甜菜堿類離子液體化學(xué)修飾豬胰脂肪酶提升其酶學(xué)性能

魯澤平，裴新華，薛譽，張曉光，胡燚

（南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，材料 化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

化學(xué)修飾具有價格低廉、實驗所需時間短、操作便利等優(yōu)點，是對脂肪酶進行分子改性的一種重要手段[1]。目前的修飾劑主要依賴于一些小分子（酸酐、脂肪酸等）和大分子（聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物等），且修飾后的脂肪酶的酶學(xué)性能提升并不顯著，各項酶學(xué)性能也不能同時得到提升，不能夠滿足酶分子修飾多樣性的需求[1-3]。例如，Liu等[4]分別利用檸檬酸酐、鄰苯二甲酸酐和順丁烯二酸酐對氯過氧化物酶進行化學(xué)修飾，修飾改性后的氯過氧化物酶的催化效率分別提高了7%～53%，然而修飾后的酶有機溶劑耐受性卻發(fā)生了大幅度的降低。Jayawardena 等[5]利用苯甲酸酐對南極假絲酵母脂肪酶A（CALA）進行化學(xué)改性，修飾酶的熱穩(wěn)定性與儲存穩(wěn)定性得到了提升，但有機溶劑耐受性、選擇性卻發(fā)生了一定程度的降低。

離子液體是由陰陽兩種離子組成，在室溫下為一種液態(tài)的熔融狀的鹽。由于其可設(shè)計性與良好的理化性質(zhì)，離子液體在化學(xué)合成、生物催化等多個領(lǐng)域中表現(xiàn)良好的適用性[6-7]。離子液體對酶非常友好，離子液體作為酶催化的反應(yīng)介質(zhì)時，酶催化反應(yīng)的效率大大提高，反應(yīng)的區(qū)域/對映體選擇性也有所增加，當(dāng)反應(yīng)底物為高極性底物時，離子液體優(yōu)越性更是十分明顯[8-10]。在以離子液體為溶劑的酯交換和酯水解反應(yīng)中，酶的活性和穩(wěn)定性都有所提高，可能是因為離子液體對酶的活性構(gòu)象起到了積極的作用[11-12]。故本文選擇離子液體為修飾劑，以期更好地提高脂肪酶酶學(xué)性能。

甜菜堿作為代謝的次生產(chǎn)物，是非常重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[13-14]。有文獻報道，甜菜堿類離子液體可以作為反應(yīng)介質(zhì)參與一系列的化學(xué)反應(yīng)。例如，Zhu 等[15]合成了一系列不同陰離子的甜菜堿離子液體，將其運用到Hantzsch反應(yīng)的催化性能研究中，結(jié)果表明，在溫和條件下，這些離子液體對一鍋法制備吖啶二酮的Hantzsch反應(yīng)具有較高的選擇性，其中乳酸甜菜堿的催化活性最高。

本文作者課題組前期工作設(shè)計合成了多種離子液體用以修飾脂肪酶，展現(xiàn)出離子液體作為酶的新型修飾劑的優(yōu)勢[16-20]。例如，徐超等[16]用手性脯氨酸類離子液體化學(xué)修飾PPL，結(jié)果表明，經(jīng)過[BMIM][N-AC-L-pro]修飾后的PPL展現(xiàn)出最佳的酶學(xué)性能，在酶活提高了1.0 倍的同時，熱穩(wěn)定性提高了2.6 倍（50℃，2.5h），對映體選擇性提高了1.5 倍，在50%的二甲基亞砜中的穩(wěn)定性提高了0.7倍，且在不同溫度、pH下也展現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性與耐受性。Jia 等[17]利用不同鏈長、不同陰陽離子的咪唑類離子液體對南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）進行化學(xué)修飾。其中，[HOOCMMIm][Cl]修飾后的CALB 活性提高了1.5 倍，在70℃下保存2h的耐熱性提高了7.0倍，在50%的二甲基甲酰胺中耐受性提高了0.8倍，在50%甲醇溶液中耐受性提高了5.0倍。

本文利用離子液體的可設(shè)計性，設(shè)計并合成不同鏈長、不同陰離子的甜菜堿離子液體對豬胰脂肪酶（PPL）進行修飾，考察不同鏈長與陰離子對脂肪酶的活性與穩(wěn)定性的影響。預(yù)期得到能夠同時提高PPL的各項酶學(xué)性能的甜菜堿類離子液體，并探索其酶學(xué)性能變化機制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試劑：PPL；三硝基苯磺酸（50g/L）；BCA 試劑盒；33%二甲胺水溶液、氯代正丁烷、氯代正辛烷、氯代正十二烷、氯代正十六烷、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、對硝基苯酚棕櫚酸酯、對硝基苯酚、乙酸乙烯酯、N,N-羰二咪唑（CDI）、異丙醇、正己烷、丙酮、甲醇、二甲基亞砜（DMSO）皆為分析純；阿拉伯樹膠粉、牛血清蛋白、Triton-X100皆為生化試劑。

儀器：電子分析天平（BAS224S），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；透析袋（10kDa），南京圣比奧科技有限公司；振蕩恒溫/水浴鍋（WS20），德國WIGGENS公司；pH計（PHS-3C），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微量移液器（10-1000μL），德國Eppendorf 公司；熒光分光光度計（F-7000)，日本Hitachi 公司；圓二色譜儀（J-1500)，JASCO；高 效 液 相 色 譜（UltiMate3000)，Dionex；真空冷凍干燥機（SCIENTZ-12N)，寧波新芝生物科技股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀（MD190)，美谷分子儀器(上海)有限公司；低溫高速離心機（TCL-16MS)，上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 甜菜堿離子液體的合成

將0.01mol 氯代正丁烷（氯代正辛烷、氯代十二烷、氯代十六烷）加入到過量的33%二甲胺水溶液中；冰浴條件下反應(yīng)1h，然后在50～100℃下加熱回流24h；冷卻至室溫，用蒸餾水重復(fù)洗三次，得到黃色油狀液體；將氯乙酸和氫氧化鈉按照摩爾比1∶1.2混合攪拌反應(yīng)10min，然后將得到的氯乙酸鈉與等摩爾的黃色油狀液體在95℃條件下回流4h；得到的反應(yīng)液用過量的濃鹽酸處理，過濾收集濾渣；用乙醇、乙醚體積比為1∶10混合溶劑重結(jié)晶得到白色粉末狀離子液體。其中將氯代十六烷基甜菜堿離子液體加入到丙酮溶液中，分別加入過量的磷酸二氫鈉和氟硼酸鈉，在室溫條件下攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)液過濾除去沉淀，然后旋蒸除去丙酮溶液，得到H2PO4－和BF4－的十六烷基甜菜堿離子液體。

為了驗證離子液體作為修飾劑的優(yōu)越性，合成了十六烷基肌氨酸。將肌氨酸溶解在甲醇中，緩慢滴加二氯亞砜，得到油狀肌氨酸甲酯。將肌氨酸甲酯與氯代十六烷加入到甲醇溶劑中，加入少量的三乙胺作為縛酸劑，加熱回流12h，取反應(yīng)液旋干除去甲醇溶劑，用乙酸乙酯萃取，取有機相旋干得粗品，用丙酮和石油醚混合溶劑重結(jié)晶得十六烷基肌氨酸純品。

如圖1所示，修飾劑結(jié)構(gòu)由上往下依次為氯化丁基甜菜堿離子液體[BetaineC4][Cl]、氯化辛基甜菜堿離子液體[BetaineC8][Cl]、氯化十二烷基甜菜堿離子液體[BetaineC12][Cl]、氯化十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][Cl]、四氟硼酸根十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][BF4]、磷酸二氫根十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][H2PO4]、十六烷基肌氨酸Sarcosine。

圖1 修飾劑結(jié)構(gòu)

1.3 脂肪酶純化與化學(xué)修飾

（1）純化 取25mL PPL酶液粗品，在4℃環(huán)境下離心20min，轉(zhuǎn)速8000r/min，去除沉淀，取上清液于透析袋中，在冰浴條件下透析除鹽24h，中途每隔6h 換一次水，得到純化后的酶，置于冰箱中4℃條件下保存待用。

（2）化學(xué)修飾 稱取1mmol合成的甜菜堿類離子液體，加入等摩爾的羰基二咪唑（CDI），在2mL的無水二甲基亞砜的作用下磁力攪拌，室溫反應(yīng)2h 后停止，反應(yīng)完畢之后取400μL 的修飾劑加入到20mL 的酶液中，在冰浴條件下繼續(xù)磁力攪拌8h，修飾后的酶裝入10kDa的透析袋中，冰浴條件下透析24h，中途每隔6h換一次水，最后得到7種修飾酶，給修飾后的PPL 以如下方式進行命名:[BetaineC4] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC4] [Cl] -PPL，[BetaineC8] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC8] [Cl] -PPL，[BetaineC12] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC12] [Cl] -PPL，[BetaineC16] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC16] [Cl] -PPL，[BetaineC16][BF4]修飾的酶[BetaineC16][BF4]-PPL，[BetaineC16][H2PO4]修飾的酶[BetaineC16][H2PO4]-PPL， 十六烷基肌氨酸(Sarcosine) 修飾的酶SarcosineC16-PPL。

1.4 蛋白濃度、修飾度以及酶活測定

采用BCA 法測定蛋白濃度。配制不同濃度的牛血清蛋白(BSA)溶液，測定其在562nm 下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進而測定酶液中的蛋白濃度。

采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測定修飾度。TNBS 可以與未被修飾的賴氨酸反應(yīng)生成在304nm有特定光吸收的產(chǎn)物，通過測定該波長下的吸光度進而計算出修飾度。

采用對硝基苯酚法測定酶活。脂肪酶可以催化對硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）水解生成在410nm有特定光吸收的對硝基苯酚（p-NP），通過測定該波長下的吸光度進而計算出酶活。以單位時間內(nèi)催化水解底物對硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活單位（U）。

1.5 酶學(xué)性能測試

（1）最適pH測定 在各自37℃下，設(shè)置不同pH梯度的底物溶液6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，將稀釋后的酶溶液預(yù)熱5min后，取0.1mL加入到底物溶液反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束加入滅活劑（V乙醇∶V丙酮=1∶1），分別測定原酶與修飾酶酶活。

（2）最適溫度測定 在各自最適pH 下，設(shè)置不同的溫度梯度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，將稀釋后的酶溶液預(yù)熱5min 后，取0.1mL 加入到底物溶液反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束加入滅活劑（V乙醇∶V丙酮=1∶1），分別測定原酶與修飾酶酶活。

（3）熱穩(wěn)定性測定 將原酶與修飾酶分別保溫在60℃中，每隔10min 取出10μL 樣品在各自最適宜的條件下測其酶活。

（4）有機溶劑耐受性測定 將原酶與修飾酶分別在室溫下保存在含0～50%的二甲基亞砜中2h，樣品取出后在各自最適宜的條件下測試其酶活。

（5）酶動力學(xué)測定 將游離酶與修飾酶加入到9～30mg/mL的三乙酸甘油酯中，在各自最適宜的反應(yīng)溫度和pH下反應(yīng)3min，測定反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk 法求出PPL 的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）。

（6）對映體選擇性測定 如圖2所示，以α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)作為反應(yīng)模型，研究修飾前后PPL催化該反應(yīng)的對映體選擇性變化。將原酶與修飾酶用冷凍干燥機凍干，制成酶粉，稱取0.1g的酶粉置于50mL 的離心管中，加入10mL 正己烷溶液、0.05mol 苯乙醇和0.1mol 乙酸乙烯酯。放入水浴搖床中，在37℃、150r/min的條件下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束，利用高效液相色譜進行測定計算轉(zhuǎn)化率、對映體過剩值ee值、對映體選擇率E值等，計算如式(1)～式(6)。

圖2 酶促(R,S)-α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

由于底物中(S)-α-苯乙醇參與反應(yīng)量較小，因此底物ee值采用eeS來表示，而產(chǎn)物以(R)-乙酸苯乙酯為主，產(chǎn)物的ee值以eeR表示。

1.6 光譜結(jié)構(gòu)表征

（1）熒光光譜 室溫下，將原酶和修飾酶分別稀釋到濃度為100μg/mL，取3mL 酶液進行測定。測定條件為激發(fā)波長為295nm，激發(fā)和發(fā)射光柵均為5nm，掃面范圍280～400nm，在熒光分光光度計F-7000 FL Spectrophotometer上測量。

（2）圓二色譜 室溫下，取濃度為100μg/mL的酶液置于圓二色譜儀中測定。測定條件為樣品池光程為1cm，掃描波長范圍為190～260nm，掃描速度為50nm/min，以溶劑（去離子水）作為空白組自動矯正基線， 在圓二色譜儀JASCOJ810 Spectropolarimeter （Jasco Co., Japan）上測定，使用CDpro軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算出二級結(jié)構(gòu)的含量變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 原酶與修飾酶活性變化

2.1.1 pH對酶活的影響

測定不同pH 下原酶與修飾酶酶活的變化。如圖3 所示，原酶與修飾酶的最適pH 并沒有發(fā)生變化，而修飾酶在不同pH 下酶活均有了不同程度的提升，其中[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升最明顯。Hofmeister 效應(yīng)將離子分為K 型和C 型，kosmotropic離子具有較高的表面電荷和較強的水合能力[21-23]。將陰離子按照K 型由高到低排序為H2PO4->Cl->BF4-，據(jù)報道，當(dāng)離子液體的陽離子相同時，陰離子更加K 型，修飾酶酶活提升更為明顯[24]，這與實驗結(jié)果一致。此外，隨著離子液體中烷基鏈長的增加，修飾酶對pH 的敏感性降低，可能是因為較長的烷烴鏈可以更好地保護酶活性中心，使之能夠適應(yīng)較寬的pH 范圍。這與徐超等[16]利用手性脯氨酸類離子液體修飾PPL的修飾效果不同，經(jīng)過[BMIM][N-AC-pro]修飾后的PPL 最適pH在6.5，而通過[N-AC-pro][Cl]修飾后的PPL最適pH提高到7.5。

圖3 原酶與修飾酶在不同pH下的酶活

2.1.2 溫度對酶活的影響

在pH為7.0條件下，測定不同溫度下原酶與修飾酶的酶活。如圖4所示，在不同溫度下，修飾酶酶活較原酶均有不同程度的提升。其中，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升最為明顯，這與不同陰離子對酶的修飾效果差異相符合。40℃之前，原酶與修飾酶沒有明顯的差異；40℃之后，修飾酶酶活明顯升高，可能是因為在較低溫度時酶的活性中心不能被完全打開，影響了酶的催化活性。原酶達到最適溫度45℃之后，酶活隨著溫度的升高而降低，并且60℃之后酶幾乎失活，修飾酶達到最適溫度50℃之后，仍能夠保持較高的酶活，65℃之后酶活才發(fā)生明顯降低，可見修飾酶表現(xiàn)出更好的溫度耐受性。這可能與烷基化甜菜堿離子液體長鏈?zhǔn)杷Y(jié)構(gòu)有關(guān)，同時較長的烷烴鏈可以有效增強酶的剛性結(jié)構(gòu)[25-26]，兩者共同增強了修飾酶對溫度的耐受性。

圖4 原酶與修飾酶在不同溫度下的酶活

2.1.3 修飾度與酶活變化

在原酶與修飾酶各自的最適溫度與pH 下，測定其酶活。PPL上可供修飾的賴氨酸殘基有22個，且分布比較密集。如表1所示，不同鏈長的甜菜堿離子液體對PPL的修飾度有明顯的差異，隨著鏈長的增加，修飾度逐漸降低。可能是因為空間位阻較大的修飾劑在某種程度上會影響酶蛋白的修飾度[21]，因此經(jīng)[BetaineC16]修飾過的PPL 具有最低的修飾度。此外，修飾度的降低并沒有影響到酶活，隨著鏈長的增加，修飾酶酶活也隨之增大，[BetaineC16][Cl]-PPL 酶活提升了2.34 倍；經(jīng)過陰離子交換后，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升了2.44倍。此外，經(jīng)十六烷基肌氨酸修飾過的PPL酶活較原酶也有所提升，但是提升效果相比于離子液體并不明顯，由此也證明了酶分子改造中離子液體作為修飾劑的優(yōu)越性。

表1 原酶與修飾酶的修飾度與酶活

2.2 原酶與修飾酶穩(wěn)定性變化

2.2.1 熱穩(wěn)定性變化

熱穩(wěn)定性是酶在工業(yè)應(yīng)用中的關(guān)鍵因素。如圖5 所示，原酶在60℃下保存30min 后酶活幾乎喪失，而經(jīng)[BetaineC16]修飾的PPL 在60℃下保存45min 后仍能夠保留40%左右的酶活。結(jié)果表明，較長側(cè)鏈甜菜堿離子液體的引入可以讓酶具有較好的熱穩(wěn)定性，可能因為鏈長越長，甜菜堿離子液體的分子量越大，共價連接到酶分子上后可以穩(wěn)定酶的整體構(gòu)象，減少了酶分子在高溫環(huán)境中的熱振動，同時較長的側(cè)鏈增加了位阻，增強了酶分子的剛性結(jié)構(gòu)，能夠更好地保護酶活性中心，避免遭到高溫的破壞[27-28]。

圖5 原酶與修飾酶在60℃下的熱穩(wěn)定性

2.2.2 有機溶劑耐受性變化

酶的溶劑穩(wěn)定性一直是近年來的研究熱點，提高脂肪酶對有機溶劑的耐受性可以有效拓寬脂肪酶在實際環(huán)境中的應(yīng)用范圍。如圖6 所示，原酶在10%的強極性非質(zhì)子溶劑DMSO中酶活就出現(xiàn)了降低，在50%的DMSO中，原酶的酶活僅為初始酶活的18%。而修飾后的PPL在低濃度的DMSO中出現(xiàn)了不同程度的激活作用，當(dāng)DMSO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過20%之后，酶活緩慢降低，當(dāng)DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的時候，修飾酶仍能夠保持較高的酶活，其中[BetaineC16][H2PO4]-PPL 修飾酶仍能夠保持初始酶活的50%。這可能因為較長的疏水鏈能夠更好地保護酶的活性中心，讓其很難暴露在有機溶劑中，進而降低有機溶劑對酶的影響。

圖6 原酶與修飾酶在不同濃度的DMSO中的耐受性

2.3 原酶與修飾酶的酶動力學(xué)參數(shù)

Doumèche 等[21,29]采用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾后的甲酸脫氫酶在水溶性[MMIm][Me2PO4]體系中的Km值降低，酶的催化性能提升了2.29～10.21倍。本文作者課題組前期的研究中利用咪唑、膽堿類離子液體化學(xué)修飾PPL，修飾后PPL 的Km發(fā)生了改變， 其中經(jīng)過[HOOCBMIm][Cl]和[HOOCBMIm][H2PO4]修飾后PPL的Km值發(fā)生降低[18]。動力學(xué)測試結(jié)果如表2 所示，所有修飾酶的Km都比原酶低，并且隨著鏈長的增加，Km值越來越小?？傮w來說，[BetaineC16][Cl]-PPL 的底物親和力高于原酶，且優(yōu)于其他修飾酶，這可能是因為較長的柔性脂肪長鏈增加了其脂溶性，讓酶更容易與底物結(jié)合，并加快反應(yīng)速度；也可能是因為長鏈烷基化甜菜堿離子液體具有較強的疏水性，它的引入改變了活性中心附近的疏水環(huán)境，使底物與活性中心的親和力增加。此外，長鏈烷基化甜菜堿離子液體的引入增加了酶蛋白的剛性結(jié)構(gòu)，使得修飾酶較大程度上保持了PPL 的活性構(gòu)象[30]。

表2 原酶與修飾酶的動力學(xué)參數(shù)

2.4 原酶與修飾酶對映體選擇性變化

通過α-苯乙醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，考察了原酶與修飾酶的對映體選擇性的變化。表3 中數(shù)據(jù)顯示，所有修飾酶的總體轉(zhuǎn)化率和選擇率都比原酶的要高，其中，隨著甜菜堿離子液體的側(cè)鏈鏈長的增加，催化活性和對映體選擇性提升越明顯，[BetaineC16][H2PO4]-PPL的選擇率E為16.3，是原酶選擇率的3.0 倍?？傮w轉(zhuǎn)化率的大幅提升可能是因為較長的烷烴鏈具有較強的脂溶性，能夠使酶蛋白更好地與底物結(jié)合，從而更好地發(fā)揮催化活性；此外，較長的烷烴鏈具有更強的疏水作用，修飾酶的剛性結(jié)構(gòu)得到增強的同時能夠穩(wěn)定酶蛋白蓋子結(jié)構(gòu)打開狀態(tài)，使得底物能夠更好地進入到酶活性中心，從而提升修飾酶的選擇性[28]。

表3 原酶與修飾酶催化的(R,S)-1-乙酸苯乙酯的對映體選擇性水解

2.5 原酶與修飾酶光譜學(xué)結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 熒光光譜

熒光光譜的靈敏度較高，能夠反應(yīng)酶蛋白某些熒光基團附近環(huán)境的變化，因此被廣泛應(yīng)用于生化領(lǐng)域的研究中[31]。如圖7所示，修飾前后酶的最大吸收波長并沒有發(fā)生改變，而修飾酶的熒光強度較原酶熒光強度降低，并且修飾度越高的PPL熒光強度降低得越多，可能是某些具有熒光特性基團附近的賴氨酸被離子液體修飾，從而對熒光基團附近微環(huán)境產(chǎn)生了影響。此外還發(fā)現(xiàn)，不同陰離子的甜菜堿離子液體修飾的PPL熒光強度變化差異不大。

2.5.2 圓二色譜

利用圓二色譜對原酶與修飾酶二級結(jié)構(gòu)變化進行測定。如表4所示，修飾后PPL的α-螺旋含量明顯降低，而β-折疊含量有所上升，且隨著鏈長的增加，α-螺旋與β-折疊變化程度也在增大。α-螺旋含量的降低可能是因為離子液體的引入促進了PPL蓋子結(jié)構(gòu)的打開，使底物更好地與酶的活性中心結(jié)合，這也解釋了酶活提升的原因；β-折疊含量上升可能是因為離子液體的引入，增加了酶蛋白表面的剛性結(jié)構(gòu)，這與修飾酶熱穩(wěn)定性和有機溶劑耐受性等穩(wěn)定性酶學(xué)性能變化規(guī)律一致[32-34]。

表4 原酶與修飾酶的二級結(jié)構(gòu)含量

3 結(jié)論

用設(shè)計合成的不同鏈長與陰離子的甜菜堿離子液體對PPL進行化學(xué)修飾，修飾酶的酶活、熱穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性、對映體選擇性等酶學(xué)性能同時得到了不同程度的提升。不同鏈長的甜菜堿離子液體的修飾度不同，鏈長越長，修飾度越低。酶活測定結(jié)果顯示，修飾酶的酶活隨著修飾劑側(cè)鏈長度的增加而增大，且修飾度的差異給酶活帶來的影響并不明顯。原酶與修飾酶的動力學(xué)參數(shù)表明，所有修飾酶的Km比原酶低，且鏈長越長的離子液體修飾的PPL與底物的親和力越好，可能是因為甜菜堿離子液體的引入使得脂肪酶活性中心上的蓋子結(jié)構(gòu)更容易打開，從而表現(xiàn)出較高的活性。通過α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 的選擇性提高最為明顯，是原酶的3.0 倍。光譜學(xué)結(jié)構(gòu)表征表明甜菜堿類離子液體的引入導(dǎo)致了PPL的構(gòu)象發(fā)生了變化，α-螺旋含量的降低與β-折疊含量上升使修飾后的PPL具有更高的酶活與更穩(wěn)定的構(gòu)象，初步解釋了酶活和穩(wěn)定性變化的原因。

符號說明

A，AR，AS —— 總初始底物濃度、R-初始底物濃度、S-初始底物濃度

B，BR，BS —— 總底物剩余濃度、R-底物剩余濃度、S-底物剩余濃度

C總，CR，CS —— 總轉(zhuǎn)化率、(R)-α-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率、(S)-α-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率

eeR，eeS ——R-對映體過剩值、S-對映體過剩值

E—— 對映體選擇率

Km —— 酶反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度一半時底物濃度的大小

R，S——R-對映體、S-對映體

Vmax —— 最大反應(yīng)速率