巨家升,焦璐,周連玉*
(1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青海 西寧 810008;2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008;3.青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008;4.高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院,青海 西寧 810008)
硒是人體所必需的微量元素之一,具有抗氧化、抗癌、抗菌、增強(qiáng)免疫力等多重作用[1-2]。研究表明,人體的克山病、大骨節(jié)病、癌癥、心血管病、糖尿病、機(jī)體免疫力減弱和衰老等40余種疾病均與缺硒有關(guān)[3-4]。硒的化學(xué)形態(tài)有無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)兩種形式存在,無機(jī)態(tài)一般是指亞硒酸鈉和硒酸鈉,有機(jī)態(tài)以硒蛋白質(zhì)(功能蛋白質(zhì)及酶類)、硒多糖、硒核酸等形式存在。但是,無機(jī)硒的毒性很強(qiáng),吸收率又低;而有機(jī)硒安全性高,易被人體吸收利用,因此補(bǔ)充有機(jī)硒可以作為一種安全有效的補(bǔ)硒手段。
許多生物能將無機(jī)硒轉(zhuǎn)換為有機(jī)硒。研究表明,在培養(yǎng)體系中加入無機(jī)硒,微生物可以將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒從而利于人體吸收[5]。許多乳酸菌具有富集硒和轉(zhuǎn)化硒形態(tài)的能力[6],其獨(dú)特的益生性被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后形成的酸奶價格適中、口感清新,同時具備調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)腸胃蠕動、降低膽固醇的吸收、提高機(jī)體免疫力、適合乳糖不耐受人群飲用等特點(diǎn)。近年來,人們越來越注重身體健康,但市場上現(xiàn)有的乳制品中硒含量較低(0.005 5 μg/g),明顯低于生理需求量(40 μg/日)和膳食硒適宜量(50 μg/日)[7]。在牛乳或羊乳中不添加或添加硒化物作為乳酸菌生長的基質(zhì)上,接入富硒發(fā)酵劑或發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件制備成富硒酸奶,該酸奶具有優(yōu)良的理化特性和功能特性[8]。
牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后形成的酸奶既有獨(dú)特風(fēng)味,又有豐富的營養(yǎng)價值與保健作用,深受廣大消費(fèi)者青睞。酸奶品質(zhì)受原料、添加劑、發(fā)酵劑(菌株種類)、發(fā)酵溫度及時間、貯藏等多種因素的影響。
亞硒酸鈉作為硒源可應(yīng)用于藥品、食品等行業(yè)。張蓉等[8]在 10%脫脂復(fù)原乳中分別添加 40、50、60、70、80 μg/kg亞硒酸鈉,接入富硒青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵劑研制成酸奶,發(fā)現(xiàn)酸奶的感官總分變化趨勢為先略微上升再迅速下降,當(dāng)亞硒酸鈉添加量大于70 μg/kg時酸奶顏色微黃、口感發(fā)澀,可滴定酸度變化不明顯;結(jié)合酸奶中硒含量,確定亞硒酸鈉適宜的添加量為60 μg/kg。在牛奶中加入無機(jī)硒,再通過乳酸菌發(fā)酵研制出的富硒酸奶可能存在微毒的單質(zhì)硒。
為了避免單質(zhì)硒引起的危害,一些研究者采用生物轉(zhuǎn)化原理,如植物、酵母菌、食用菌,將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒,制成硒粉后添加到奶液中,再利用乳酸菌發(fā)酵制成具有保健功能的新型酸奶[9-11]。湯慶莉等[9]按照1∶5的體積比混合富硒銀杏葉和富硒玉米須的提取液,并制得富硒粉(總硒含量0.107 mg/L),將富硒粉以0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/mL 為添加梯度發(fā)酵酸奶,試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)富硒粉添加量>0.25 g/mL時,酸奶發(fā)酵不正常,酸奶表現(xiàn)為淡黃、無凝乳、有乳清析出、酸味不正等現(xiàn)象。接著降低富硒粉添加量(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL),以口感和酸度為指標(biāo)確定酸奶中富硒粉適宜添加量為0.10 g/mL~1.15 g/mL。曾鈺鵬等[10]使用12菌型酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵含有15%辣木葉提取液的牛乳時,通過感官評分和持水度評定富硒酵母添加量為 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%對酸奶的影響。富硒酵母添加量在0.02%~0.06%時持水度保持在62%~65%,酸奶的感官評分呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)富硒酵母的添加量在0.04%時,感官評分最高達(dá)到了83.4。此研究說明富硒酵母的添加量對酸奶的組織狀態(tài)影響較小,對感官品質(zhì)影響較大。總體上,含硒物質(zhì)種類、濃度對酸奶的酸度、感官品質(zhì)影響較大,在持水度方面影響較小。
一些研究者通過對保加利亞桿菌(Lactobacillus bulgaria)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)等乳酸菌進(jìn)行富硒發(fā)酵培養(yǎng),開發(fā)富硒酸奶[12-15]。乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸的途徑有同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵,不同菌種代謝產(chǎn)生乳酸及其他物質(zhì)存在差異。而接種量的多少,會影響乳酸菌的繁殖速度,進(jìn)而對酸奶的感官品質(zhì)產(chǎn)生影響。在辣木富硒低糖酸奶中分別接入0.08%、0.10%、0.12%、0.16%的12菌型酸奶發(fā)酵劑,持水度隨接種量上升變化幅度較?。?0%~72%),當(dāng)接種量為0.10%時酸奶的感官評分和持水度均達(dá)到最大值,分別為85.2分和72%[10]。結(jié)合單因素和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌富硒發(fā)酵劑,選擇1.5%~7.5%接種量接入牛奶發(fā)酵成酸奶,接種量為1.5%~4.5%時酸奶感官評分隨著接種量增加而增加,而4.5%~7.5%接種量時感官評分隨其增加呈下降趨勢;接種量為1.5%~7.5%時,酸度隨著接種量的增加而呈上升趨勢,為保證酸奶口味酸甜合適最終確定接種量為4.5%[8]。
乳酸菌的生長和代謝受營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH值等因素的影響。孫林超[12]使用富硒粉利用保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌制作富硒酸奶,分別在36、38、40、42、44℃進(jìn)行發(fā)酵,通過感官評分以及酸奶的酸度對其品質(zhì)進(jìn)行評價。結(jié)果顯示在40℃下發(fā)酵的酸奶酸度適宜,組織狀態(tài)良好,綜合評價好,風(fēng)味與一般酸奶無異。曾鈺鵬等[10]使用 12 菌型酸奶發(fā)酵劑在 39、42、45、48、51℃發(fā)酵辣木富硒低糖酸奶,發(fā)現(xiàn)51℃時酸奶發(fā)酵不成功,其他溫度均發(fā)酵成功。當(dāng)溫度為42℃時,酸奶感官評分與持水度最高;當(dāng)溫度小于或大于42℃時,持水度和感官評分持續(xù)下降,可見合適的發(fā)酵溫度有利于形成良好品質(zhì)的酸奶。
酸奶發(fā)酵時間與乳酸菌生長速度的快慢有關(guān)。張蓉等[8]通過單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),富硒酸奶發(fā)酵時間為5 h~7 h時,酸奶的感官總分呈增加趨勢,而后下降。富硒酸奶的酸度隨著發(fā)酵時間的延長而增加,在發(fā)酵時間為7 h感官總分最大,為8.0,此時的酸度為76.7°T。原因是在發(fā)酵過程中乳酸菌的生長在逐漸加快,在一定時期內(nèi)達(dá)到了指數(shù)生長期,致使酸奶的酸度上升明顯。
Alzate等[16]以富硒菌體作為發(fā)酵劑,設(shè)定酸奶發(fā)酵時間分為12、24 h和36 h,溫度為37℃~42℃,研究結(jié)果顯示發(fā)酵時間為12 h時硒的含量最高,發(fā)酵溫度為40℃時酸奶的組織狀態(tài)最佳,口感與風(fēng)味純正。結(jié)合這些學(xué)者的研究可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間可能還與不同的菌種有關(guān)。
諸多培養(yǎng)條件如硒濃度、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間、接種量和混合菌比例等都影響著酸奶的品質(zhì),各因素之間存在著相互作用。黃高明[14]采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化了富硒酸奶的制作工藝,研究培養(yǎng)溫度、富硒發(fā)酵劑接種量和加糖量對酸奶感官評分的影響。結(jié)果表明影響富硒酸奶品質(zhì)的主次因素為培養(yǎng)溫度>接種量>加糖量,最佳工藝條件為溫度42℃、富硒發(fā)酵劑接種量7%、加糖量6%。并經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度顯著影響酸奶的品質(zhì),接種量或加糖量對酸奶品質(zhì)無明顯作用。賈建波[17]選擇L16(45)正交水平試驗(yàn)優(yōu)化富硒酸奶發(fā)酵條件,以酸度為評價指標(biāo)得出最佳發(fā)酵條件:硒粉添加量為0.075%、蔗糖添加量為7%、羧甲基纖維素鈉使用量為0.20%、接種量為5%、發(fā)酵時間為3.5 h,在此條件下酸奶酸度最佳,組織狀態(tài)良好,有機(jī)硒含量為43.55 μg/100 g。張蓉等[8]在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到富硒酸奶的最優(yōu)發(fā)酵條件:奶粉12%,蔗糖5%,低聚異麥芽糖1%,亞硒酸鈉61.8 μg/kg,酪蛋白酸鈉1.4%,接種量為4.5%,發(fā)酵溫度為40℃,發(fā)酵時間為7 h。通過最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到的富硒酸奶凝乳完全,呈乳白色,具有酸奶固有口味和香味,酸甜合適、組織均勻、無乳清析出,感官總分為9.1,有機(jī)硒質(zhì)量比為29.2 μg/kg。此外,謝海軍等[18]采用氫氧化鈉法提取富硒平菇中的硒蛋白,以感官評價為指標(biāo),正交設(shè)計(jì)優(yōu)化出硒蛋白酸奶發(fā)酵條件:硒蛋白添加量為4%、接種量為3%、蔗糖添加量為8%、發(fā)酵時間為6 h;研究還發(fā)現(xiàn)硒蛋白的添加量對感官評分的影響最大,其次為接種量,發(fā)酵時間及蔗糖添加量對其影響最小。
牛奶中硒化合物及含量影響著乳酸菌的生長代謝,導(dǎo)致酸奶的一些理化性質(zhì)發(fā)生變化;而乳酸菌可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為不同形態(tài)的有機(jī)硒,增加酸奶中硒蛋白、硒代氨基酸、單質(zhì)硒(納米硒)等物質(zhì)含量。
酸奶的理化性質(zhì)包括持水力、酸度、黏度、營養(yǎng)成分等指標(biāo)。湯慶莉等[9]利用富硒玉米須和銀杏葉制成的富硒粉并添加到牛奶中(0.1 g/mL牛奶),發(fā)酵得到富硒酸奶的水分、蛋白質(zhì)、脂肪、酸度、硒含量分別為83.5%、4.6%、3.1%、0.63%~0.99%、0.107 mg/L,這些指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。黃高明[14]通過在牛乳中添加亞硒酸鈉制得發(fā)酵劑,利用富硒發(fā)酵劑發(fā)酵的富硒酸奶,其脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體、硒含量及酸度依次為3.2%、3.1%、8.4%、0.475 μg/mL、91°T,這 5項(xiàng)指標(biāo)均大于國家標(biāo)準(zhǔn)。使用富硒混合乳酸菌菌體與適量的復(fù)原乳獲得發(fā)酵劑,劉冬等[19]用其發(fā)酵的富硒酸奶的脂肪、非脂乳固體、蛋白質(zhì)、有機(jī)硒含量、酸度分別為(3.6±0.4)%、(8.6±0.3)%、(3.2±0.2)%、(17±4.5)μg/kg、(80±3)°T,富硒酸奶理化指標(biāo)均符合文獻(xiàn)[20]的相關(guān)規(guī)定。通過以上不同富硒酸奶的理化指標(biāo)可見,相同指標(biāo)存在差異,原因可能與發(fā)酵中所使用的乳酸菌菌種、富硒原料、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素有關(guān),對辣木富硒低糖酸奶和普通酸奶理化特性進(jìn)行比較分析,曾鈺鵬等[10]發(fā)現(xiàn)辣木富硒低糖酸奶酸度、持水力、黏度、蛋白質(zhì)以及硒含量均高于普通酸奶。黃高明[14]研制的富硒酸奶各項(xiàng)理化指標(biāo)與普通酸奶均無差別,而有機(jī)硒達(dá)到了0.481 5 μg/mL,是普通酸奶的硒含量的約480倍??梢姼晃崮痰母黜?xiàng)理化指標(biāo)并不一定優(yōu)于普通酸奶,但其含有的有機(jī)硒含量要遠(yuǎn)高于普通酸奶。
在不同的儲藏條件下富硒酸奶和普通酸奶理化指標(biāo)會發(fā)生不同程度的變化[18,21-22]。謝海軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)用硒蛋白制得的富硒酸奶和普通酸奶在冷藏9 d期間,隨著時間的延長保水性、黏度都呈下降趨勢;兩種酸奶的乳酸菌數(shù)量、酸度都呈增加趨勢。在冷藏5 d后普通酸奶的黏度顯著低于富硒酸奶(P<0.05),冷藏7 d后普通酸奶的乳酸菌數(shù)顯著高于富硒酸奶(P<0.05),整個冷藏過程中富硒酸奶的保水性都顯著高于普通酸奶(P<0.05)。宋玉卿等[22]使用含有亞硒酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得富硒乳酸菌并將其與牛乳混合制得發(fā)酵劑,發(fā)酵的富硒酸奶在4℃貯藏21 d期間內(nèi),隨貯藏時間的延長持水率呈下降趨勢;酸度、黏度均呈上升趨勢;儲存期內(nèi)有機(jī)硒的含量達(dá)27.7 μg/kg。貯藏過程中持水率在前7 d內(nèi)持續(xù)下降,黏度在9 d時達(dá)到最大值,酸度在第21天達(dá)到最大值,為97.4°T。張蓉等[8]使用固態(tài)富硒酸奶發(fā)酵劑制得富硒酸奶,在4℃儲藏25 d,發(fā)現(xiàn)隨儲藏時間的延長水收縮值、酸度均呈上升趨勢;活菌數(shù)、蛋白質(zhì)、脂肪、非脂乳固體都呈下降趨勢;有機(jī)硒含量為 29.8 μg/kg~30.1 μg/kg。富硒酸奶儲藏25 d時,蛋白質(zhì)、脂肪、脫水收縮值和非脂乳固體等理化指標(biāo)仍符合相關(guān)規(guī)定,且活菌數(shù)達(dá)到2.88×107CFU/mL,遠(yuǎn)高于乳制品規(guī)定的乳酸菌數(shù)(≥1×106CFU/mL)。這些研究發(fā)現(xiàn)富硒酸奶在低溫貯藏過程中保水率呈下降趨勢、黏度呈上升趨勢,可能是乳酸菌代謝的胞外多糖增加了酸奶的黏度[23-24],而黏度的增加有利于提高其保水性,因此保水性較普通酸奶更高。酸度呈上升趨勢與普通酸奶差異不顯著,可見硒的添加會影響酸奶的部分性質(zhì)。富硒酸奶中存在穩(wěn)定的有機(jī)硒,硒含量遠(yuǎn)高于普通酸奶,達(dá)到了為機(jī)體補(bǔ)硒的目的。其他各項(xiàng)理化指標(biāo)及活菌數(shù)雖有下降,但都符合GB19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[20]相關(guān)規(guī)定。
鑒于硒元素與硫元素的化學(xué)性質(zhì)相似,無機(jī)硒經(jīng)生物體的硫代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)硒。乳酸菌能將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化形成納米硒或者有機(jī)態(tài)硒。而對酸奶中硒代謝的研究報道并不多見,富硒酸奶中硒的存在方式主要為有機(jī)硒以及部分單質(zhì)硒。張蓉等[8]通過截留透析的方法去除酸奶中的無機(jī)硒,根據(jù)GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》,選用3,3-二氨基聯(lián)苯胺法測定酸奶中的有機(jī)硒含量為 29.8 μg/kg~30.1 μg/kg。
硒濃度影響著酸奶中硒形態(tài)和含量,經(jīng)掃描電鏡鑒定硒濃度超過5 μg/g的酸奶中聚集硒納米顆粒;而在亞硒酸鈉濃度低于2 μg/g時,通過高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-Inductively coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)檢測發(fā)現(xiàn)乳酸菌可將亞硒酸鈉或硒酸鈉轉(zhuǎn)化為硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸,且兩者含量隨著硒濃度和發(fā)酵時間而變化;然而在對照和加硒條件下經(jīng)乳酸菌代謝后硒代蛋氨酸含量基本上沒有變化[16]。通過模擬人體消化系統(tǒng),硒濃度1 μg/g~5 μg/g 的酸奶在小腸階段的硒生物可給性(74%~76%)明顯高于在胃階段的硒生物可給性(55%~63%)(P<0.05);添加硒濃度 2 μg/g的酸奶在胃消化階段釋放出180 ng/g未確定的硒化合物和152 ng/g硒代胱氨酸,而在小腸消化階段釋放出未確定的硒化合物、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸含量依次為111、134、255 ng/g[25]。
普通酸奶具有抗氧化、抗菌等活性,通過乳酸菌對牛奶基質(zhì)中硒化合物的轉(zhuǎn)化形成的富硒酸奶,更加具有特殊的生物活性。
谷胱甘肽過氧化物酶是由硒蛋白構(gòu)成的硒酶,硒位于酶的活性中心,具有抗氧化能力,可催化過氧化氫的還原、減少活性氧產(chǎn)生,可與自由基相互抵消保護(hù)機(jī)體的蛋白質(zhì)、DNA、染色體結(jié)構(gòu)和功能不受氧化作用影響[26]。曾鈺鵬等[10]分別測定辣木富硒低糖酸奶與兩種市售酸奶的總抗氧化能力為5.43、3.45、3.70 U/mL。鄭文瑋等[27],使用松針提取液、富硒酵母、全脂乳粉發(fā)酵的松針富硒酸乳的總抗氧化能力為22.57 U/mL,與5種市售酸奶的抗氧化能力(2.47、2.87、3.45、4.77、5.30 U/mL)相比,該酸乳抗氧化能力為市售酸奶的4倍~10倍。由此可見,富硒酸奶的抗氧化能力高于普通酸奶[28],可能與酸奶中硒含量和硒價態(tài)有關(guān)。
富硒酸奶在抗病毒方面有顯著的作用,尤其是對黃曲霉毒素的抵抗能力。Alsuhaibani等[29]研究發(fā)現(xiàn),大鼠在感染黃曲霉毒后肝腎功能會產(chǎn)生嚴(yán)重的功能障礙和組織變化,致其體重下降,與文獻(xiàn)研究一致[30]。繼而以健康大鼠為陰性組,以被黃曲霉毒素感染的大鼠作為陽性組。陽性組在喂食富硒酸奶后,血紅蛋白由(109.9±12.5)g/L 升至(124.5±13.4)g/L;紅細(xì)胞壓積由(27.53±2.60)%升至(33.98±4.08)%;血糖由(8.28±0.58)mmol/L 下降至(5.81±0.74)mmol/L,3 項(xiàng)指標(biāo)與體重均恢復(fù)至正常范圍,與喂食前的陽性對照有顯著差異(P<0.05);說明富硒強(qiáng)化酸奶對肝臟功能的恢復(fù)有著顯著作用。同時對大鼠腎臟進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性組的腎臟出現(xiàn)了炎癥和腎小球周圍細(xì)胞纖維狀異常增殖;而喂食了富硒酸奶的大鼠腎臟則與陰性組的健康腎臟組織相同,說明富硒酸奶能恢復(fù)大鼠腎臟功能和維持腎臟的正常組織結(jié)構(gòu),有效地降解了黃曲霉毒素。
以牛乳、硒化物等為基質(zhì),經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后形成的富硒酸奶,具有良好的理化特性、多種營養(yǎng)價值以及功能特性。而富硒酸奶的理化特性與硒化物、乳酸菌、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等多種因素有關(guān)。一些乳酸菌在含有亞硒酸鈉的MRS培養(yǎng)基中生長時,可以代謝產(chǎn)生硒多糖、硒核酸、納米硒、硒代氨基酸等物質(zhì)。而乳酸菌在含亞硒酸鈉的牛乳基質(zhì)中代謝產(chǎn)生的有機(jī)硒種類和含量,與硒代謝途徑中亞硫酸還原酶、硒磷酸化物合成酶、高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、半胱氨酸合酶活性、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶和硒代半胱氨酸裂解酶等酶活性有關(guān)。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)研究硒代謝關(guān)鍵基因GshR/gor、Scl、SelA、SelD的數(shù)量,以此來評價不同乳酸菌的富硒與轉(zhuǎn)化硒能力,或者分析酸奶形成過程中關(guān)鍵基因表達(dá)的差異。