劉 鑫,孫 嬌,岳炳南,李曉璐,劉清國(guó)

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

自發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)通常簡(jiǎn)稱為高血壓，是心血管疾病發(fā)病率和死亡率的主要危險(xiǎn)因素，現(xiàn)代研究表明血壓升高和交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)是高血壓的主要特征之一[1]。研究表明向正常血壓大鼠下丘腦室旁核(PVN)中微量注射促炎細(xì)胞因子白介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)或腫瘤壞死因子(Tumornecrosis factor-α，TNF-α)可以引起血壓和大鼠交感神經(jīng)活性增加[2]。神經(jīng)炎癥主要以小膠質(zhì)細(xì)胞激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子增加為特征。小膠質(zhì)細(xì)胞上有著一系列P2X嘌呤家族的受體，其中P2X7受體可以通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β、TNF-α等的釋放[3]。研究發(fā)現(xiàn)電針可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X7受體的表達(dá)[4-5],還可以影響胰島素抵抗模型大鼠下丘腦的PI3K、AKT2信蛋白表達(dá)[6]，影響PI3K/AKT通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，抑制高血壓心肌肥厚[7]。但電針對(duì)高血壓中樞調(diào)節(jié)研究?jī)?nèi)容較少，機(jī)制尚不明確，因此本研究通過觀察電針“太沖”“曲池”對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)模型下丘腦室旁核P2X7受體表達(dá)及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子的影響，探究電針對(duì)血壓的中樞調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40只，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠10只，雄性，9周齡，體質(zhì)量(220±30)g。所有大鼠均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室,室溫控制在20～25℃，相對(duì)濕度50%～55%，每日自由進(jìn)食及飲水[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料和墊料均購(gòu)自“北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心”，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將WKY大鼠10只作為空白對(duì)照組(W)。SHR大鼠用完全隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(M)、假手術(shù)組(J)、電針組(Z)和抑制劑+電針組(B)，每組10只。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照世界衛(wèi)生組織“涉及動(dòng)物生物醫(yī)學(xué)研究國(guó)際指導(dǎo)原則”進(jìn)行，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：BUCM-4-2020122802-4126。

1.2 主要儀器與試劑

漢醫(yī)牌針灸針(北京漢醫(yī)醫(yī)療器械)；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀:LH200H(聯(lián)創(chuàng)科技集團(tuán)南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)；XH200型恒溫式無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(北京眾實(shí)科技有限公司)；DW-2000 腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；套管系統(tǒng)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；微量注射泵(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(北京翔意信科數(shù)碼科技有限司)；Leica UC7超薄切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；Beckman Coulter生化分析儀(Au5800，美國(guó)Beckman Coulter Co.)；ELISA 定量檢測(cè)試劑盒(慧佳生物科技有限公司)；P2X7受體抑制劑A438079(28209-1-AP),人工腦脊液(北京愛必反生物科技有限公司,CZ0516)。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 PVN雙極套管置入術(shù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，假手術(shù)組、抑制劑+電針組大鼠均進(jìn)行PVN雙極套管植入術(shù)操作。術(shù)前6 h禁食不禁水，根據(jù)大鼠體質(zhì)量腹腔注射相應(yīng)劑量的3%的戊巴比妥鈉(30 mg戊巴比妥鈉/kg)麻醉大鼠，確定麻醉成功后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀使用顱鉆打孔，根據(jù)既往研究[8-9]確定大鼠PVN的坐標(biāo)位置為：前囟點(diǎn)后1.8 mm，矢狀縫兩側(cè)0.4 mm，距顱頂7.9 mm。然后將雙極套管植入PVN，套管至顱頂后下降7.9 mm，并擰上導(dǎo)管帽。最后于固定孔中植入螺絲，利用牙科水泥固定套管與螺絲，局部再次消毒，盡可能縫合創(chuàng)面，并予以青霉素注射。將大鼠放置于恒溫37 ℃的電熱毯維持，待大鼠蘇醒后放回籠子飼養(yǎng)，術(shù)后5 d連續(xù)給予腹腔注射青霉素抗炎(40萬(wàn) U/kg)預(yù)防感染。所有手術(shù)均在麻醉及無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3.2 給藥 分別在假手術(shù)組、抑制劑+電針組用微量注射器注射人工腦脊液(pH=7.4)、P2X7受體抑制劑A438079(10 μmol)，一側(cè)PVN每次給藥劑量為100 nL。每間隔12 h給藥干預(yù)，連續(xù)給藥14 d?？瞻捉M、模型組與電針組：不做任何極套管植入術(shù)及給藥處理。

1.3.3 針刺干預(yù) 電針組、抑制劑+電針組：將大鼠抓取固定后，取雙側(cè)“太沖”“曲池”穴，定位：于后肢足背1、2趾骨間凹陷處取“太沖”穴；于前肢橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中取“曲池”穴，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材(林文柱、王佩編)。針具選用中研太和牌一次性0.25 mm×13 mm毫針，直刺 “太沖”“曲池”穴1～2 mm。針刺時(shí)讓大鼠完全鉆入鼠套內(nèi)固定，以便于操作。得氣后，同側(cè)“太沖”“曲池”分別連接韓式電針儀的正負(fù)極，刺激強(qiáng)度為電流強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz，留針20 min，每日1次，干預(yù)14 d?？瞻捉M、模型組和假手術(shù)組：每天抓取1次，鉆入鼠套內(nèi)固定20 min，不做任何針刺干預(yù)，持續(xù)至針刺第14天。所有抓取、固定和針刺操作均由同一人完成。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.4.1 血壓監(jiān)測(cè) 在室溫(22±2)℃條件下，將清醒狀態(tài)下的大鼠于36 ℃下預(yù)熱(用溫控器調(diào)節(jié)溫度恒定)約15 min，用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠安靜、清醒狀態(tài)尾壓，連續(xù)測(cè)量3次，取其均值，避免噪音等外界環(huán)境刺激對(duì)血壓的影響。于針刺的第0天(即針刺前1 d)及針刺第2、4、6、8、10、12、14天，每天上午8點(diǎn)至12點(diǎn)固定時(shí)間段測(cè)量血壓值，以減少誤差。正式測(cè)壓前訓(xùn)練若干次，每天測(cè)血壓訓(xùn)練1次，連續(xù)3 d。注意：測(cè)壓過程動(dòng)作要輕柔，不能激惹大鼠，以免引起血壓波動(dòng)。加溫時(shí)間不能過長(zhǎng)，要固定在15 min；網(wǎng)套尺寸要合適，避免大鼠掙脫；尾套尺寸要合適，以免影響血壓；室溫要恒定，避免過高或過低對(duì)血壓造成影響。

1.4.2 取材 大鼠成功麻醉后，每組分別取4只先用200 mL生理鹽水由心臟灌注，待流出液體澄清后再用200 mL 4% 多聚甲醛灌注，取全腦組織并放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，然后取下丘腦制備石蠟切片(厚5 μm)；剩余6只腹主動(dòng)脈取血后處死，斷頭，取下丘腦PVN放置于PE管內(nèi)，快速放入液氮速凍，并于-80 ℃保存。

1.4.3 PVN免疫組化 采用免疫組化法檢測(cè)大鼠下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)情況，將石蠟切片常規(guī)脫蠟、入水，枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)，使用PBS液充分覆蓋涂片漂洗后，依次使用PBS配置0.5%Triton、3%BSA進(jìn)行破膜15～20 min及封閉30 min；加入適量P2X7R一抗4 ℃孵育24～48 h，再次漂洗后加入熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h；使用核酸染料DAPI或Hoechst，37 ℃避光孵育5 min；漂洗后用磷酸甘油溶液封片。奧林巴斯全自動(dòng)切片掃描顯微鏡(SV120)采集圖片，計(jì)算抗原表達(dá)的平均光密度，每個(gè)部位測(cè)5個(gè)視野，取平均值定量分析。

1.4.4 Western blot檢測(cè) 利用Western-Blot法驗(yàn)證PI3K/AKT通路相關(guān)因子PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況。操作方法：在液氮中速凍的靶腦區(qū)組織中，加入RIPA蛋白裂解液裂解組織和提取靶腦區(qū)PI3K、AKT蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)蛋白濃度各組一致，加入上樣緩沖液待測(cè)。配膠，等量樣品上樣，在80 V電壓下SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，然后將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上電泳，封閉，10×TBST洗滌，一抗孵育，10×TBST洗滌，二抗孵育，滴加發(fā)光液曝光顯影。用圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以對(duì)照組的面積灰度值為1.0與實(shí)驗(yàn)各組進(jìn)行比較和定量分析，所得的值即代表某種目標(biāo)的相對(duì)含量。

1.4.5 ELISA 檢測(cè) 腹主動(dòng)脈采血法取各實(shí)驗(yàn)組大鼠動(dòng)脈血，取血漿4 ℃離心20 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-1β、IL-10含量。詳細(xì)方法根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后收縮壓比較

如表1，治療前后與空白組比較，其余各組大鼠收縮壓均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療14 d后與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組收縮壓顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，假手術(shù)組收縮壓變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，治療14 d后，抑制劑+電針組收縮壓降低更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠電針治療前后收縮壓比較

2.2 各組大鼠下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)情況比較

治療14 d后，與空白組比較，模型組和假手術(shù)組下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),假手術(shù)組下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，抑制劑+電針組下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表2。

表2 各組大鼠下丘腦室旁核P2X7受體的平均光密度值比較

圖1 各組大鼠下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色法，400×)

2.3 各組大鼠下丘腦PVN中PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較

治療14 d后，與空白組比較，模型組下丘腦PVN中PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01),假手術(shù)組下丘腦PVN中PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組下丘腦PVN中PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，假手術(shù)組下丘腦PVN中PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，抑制劑+電針組下丘腦PVN中PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量降低更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療14 d后，與空白組比較，模型組和假手術(shù)組下丘腦PVN中AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組下丘腦PVN中AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，假手術(shù)組下丘腦PVN中AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，抑制劑+電針組下丘腦PVN中AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量降低更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組大鼠下丘腦PVN中PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況

表3 各組大鼠下丘腦PVN中PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況比較

2.4 各組大鼠血清中IL-1β、IL-10濃度變化

治療14 d后與空白組比較，模型組血清IL-1β濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),假手術(shù)組血清IL-1β濃度升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組血清IL-1β濃度顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，假手術(shù)組血清IL-1β濃度變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，抑制劑+電針組血清IL-1β濃度下降更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療14 d后與空白組比較，模型組和假手術(shù)組血清IL-10顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組血清IL-10濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，假手術(shù)組血清IL-10濃度變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與電針組比較，抑制劑+電針組血清IL-10濃度升高更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、IL-10濃度比較

3 討論

高血壓的發(fā)生涉及包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)在內(nèi)的不同器官系統(tǒng)的復(fù)雜整合。中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是下丘腦與高血壓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[10]。下丘腦的室旁核(Paraventricular nuc-leus，PVN)作為神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)這兩大系統(tǒng)的整合部位，在調(diào)節(jié)機(jī)體呼吸、血壓和心血管活動(dòng)等方面起了非常重要的作用，是控制血壓的關(guān)鍵樞紐[11]。下丘腦室旁核炎性細(xì)胞因子(Inflammatory cytokines in paraventricular nucleus，PIC)對(duì)交感神經(jīng)興奮性有重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)[12]，高血壓時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)PIC顯著高于基礎(chǔ)水平，并在高血壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究報(bào)道將TNF-α和IL-1β注入穹窿下器可顯著激活外周交感神經(jīng)活動(dòng)[13],正常大鼠中樞給予TNF-α后，可通過升高外周血液中去甲腎上腺素(Noradrenaline，NE)水平而增強(qiáng)交感神經(jīng)活動(dòng)。SHR大鼠室旁核炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)增高，抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)降低，經(jīng)雙側(cè)室旁核連續(xù)4周輸注TNF-α阻滯劑后發(fā)現(xiàn)血壓降低并改善心肌肥大[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可導(dǎo)致促炎性因子的釋放，小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7受體可通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，并參與神經(jīng)炎癥，促進(jìn)炎性因子的釋放[15-16]。研究表明電針可提高大鼠血漿中Ghrelin、NO濃度,從而激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,達(dá)到降壓和保護(hù)血管內(nèi)皮的效果[17]。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)高血壓病名，高血壓根據(jù)其癥狀特點(diǎn)多歸納于“頭痛”“眩暈”“肝風(fēng)”“肝陽(yáng)上亢”等范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗酚涊d：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，為中醫(yī)治療高血壓提供了理論依據(jù)。而針刺治療高血壓以降壓效果穩(wěn)定且無(wú)明顯副作用為優(yōu)勢(shì)，得到廣泛的推廣和關(guān)注。大量實(shí)驗(yàn)研究表明[18-20]，針刺可以改善SHR大鼠的心、腦和腎等靶器官損傷情況。方志堅(jiān)等臨床觀察針刺治療88例急癥高血壓患者，其降壓效果顯著，并降低患者神經(jīng)功能缺損率[21]。太沖穴為肝經(jīng)原穴，功擅平肝潛陽(yáng)、行氣解郁，是治療高血壓的要穴，曲池穴為大腸經(jīng)合穴，功擅清熱止痛、調(diào)和氣血和舒經(jīng)通絡(luò)。研究表明[22]，針刺治療高血壓使用頻次前二的腧穴依次為太沖和曲池。因此本實(shí)驗(yàn)選用電針SHR大鼠雙側(cè)太沖、曲池的干預(yù)方法，研究其相關(guān)的降壓機(jī)制。

本研究中筆者選用自發(fā)性高血壓大鼠為模型作為研究對(duì)象，以下丘腦PVN為切入點(diǎn)，運(yùn)用將P2X7受體抑制劑注入下丘腦PVN并結(jié)合電針為干預(yù)手段，探討電針調(diào)控血壓的中樞降壓機(jī)制。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，干預(yù)前后與模型組比較，假手術(shù)組相收縮壓并無(wú)明顯變化，并且干預(yù)后檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PVN雙極套管置入術(shù)對(duì)本研究并無(wú)影響。干預(yù)后與模型組比較，電針組和抑制劑+電針組大鼠的收縮壓、下丘腦PVN中P2X7受體以及PI3K、AKT蛋白表達(dá)量和血清中IL-1β含量顯著降低，血清中IL-10含量顯著升高，說(shuō)明電針可以通過降低P2X7受體以及PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)降壓的目的，同時(shí)血清中促炎因子IL-1β含量降低、抗炎因子IL-10含量升高，改善了因高血壓導(dǎo)致的神經(jīng)炎性癥狀。干預(yù)后與電針組比較，抑制劑+電針組降壓效果更明顯，各項(xiàng)生化指標(biāo)相應(yīng)良性變化更明顯，盡管下丘腦PVN中P2X7受體表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從其表達(dá)量不難看出具有下降的趨勢(shì)，因此在靶向抑制P2X7受體的情況下，更能進(jìn)一步說(shuō)明電針可以通過良性調(diào)控P2X7受體以及PI3K/AKT通路上相關(guān)蛋白因子的表達(dá)的途徑來(lái)降低血壓并改善炎性癥狀。

綜上所述，筆者可以推斷電針可以通過良性調(diào)控下丘腦PVN中P2X7受體以及PI3K/AKT通路上PI3K、AKT蛋白和IL-1β、IL-10的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)降壓的目的，這可能是電針治療高血壓的中樞降壓機(jī)制之一。