗百分比降低、敞箱實驗水平及垂直評分均降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠Zea Longa神經(jīng)行為學評分降低、蔗糖消耗百分比升高、敞箱實驗評分升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠行為學指標比較

3.2 各組大鼠血清5-HT、BDNF含量比較

干預后，與假手術組比較，模型組大鼠血清5-HT及BDNF含量均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠血清5-HT及BDNF含量均明顯增高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清5-HT、BDNF含量比較

3.3 各組大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平比較

干預后，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB及CREBmRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組大鼠海馬組織中BDNF、TrkB及CREB mRNA相對表達水平顯著增高(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 各組大鼠腦組織BDNF、TrkB、CREB mRNA相對表達水平

4 討論

目前，我國卒中發(fā)病率持續(xù)增高，其治療及后期康復給人民家庭及社會帶來沉重負擔[12]。作為卒中常見并發(fā)癥之一，PSD會導致疲勞、情緒低落甚至自殺傾向等多種不良狀態(tài)，嚴重影響了卒中患者的機體功能恢復及心理健康情況，同時也為患者家庭及社會帶來了沉重負擔。關于PSD的風險因素及發(fā)病機制，目前尚無統(tǒng)一定論。目前針對PSD風險因素研究主要涉及年齡、抑郁病史、卒中嚴重程度與發(fā)病部位等，但其中尚有一些因素存在爭議，需進一步探索求證[13-16]。關于PSD的發(fā)病機制，目前主要有下丘腦-垂體-腎上腺 (HPA) 軸功能障礙、單胺類神經(jīng)遞質水平降低、炎癥反應和神經(jīng)可塑性降低等假說。HPA軸作為機

注：圖中曲線從右到左依次為假手術組、模型組和治療組。圖1 qPCR擴增曲線

體主要神經(jīng)內分泌應激反應系統(tǒng)之一，與情緒調節(jié)、免疫反應和新陳代謝等多個生理功能密切相關。HPA軸的過度活躍被認為是重度抑郁癥最突出的表現(xiàn)之一[17]。糖皮質激素及其受體是 HPA 軸的重要組成部分，有相關研究表明，糖皮質激素受體表達情況與抑郁樣行為密切相關[18]。作為機體重要生理病理反應之一，炎癥反應與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，在疾病治療機制研究中占有重要地位。基于既往研究結果可以看出，白細胞介素-1α (IL-1α)、白細胞介素-1β (IL-1β)、白細胞介素-6 (IL-6)以及腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等促炎細胞因子均與抑郁癥存在緊密聯(lián)系[19]。卒中作為一種大腦創(chuàng)傷，可以在受傷的大腦區(qū)域引發(fā)強烈的炎癥反應，導致受損的神經(jīng)元釋放促炎細胞因子，激活小膠質細胞，最終引起PSD[20]。多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)等單胺類神經(jīng)遞質對大腦的生理功能有著至關重要的影響。抑郁癥相關研究顯示，抑郁癥患者大腦中的 5-HT 水平普遍低于健康人群，這一現(xiàn)象在 PSD 患者中同樣存在[21]。目前，血漿5-HT濃度變化已成為用于預測中風后精神疾病的重要臨床指標。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種大型多肽類化合物，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)結構的發(fā)育和維持中均占有重要地位。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中含量最為豐富、分布最為廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 具有調節(jié)神經(jīng)元存活、遷移、表型分化、軸突和樹突生長以及影響突觸形成等多種生理功能。所以，BDNF水平的變化對突觸可塑性、突觸生理行為等神經(jīng)生理活動均具有關鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，PSD患者血清中的BDNF濃度明顯低于正常人，而缺乏BDNF可導致抑郁狀態(tài)發(fā)展。因此。血清BDNF現(xiàn)也被視為是PSD的生物標志物之一[22-23]。本實驗通過檢測大鼠血清5-HT、BDNF含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)百會、內關、大椎和太沖穴位電刺激治療后，PSD大鼠血清5-HT、BDNF含量明顯高于模型組大鼠，提示百會、內關、大椎與太沖穴位電刺激治療可調節(jié)機體單胺類神經(jīng)遞質及神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，對PSD具有治療作用。

現(xiàn)代中醫(yī)理論將PSD歸于“中風”“郁證”等范疇，臨床表現(xiàn)為情緒低落、神情呆滯等，認為其治療應從腦、肝和腎等臟腑入手?！饵S帝內經(jīng)》中提出，肝主情志、腎主藏精納氣。肝失疏泄會導致肝氣郁結、情志不舒與痰瘀互結阻塞于腦竅。而腎氣不足則無法充養(yǎng)腦髓，導致神機失用。所以PSD的發(fā)病，雖主要病位在腦，但與肝腎關系同樣密切。針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)療法之一，具有疏通經(jīng)絡、調和陰陽、氣血同治和標本兼顧的功效特點，在臨床被廣泛應用于多種疾病的治療及恢復。近年有研究發(fā)現(xiàn)，針刺療法具有干預中樞及外周迷走神經(jīng)、調節(jié)神經(jīng)遞質傳遞和提高神經(jīng)功能的療效，可用于治療PSD，改善抑郁狀態(tài)，促進機體功能恢復，且治療效果良好[24-25]。與常規(guī)針刺相比，電針具有刺激量強、方便靈活和針感持久等優(yōu)勢，已成為臨床針灸治療的常用輔助手段，其療效已得到廣泛認可。目前臨床針刺治療PSD主要以“調神”為核心治則，常選用“百會”“內關”“太沖”“神庭”“大椎”等穴。百會穴屬督脈，《針灸甲乙經(jīng)》中稱其為“三陽五會”，為手足三陽經(jīng)與督脈交會穴，具有醒腦調神、宣陽開郁的功效。內關穴為心包經(jīng)絡穴，同時也是八脈交會穴之一，與陰維脈相通，具有調節(jié)情志、安養(yǎng)元神的功效。太沖穴為肝經(jīng)原穴，具有行氣通絡、疏肝解郁的功效。大椎穴為督脈與諸陽經(jīng)交會穴位，具有通督行氣、調神醒腦的功效。因此，本研究選取百會、內關、太沖和大椎4穴進行電刺激干預治療。本實驗通過對比各組大鼠行為學實驗結果發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠相比較，治療組大鼠的神經(jīng)功能明顯改善，缺損情況減輕，評分降低。蔗糖偏好率及敞箱實驗評分有所提高，提示電針百會、內關、太沖與大椎4穴可有效改善PSD模型大鼠神經(jīng)功能缺損及抑郁癥狀，對PSD有明顯治療作用。

BDNF作為CNS中廣泛分布的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，在PSD發(fā)病和治療方面具有重要意義。BDNF與機體內5-HT水平調節(jié)具有密切聯(lián)系。有多項研究表明，BDNF可提高5-HT及其代謝物水平，增加5-HT神經(jīng)元軸突數(shù)量，提高5-HT合成相關基因表達[26-28]。作為BDNF受體之一，TrkB蛋白也與神經(jīng)功能調節(jié)密切相關。在與BDNF結合后，TrkB可通過啟動細胞內信號轉導促進神經(jīng)元發(fā)育表達，進而修復神經(jīng)損傷，以此發(fā)揮抗抑郁作用[29]。有研究證實，機體TrkB的缺乏可導致焦慮行為增多[30]。CREB是一種細胞轉錄因子，有研究顯示，其與BDNF表達水平及包括抑郁癥在內的多種情緒障礙關系密切[31]。CREB可與BDNF-TrkB信號傳導途徑共同組成一個正反饋通路，TrkB與BDNF結合后可將CREB磷酸化，而磷酸化的CREB可隨后激活BDNF，增強 TrkB 信號[32]?；贑REB/BDNF/TrkB與5-HT及PSD的密切關系，本實驗對各組大鼠海馬組織中CREB、BDNF及TrkB mRNA水平進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)，對比模型組大鼠，治療組大鼠3種蛋白mRNA表達情況均顯著提升，提示電針百會、內關、太沖和大椎共4穴可上調大鼠CREB/BDNF/TrkB信號通路表達，結合酶聯(lián)免疫結果推測，其可能是電針百會、內關、太沖和大椎治療PSD機制之一。

綜上所述，電刺激百會、內關、太沖與大椎穴可改善PSD大鼠神經(jīng)功能，調節(jié)PSD大鼠抑郁狀態(tài)，提高大鼠單胺類神經(jīng)遞質及神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，其作用機制可能與上調CREB/BDNF/TrkB信號通路有關。未來研究中，可對電刺激治療PSD的具體下游機制及神經(jīng)修復情況進行進一步探索研究，為臨床治療PSD提供更可靠、更明確和更具實踐意義的臨床診療依據(jù)及研究基礎。