文培培,高 宇,王曉云,劉益兵,池紅萬

(鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)屬于慢性、系統(tǒng)性及免疫性疾病，病理特征是滑膜組織存在慢性炎性增生可導致不可逆的軟骨損傷[1]。全球范圍內(nèi)RA發(fā)病率較高，發(fā)病人群為女性多發(fā)，致殘率可高達20%，嚴重威脅患者身心健康[2]。到目前為止，RA的發(fā)病原因尚不清楚，但認為與免疫系統(tǒng)、感染等多種復雜原因相關。相關研究表示，滑膜細胞異常增殖是RA病發(fā)過程的主要原因，因滑膜細胞存在與腫瘤細胞相似特性可釋放大量炎性因子致滑膜組織增生肥大并促使VEGF表達增加血管翳形成進一步加重病情[3]。近年相關研究表示，RA發(fā)生發(fā)展與多種信號通路異常相關，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)在RA中異常表達，可作為細胞內(nèi)信號傳導信使作用于不同蛋白而發(fā)揮細胞活性調(diào)節(jié)作用[4]。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1，SphK1)是在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)的鞘氨醇激酶,能夠通過磷酸化Sp生成S1P，促進腫瘤細胞存活及增殖[5]。在RA疾病中已經(jīng)證實SphK1/S1P/S1PR1信號通路表達激活發(fā)揮促炎作用。

針灸治療RA歷史悠久，針灸治療方法具有多樣性，例如蜂針、溫針與電熱灸等。在RA中溫針具有疏經(jīng)通絡、散寒利濕等作用，已經(jīng)證實能夠改善RA疾病并受到醫(yī)學界廣泛認可[6]。豨薟草屬于草本植物，主要生長在我國東北及華北，具有祛風濕、通經(jīng)絡與清熱解毒等功效，常被用來治療風濕麻痹、肢體麻木及中風等疾病[7]。目前針灸聯(lián)合中藥成為醫(yī)學界治療RA的研究熱點，本研究基于此觀察溫針療法聯(lián)合豨薟草對RA大鼠滑膜細胞活性及SphK1/S1P/S1PR1信號的影響，為RA治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

SPF級SD雌性大鼠，鼠齡6周，共50只均選自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量200～300 g，許可證號：SCXK(浙)2019-000l，濕度為55%，溫度25 ℃，模擬黑白交替無菌飲食2周，定時清洗、消毒鼠籠，實驗要求符合《實驗動物管理條例》規(guī)定管理規(guī)定。本實驗嚴格按照科技部[(2006)398號]《關于善待實驗動物的指導性意見》文件要求進行實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器

豨薟草藥材飲片(亳州市仁惠堂中藥材銷售有限公司，批號：190807)，樣品經(jīng)本省藥品監(jiān)督檢驗研究院主任藥師鑒定為菊科植物豨薟草(HerbaSiegesbec-kiae)；試劑：弗氏不完全佐劑(北京伊塔生物科技有限公司，F(xiàn)5506)；SPHK1單抗(卡梅德生物，KMPH5200);S1PR1單抗(艾美捷科技有限公司 ，QrPrEST23593)；ERK1/2抗體(上海雅吉生物科技有限公司 ，s-0022R)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，F(xiàn)B8025)；胎牛血清[愛必信(上海)生物科技有限公司]；0.25%胰蛋白酶(上海信裕生物科技有限公司，XY6020)；噻唑藍MTT試劑(北京索萊寶科技有限公司，M8180-1)，二甲基亞砜(DMSO)(北京德航五洲科技有限公司 ，MB1315T)；0.30 mm×15 mm華佗牌毫針(河南省安邦衛(wèi)材有限公司，00056)；DB022型足趾容積測量儀(北京智鼠多寶生物科技有限責任公司，1545125)；蛋白電泳儀(北京六一，DYY-7C)。

1.3 豨薟草提取物的制備

將豨薟草藥材干燥后粉碎，在1 kg的藥物中加入8 L 95%濃度的醫(yī)用酒精過夜，加熱回流2次，采用等體積的80%的醫(yī)用酒精提取藥物殘渣，經(jīng)過濾、濃縮、水浴及蒸干后得到總提取物212 g，0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液稀釋至所需濃度。

1.4 RA模型建立

RA模型建立參考文獻[6]，取2 mg的牛Ⅱ型膠原溶于2 mg的0.5 mol/L乙酸中，4 ℃下靜置24 h溶化，再取相同劑量的弗氏不完全佐劑冰浴下制成乳化劑。大鼠腹腔注射0.3 mL/100 g濃度為10%的戊巴比妥鈉麻醉后，取0.1 mL的上述乳化劑在大鼠足底部位皮下接種，1次/d，連續(xù)21 d。建模后大鼠足部明顯紅腫、體積增大，表明建模成功。

1.5 分組及干預方法

將50只大鼠按照隨機數(shù)字法分為正常組、RA組、溫針組、藥物組及聯(lián)合組，各10只。除正常組外其余大鼠均建立RA大鼠模型。建模成功后，溫針組大鼠進行溫針治療：固定大鼠穿自制鼠衣，穴位參考中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”，穴位包含足三里、腎盂與懸鐘,采用0.30 mm×15 mm的毫針針刺上述部位，深度約為5 mm，強度以大鼠耐受為度，采用香煙型純艾條在距離的2 cm處進行懸灸。1次/d，1次5min，連續(xù)治療21 d。藥物組灌胃1.6 g·kg-1的豨薟草提取物，每次灌胃1次，連續(xù)21 d。聯(lián)合組溫針治療后灌胃豨薟草提取物，其余組灌胃同體積的生理鹽水。

1.6 大鼠足部體積檢測

干預后14 d、18 d及21 d采用排水法檢測各組大鼠足部體積，具體方法：將大鼠足部插入灌滿水的特制量筒中，保持水面與膝關節(jié)上2 cm持平，從量筒側(cè)口接排出的水，水的體積則為所測大鼠足跖部的體積。每只大鼠每次分別測量3次，取其均值。

1.7 HE染色觀察滑膜組織病理形態(tài)

上述實驗完成后，選用2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，取左足跖關節(jié)組織石蠟包埋，10%的甲醛溶液中，固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14%的EDTA溶液中脫鈣，逐層脫水與石蠟包埋后4 μm切片后備用。各組大鼠牙髓組織切片放入37 ℃復溫15 min，二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%及75%乙醇進行逐層脫水，蘇木精染色10 min，鹽酸(1%)處理，伊紅復染，100%-95%-85%及75%乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.8 滑膜細胞分離提取

提取各組大鼠滑膜組織，去除脂肪及纖維組織，在含有100 KU/L的青霉素及100 mg/L的鏈霉素的D-Hanks液沖洗3次，后剪碎1～3 mm3的小塊，加入濃度為2%的4 mL的Ⅱ型膠原酶DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，將未貼壁的細胞移至離心管中，按1 500 r/min，離心15 min，棄上清加入0.25%的胰蛋白酶40 mL消化10 min，再次離心，加入D-Hanks液制成單細胞懸液進行計數(shù)。

1.9 MTT法檢測各組滑膜細胞存活率

6孔板中每孔均加入150 μL滑膜細胞懸液，數(shù)目5×103，每組設置6孔，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，遮光條件下加入200 μL的DMSO溶液，輕微搖晃15 min后促使充分溶解后，在24 h、48 h、72 h及96 h時應用波長490 nm檢測吸光度(OD值)。

1.9.1 Hoechst檢測各組滑膜細胞凋亡率 用24孔板培養(yǎng)各組細胞，滑膜細胞數(shù)目分別為1×105，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入濃度為5 mg/L的Hoechst熒光材料染色，在細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡觀察到凋亡細胞呈現(xiàn)顆粒熒光，未凋亡呈現(xiàn)低密度熒光，隨機拍照選擇5個高倍鏡視野，應用ImageJ1.47i軟件計算平均熒光強度，實驗重復5次，凋亡率=凋亡細胞/細胞總數(shù)×100%。

1.9.2 免疫印跡檢測各組滑膜細胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白表達 各組滑膜細胞移入孔6板中，細胞濃度為2.5×104個mL，PBS沖洗，加入150 μL RIPA的裂解液，12 000 r/min離心15 min后，放入樣孔中，進行電泳實驗。PVDF膜TBS浸泡10 min，反復PBS沖洗，5 min/次，加入SPHK1(1∶1 000)及S1PR1(1∶1 000)及ERK1/2(1∶1 000)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)，TBS沖洗3次后，加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔(1∶5 000)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS23.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進行分析，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差描述，多組間比較采用方差分析，事后檢驗采用Bonferroni法進行組間兩兩比較，統(tǒng)計學檢驗設定的水準為0.05，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足部體積比較

與正常組比較，RA大鼠治療14 d、18 d及21 d的足部體積均升高(P<0.05)，與RA組比較，溫針組、藥物組及聯(lián)合組大鼠治療14 d、18 d及21 d的足部體積均降低(P<0.05)，與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組大鼠足部體積降低(P<0.05)，其余自制差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠關節(jié)病理組織形態(tài)比較

正常組大鼠踝關節(jié)面光滑、滑膜完整、無炎癥浸潤及水腫;RA組大鼠踝關節(jié)炎性細胞浸潤嚴重，滑膜組織增厚，關節(jié)腔隙狹窄及軟骨破壞;溫針組及藥物組大鼠踝關節(jié)炎性浸潤減少，滑膜增生降低;與藥物組相比，聯(lián)合組大鼠踝關節(jié)滑膜厚度未見增厚,炎性細胞浸潤減少。見圖1。

表1 各組大鼠足部體積比較

圖1 各組大鼠關節(jié)病理組織形態(tài)比較(200×)

2.3 滑膜細胞生長

滑膜組織中分離的滑膜細胞在24 h時細胞的分布較為稀疏，呈現(xiàn)細紡錘形生長，48 h時細胞間細長的突起相連并交織成網(wǎng)狀排列，單層生長，細胞核明顯，可進行傳代。見圖2。

圖2 24 h及48 h滑膜細胞生長(200×)

2.4 MTT法檢測各組滑膜細胞存活

MTT結(jié)果顯示：與正常組比較，RA組24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細胞OD值升高(P<0.05);與RA組比較，溫針組24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細胞OD值均降低(P<0.05);與溫針組比較，聯(lián)合組細胞OD值明顯較低(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

組內(nèi)不同時間相比，正常組的24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細胞株存OD值差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其余組別滑膜細胞OD值隨著時間延長而不斷升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組滑膜細胞24 h、48 h、72 h及96 h細胞OD值比較

2.5 各組滑膜細胞凋亡率比較

正常組、RA組、溫針組、藥物組及聯(lián)合組的滑膜細胞凋亡率分別為(2.54±0.60)%、(2.88±0.55)%、(12.55±1.47)%、(13.03±1.32)%及(20.14±3.05)%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=202.400，P<0.001)。進一步兩兩比較，與RA組比較，溫針組滑膜細胞凋亡率升高(P<0.05);與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組凋亡率升高(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.6 各組滑膜細胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比較

與正常組比較，RA組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白升高(P<0.05);與RA組比較，溫針組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白均降低(P<0.05);與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白更低(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖4。

圖3 各組大鼠滑膜細胞凋亡比較(200×)

圖4 各組滑膜細胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白比較

表3 各組滑膜細胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比較

3 討論

類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種類屬于骨科和風濕免疫科的關節(jié)疾病。研究顯示，患有類風濕性關節(jié)炎病程較久的患者會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)臟損傷等問題[8]。類風濕性關節(jié)炎在臨床上普遍具有病程較長、遷延不愈的特點，且目前并未實現(xiàn)對類風濕性關節(jié)炎徹底攻克，患者致殘率極高，對患者自身、家庭帶來了沉重的心理負擔和經(jīng)濟負擔。對RA的治療臨床以藥物為主，且溫針是我國傳統(tǒng)治療方式之一，經(jīng)絡與五臟六腑之間關聯(lián)密切，經(jīng)大量學者證實溫針能夠發(fā)揮改善RA疾病[9]。本研究通過將溫針聯(lián)合豨薟草證實能夠抑制滑膜細胞活性而發(fā)揮改善作用,主要與抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相關。

本研究證實，聯(lián)合組大鼠干預14 d、18 d及21 d時的足部體積均降低，HE染色結(jié)果證實，能夠抑制滑膜組織增厚改善關節(jié)組織紊亂，說明溫針聯(lián)合豨薟草對RA發(fā)揮抗炎修復作用。大鼠建立RA模型后經(jīng)過Ⅱ型膠原誘導以及寒冷刺激后，大鼠的踝關節(jié)組織細胞層變厚，白細胞和淋巴細胞等大量充斥于視野，維持細胞間的絨毛減少，細胞間的連續(xù)性減弱，提示細胞炎性狀態(tài)明顯增加而導致足部體積增加[10]。目前RA的治療西藥有甲氨蝶呤、萘普生等能夠抑制關節(jié)癥狀，但是西藥毒性作用較大,因而采用中醫(yī)治療成為研究熱點。RA在中國屬于“尪痹”“痹證”等范疇，病因與脾胃虛弱、陽氣不足、衛(wèi)外無力和風寒濕火等因素相關[11]。豨薟草作為我國的傳統(tǒng)中藥，按照現(xiàn)代藥理學研究具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心腦血管損傷及心血管保護作用。已經(jīng)被證實能夠發(fā)揮抗風濕性關節(jié)炎、腰間盤突出等疾病作用。豨薟草能夠降低RA大鼠足部體積，通過作用抑制炎性因子表達而改善骨關節(jié)破壞，從而降低大鼠足部體積[12]。RA的產(chǎn)生與邪氣內(nèi)存、脾胃虛弱及氣血不足等相關，可采用溫針治療，達到補腎益氣、溫經(jīng)通絡除濕和標本兼治等作用[13]。溫針療法作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學的經(jīng)典外治法之一，集針刺穴位、溫熱和藥物刺激等于一體，與單純電針療法不同，除具備行氣、疏經(jīng)通絡作用外，還有溫通經(jīng)脈、祛濕溫寒和去結(jié)鎮(zhèn)痛之功。溫針療法刺激穴位使得經(jīng)氣運行、經(jīng)絡疏通，再借助艾灸的熱力給予溫熱性刺激，經(jīng)絡腧穴及溫熱效應相結(jié)合，更好達到溫通血脈、行氣活血止痛的功效，例如《靈樞·刺節(jié)真邪》曰：“脈中之血，凝而留之，弗之火調(diào)，弗能取之?！笔侵该}中血氣凝滯，無法運行周身，只能用火法驅(qū)寒，調(diào)順血脈。溫針針刺能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)脾胃、通暢氣機和通經(jīng)活絡等作用,溫針針刺腎俞能夠發(fā)揮強腰健骨作用，溫針針刺懸鐘仍是膽經(jīng)之穴,主骨所生病。穴位配合共奏補益功效達到正勝邪退之目的，改善癥狀[14-15]。

滑膜細胞增殖在RA發(fā)生發(fā)展中具有關鍵作用，本研究表明聯(lián)合組大鼠滑膜細胞增殖降低，說明溫針及豨薟草具有抑制滑膜細胞活性作用,可能機制與抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相關。在RA關節(jié)損傷后滑膜細胞可參與多種信號通路及對關節(jié)軟骨和周圍骨組織的損害，還可分泌多種細胞炎性因子而形成錯綜復雜的網(wǎng)絡，參與了RA病理生理過程[16]。S1P屬于細胞內(nèi)部第二信使，能夠發(fā)揮細胞活性調(diào)節(jié)作用。S1P的主要合成酶類為SphKs，包含SphK1和SphK2，SphK1具有抑制細胞凋亡及加快其存在作用[17]。在自身病理狀態(tài)下，SphK1可產(chǎn)生大量炎性因子，并可激活ERK1/2作用同時提高SphK14倍活性而增加滑膜細胞活性。S1PR1可隨著滑膜細胞增殖而表達升高，當減少S1PR1表達可進一步抑制S1P下游通路ERK1/2表達發(fā)揮抑制炎癥作用[18]。通過體外大鼠實驗證實，RA大鼠中炎癥因子可促進ERK1/2表達進一步激活SphK1表達而增加S1P生成，并當采用Erkl/2抑制劑SCH772984后SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性均降低，說明調(diào)節(jié)上述信號通路可抑制炎癥表達同時可減少滑膜細胞增殖。豨薟草提取物可通過抑制炎性細胞浸潤而減少滑膜細胞增生，表示改善炎癥細胞因子方式與抑制TRL4激活相關[19]。本研究結(jié)果證實，豨薟草可發(fā)揮抗炎作用,能夠恢復抗炎信號通路活性而顯著抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表達，提示其與抑制滑膜細胞活性相關。艾葉氣味芳香易燃，發(fā)揮溫經(jīng)通路、行氣活血及驅(qū)寒除濕作用，通過熱感滲透到皮肉筋骨之中，配合針刺療法而增加血流流速及血管擴張等作用，能夠加快關節(jié)新陳代謝。李琳琳[20]研究表示，消痹湯聯(lián)合溫針灸可以提高類風濕性關節(jié)炎患者免疫功能,減輕其疼痛癥狀。本研究證實溫針能夠抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表達而發(fā)揮抗滑膜細胞活性作用，研究機制可能在于溫針能夠散寒理氣、通經(jīng)活絡而發(fā)揮抗炎作用,與抑制ERK1/2激活和抑制SPHK1、S1PR1活性相關。

本研究受成本限制，未添加更多組別，實驗結(jié)果可能存在不足，后期本課題組會加強和其他相關研究單位合作，增加樣本量，細化實驗內(nèi)容，為RA的臨床治療提供參考依據(jù)。綜上所述,風濕性關節(jié)炎大鼠采用溫針療法聯(lián)合豨薟草干預可抑制滑膜細胞活性，改善大鼠足部體積，這可能與抑制SphK1/S1P/S1PR1信號轉(zhuǎn)導相關。