那一凡，金鵬飛，倪 倩，譚 琳，陳露露，譚 玲

(北京醫(yī)院藥學(xué)部，國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京市藥物臨床風(fēng)險與個體化應(yīng)用評價重點實驗室(北京醫(yī)院)，北京 100730)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)正在世界范圍內(nèi)流行。感染新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的患者表現(xiàn)出廣泛的癥狀，包括咳嗽、發(fā)熱、不適、肌痛、胃腸道癥狀、衰老和嗅覺缺失，部分患者可能在癥狀出現(xiàn)約1周后迅速進展為急性呼吸窘迫綜合征進而導(dǎo)致死亡[1]。在疾病的治療方面，尚無特異性針對該病毒的抗病毒藥，臨床上仍以支持治療和對癥治療為主。因此，針對SARS-CoV-2本身開發(fā)相應(yīng)的抗病毒藥仍是當(dāng)前的主要課題。使用患者恢復(fù)期血漿治療病毒感染，本質(zhì)上是利用其中所含有的針對感染病毒的中和抗體進行治療的方法，并已在一些臨床應(yīng)用中證明了該方法的有效性。中和抗體是B淋巴細胞產(chǎn)生的一種能夠與病原體(如病毒)表面的抗原結(jié)合，從而阻止病原體黏附宿主細胞受體或抑制其感染的免疫球蛋白分子，例如用于乙型肝炎、狂犬病、破傷風(fēng)等預(yù)防和治療的免疫血清(多克隆抗體)，用于呼吸道合胞病毒感染和埃博拉病毒預(yù)防和治療的單克隆抗體，均已在臨床試驗及臨床使用中顯示出一定療效[2]。從COVID-19患者恢復(fù)期血漿獲得抗SARS-CoV-2抗體，通過相應(yīng)制備技術(shù)獲得的中和抗體藥物可有效降低COVID-19患者體內(nèi)病毒載量，是一種有望徹底治愈COVID-19的手段。目前，全球已有包括我國在內(nèi)的少數(shù)國家研制出該類藥物并獲批上市[3-4]。本文試從SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)，中和抗體藥物的作用機制、臨床療效和需要關(guān)注的問題等方面進行總結(jié)，以期為該類藥物的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)與中和抗體藥物的作用靶點

1.1 SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2是一種單鏈RNA正鏈包膜β冠狀病毒，同家族成員還包括嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)。SARS-CoV-2與SARS-CoV基因組序列的同源性約為79.6%[4]。在顯微鏡下，SARS-CoV-2粒子呈球形，其表面分布凸起的棒狀粒子(刺突樣蛋白)，形狀不規(guī)則。病毒表面的包膜結(jié)構(gòu)中含有3種蛋白，即刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和膜蛋白(M蛋白)。其中，E蛋白和M蛋白在病毒的裝配和成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用，S蛋白以三聚體形成突起，伸出包膜表面，參與病毒與宿主細胞的結(jié)合[5-6]。

1.2 SARS-CoV-2與受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的關(guān)系

SARS-CoV-2表面的S蛋白包括S1和S2 2個亞基，S1亞基又包含N-端區(qū)(NTD)和受體結(jié)合部位(RBD，C-端區(qū))，病毒表面的RBD與宿主細胞表面的ACE2結(jié)合，決定了病毒的宿主范圍和細胞嗜性[7-8]。S2亞基包含誘導(dǎo)SARS-CoV-2與宿主細胞膜融合過程所需基本結(jié)構(gòu)。由于S蛋白在SARS-CoV-2感染過程中的關(guān)鍵作用，目前研發(fā)的大部分SARS-CoV-2中和抗體都以S蛋白為靶點，通過阻斷RBD與ACE2的結(jié)合，達到中和病毒的目的[9-10]。

2 抗SARS-CoV-2中和抗體藥物的分類

2.1 靶點為S1亞基的藥物

COVID-19康復(fù)者血漿中SARS-CoV-2抗體種類眾多，病毒中和活性較高的抗體主要靶向S1亞基上的RBD靶點，目前處于臨床階段的SARS-CoV-2中和抗體均為針對該靶點的藥物[11]。Ju等[12]從8例SARS-CoV-2感染者的單個B細胞中分離并鑒定206株特異性單克隆抗體，并證實其活性與抑制RBD和ACE2受體的結(jié)合相關(guān)。Brouwer等[13]從8例SARS-CoV-2感染者中分離出19株特異性單抗，其中對病毒阻斷活性最高的2株抗體(半數(shù)抑制濃度分別為0.007和0.009 μg/mL)，靶點也是RBD。我國首個抗SARS-CoV-2特效藥物安巴韋單抗/羅米司韋單抗的作用靶點同樣是S1亞基的RBD。

2.2 靶點為S2亞基的單抗

盡管已有研究結(jié)果表明，COVID-19康復(fù)者血漿存在能與S2蛋白結(jié)合的抗體[7]。但有關(guān)靶向S2亞基的單克隆抗體罕有報道，這有可能是因為作用于該靶點的抗體數(shù)量較少或活性較低。1A9是一種S2亞基靶向的SARS-CoV-2中和抗體，Lip等[14]對該抗體進行研究后發(fā)現(xiàn)，由于1A9可結(jié)合S2亞單位上的肽重復(fù)序列(HR)結(jié)構(gòu)域，而S2亞單位又是病毒中不易發(fā)生突變的區(qū)域(即高度保守的區(qū)域)，因此，盡管其中和性能較差，但對于SARS-CoV-2的變異毒株可能具有廣泛的中和活性。

2.3 靶點為ACE2位點以外的中和抗體

該類抗體通過在空間上干擾ACE2和RBD的相互作用，達到抑制病毒進入宿主細胞的作用。Barnes等[9]發(fā)現(xiàn)的C135抗體可以ACE2位點以外的高度保守表位為靶點，證明該抗體具有高效的中和SARS-CoV-2的作用，并推測這類抗體可能與其他中和抗體藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。Beddingfield等[15]的臨床前研究結(jié)果顯示，C135和C144抗體組合可有效預(yù)防SARS-CoV-2感染，阻斷恒河猴疾病模型中COVID-19的疾病進展，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 已獲批準(zhǔn)的中和抗體藥物的臨床治療作用

近年來，單克隆抗體的研制取得了顯著進展。從COVID-19康復(fù)患者中獲得特異性B細胞，通過鼠雜交瘤融合技術(shù)、單個B細胞分選技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)等抗體篩選技術(shù)，獲得大量人源化程度較高的單克隆抗體。由于每例患者都表現(xiàn)出獨特的SARS-CoV-2中和抗體的生物分布模式，使得SARS-CoV-2抗體的開發(fā)更具挑戰(zhàn)性[16]。目前，大多數(shù)中和抗體正處于研發(fā)和臨床前研究階段，但也有進入Ⅲ期臨床試驗或已獲得國家緊急使用授權(quán)的藥物。

由美國LLY公司與加拿大Abcellera公司聯(lián)合開發(fā)的LY-CoV555(巴尼韋單抗，bamlanivimab)，是從美國第1例康復(fù)的COVID-19患者血漿中獲得的抗S蛋白抗體。該藥作為世界上首個SARS-COV-2特異性抗體治療藥物，于2020年11月9日獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)用于治療COVID-19的緊急使用授權(quán)。Chen等[17]的研究共納入452例輕度或中度COVID-19患者，隨機分為四組后分別注射單劑量巴尼韋單抗(700、2 800和7 000 mg)或安慰劑，測定第11日后病毒載量并統(tǒng)計第29日患者與COVID-19相關(guān)的住院或急診治療比例。該研究結(jié)果顯示，給予巴尼韋單抗治療的患者住院率(1.6%)顯著低于安慰劑組(6.3%)，接受巴尼韋單抗2 800 mg劑量治療的患者病毒載量與安慰劑組相比降低了3.4倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但巴尼韋單抗其他劑量組與安慰劑組患者病毒載量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；巴尼韋單抗組在治療期間發(fā)生不良反應(yīng)的患者百分比為22.3%(69/309)，安慰劑組為24.5%(35/143)，常見不良反應(yīng)為腹瀉(3.2%)和嘔吐(1.6%)。

Cohen等[18]關(guān)于巴尼韋單抗用于預(yù)防SARS-COV-2感染的隨機對照試驗結(jié)果顯示，單次靜脈輸注巴尼韋單抗4 200 mg的受試者在第57日的核酸陽性率顯著低于安慰劑組(8.5%vs. 15.2%)，且治療組未出現(xiàn)死亡病例(安慰劑組死亡5例)。在1 175例受試者中，巴馬尼單抗組和安慰劑組的不良反應(yīng)發(fā)生率分別為20.1%和18.9%，最常見的不良反應(yīng)為尿路感染。

VIR-7831(sotrovimab)是由美國Vir公司(Vir Biote-chnology)和英國GSK公司聯(lián)合開發(fā)的全人源SARS-CoV-2中和抗體，其來源于2003年嚴重急性呼吸綜合征(SARS)康復(fù)者體內(nèi)分離的抗體S309，該抗體在結(jié)合S蛋白的同時并不影響其他抗體與之結(jié)合，相反還能增強其他抗體的中和作用，并且其結(jié)合位點是S1亞基中相對保守的位點，故在很大程度上避免了免疫逃逸，提高其他中和抗體的治療作用[19]。Gupta等[20]的臨床試驗結(jié)果顯示，給予輕中度COVID-19患者單次輸注sotrovimab(500 mg)29 d后，因疾病進展導(dǎo)致的住院或死亡率顯著降低(相對風(fēng)險降低85%，有統(tǒng)計學(xué)意義)。此外值得注意的是，sotrovimab 的有效劑量僅為500 mg，這一劑量允許肌內(nèi)注射，從而增加COVID-19患者治療的方便性；同時，較低的給藥劑量也可能減少不良反應(yīng)。在接受sotrovimab治療的患者中，17%的患者報告發(fā)生不良反應(yīng)/事件(有2%發(fā)生嚴重不良反應(yīng)/事件)，主要不良反應(yīng)為腹瀉；安慰劑組中，19%的患者報告發(fā)生不良反應(yīng)/事件(有6%發(fā)生嚴重不良反應(yīng)/事件)。且研究人員認為這些事件大多是COVID-19疾病進展所致。Aggarwal等[21]的研究認為，與未接受中和抗體治療的SARS-CoV-2變異株(德爾塔)感染患者相比，sotrovimab(500 mg)能夠降低COVID-19門診患者住院率和28 d全因死亡率。Martin-Blondel等[22]近期的研究結(jié)果也顯示，使用sotrovimab(500 mg)可以避免奧密克戎變異株感染患者癥狀發(fā)展。

美國Regeneron Pharmaceuticals公司開發(fā)的雙抗REGN-COV2(casirivimab+imdevimab)是采用COVID-19康復(fù)患者血漿和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備的人源化抗體。2個單抗能非競爭性結(jié)合S蛋白的RBD，且具有高度親和力(KD=0.56～45.2 nmol/L)[23]。Weinreich等[24]的隨機對照試驗結(jié)果證明，輕中度COVID-19患者單劑量注射REGN-COV2后7 d，低劑量組(2.4 g)和高劑量組(8 g)患者病毒載量下降程度[(-1.60±0.14)log10 copies/mL和(-1.90±0.14)log10 copies/mL)]大于安慰劑組[(-1.34±0.10)log10 copies/mL)]，并發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)病毒載量越高的患者治療效益可能越大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。該藥的藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，>95%的患者在第29日的血清中藥物濃度遠高于基于體外和臨床前數(shù)據(jù)的預(yù)測濃度，2種抗體的平均估算半衰期為25～37 d。2020年 11月21日，REGN-COV2獲得美國FDA用于治療COVID-19的緊急使用授權(quán)。在此之后，O’Brien等[25]進行的預(yù)防性研究結(jié)果顯示，給予血清抗體陰性的COVID-19無癥狀感染者皮下注射低劑量REGN-COV2(2種抗體各給藥0.6 g)，與安慰劑組相比，可顯著降低28 d內(nèi)患者轉(zhuǎn)化為有癥狀感染者的發(fā)生率(29.0%vs. 42.3%)。

上海君實生物醫(yī)藥科技股份有限公司和中國科學(xué)院微生物研究所聯(lián)合研制的埃特司韋單抗(etesevimab)也是運用單細胞測序技術(shù)從COVID-19康復(fù)者外周血分離得到的抗體，于2020年6月進入Ⅰ期臨床試驗，是繼巴尼韋單抗后第2個進入臨床試驗的SARS-CoV-2中和抗體。針對巴尼韋單抗在其Ⅲ期臨床試驗結(jié)果中改善COVID-19患者臨床癥狀證據(jù)不足的問題，美國LLY公司與上海君實生物醫(yī)藥科技股份有限公司聯(lián)合推出埃特司韋單抗/巴尼韋單抗聯(lián)合療法，并于2021年2月獲得美國FDA用于治療COVID-19的緊急使用授權(quán)。該藥的Ⅲ期臨床試驗結(jié)果顯示，接受埃特司韋單抗/巴尼韋單抗聯(lián)合治療(2 800 mg/2 800 mg)的患者，其第11日的病毒載量與安慰劑組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且第29日的COVID-19相關(guān)住院或急診治療率也降低(聯(lián)合治療組為0.9%，安慰劑組為5.8%)[26]。

清華大學(xué)、深圳市第三人民醫(yī)院與騰盛博藥生物科技有限公司合作，采用單個B細胞分選技術(shù)從國內(nèi)COVID-19康復(fù)患者體內(nèi)篩選出全人源單克隆抗SARS-CoV-2中和抗體安巴韋單抗/羅米司韋單抗(amubarvimab+romlusevimab)，該藥于2021年12月8日獲得國家藥品監(jiān)督管理局的上市批準(zhǔn)，用于治療SARS-CoV-2檢測結(jié)果為陽性，同時伴有進展為重型COVID-19危險因素的成人和青少年(年齡≥12歲，體重≥40 kg)患者[27]。騰盛博藥生物科技有限公司官方公布的Ⅲ期臨床最終結(jié)果顯示，與安慰劑相比，安巴韋單抗/羅米司韋單抗聯(lián)合療法使臨床進展高風(fēng)險的COVID-19門診患者住院和死亡風(fēng)險降低80%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且安全性優(yōu)于安慰劑；從研究第0日至第28日，治療組沒有患者死亡，而安慰劑組有9例患者死亡；與安慰組相比，治療組患者死亡比例顯著降低(P=0.003 7)；無論從癥狀出現(xiàn)后的早期(0～5 d)或晚期(6～10 d)開始治療的受試者中，都觀察到類似的有效性[28]。

已獲得授權(quán)用于治療COVID-19的部分中和抗體藥物見表1。

表1 已獲得授權(quán)用于治療COVID-19的部分中和抗體藥物Tab 1 Part of the neutralizing antibodies authorized for the treatment of COVID-19

4 目前關(guān)于中和抗體藥物可能存在的不足與挑戰(zhàn)

4.1 對抗體依賴性增強效應(yīng)和重癥患者的臨床效果缺乏研究

多數(shù)中和抗體藥物臨床試驗療效及政府機構(gòu)所批準(zhǔn)的適應(yīng)證均是針對輕中度非住院COVID-19患者，而對重癥住院患者的療效研究并不充分。有研究結(jié)果表明，免疫系統(tǒng)過度激活會引發(fā)細胞因子風(fēng)暴，引起危及生命的多器官衰竭是導(dǎo)致COVID-19患者治療失敗和死亡的重要原因[29]。

另一方面，抗體依賴性增強效應(yīng)也是一個需要重點關(guān)注的潛在風(fēng)險。該現(xiàn)象最早在登革熱患者的治療中被觀察到，但其產(chǎn)生機制尚不完全清楚。Weinreich等[24]在其研究中分別討論了REGN-COV2對未產(chǎn)生內(nèi)源性免疫應(yīng)答患者(即血清抗體陰性)和已產(chǎn)生內(nèi)源性免疫應(yīng)答患者(即血清抗體陽性)的療效差異，并認為注射REGN-COV2后，未產(chǎn)生內(nèi)源性免疫應(yīng)答的患者獲益更大。但上述研究中，血清學(xué)陰性患者僅占全部住院患者的42%，多數(shù)重癥患者在病情發(fā)展后體內(nèi)都存在中和抗體，而這些自身免疫產(chǎn)生的抗體與外源性抗體之間是協(xié)同還是拮抗作用并不清楚。近期發(fā)表的針對sotrovimab和安巴韋單抗/羅米司韋單抗應(yīng)用于COVID-19住院患者的研究結(jié)果顯示，sotrovimab和安巴韋單抗/羅米司韋單抗均不能改善總體COVID-19住院患者的臨床預(yù)后；進一步的亞組分析結(jié)果顯示，在513例患者中，有301例患者(占59%)的血漿中SARS-CoV-2內(nèi)源性抗體呈陰性，而安巴韋單抗/羅米司韋單抗對該類患者的臨床預(yù)后有潛在的益處，提示COVID-19患者越早進行中和抗體的免疫治療其獲益可能越大[30]。2項關(guān)于巴尼韋單抗和REGN-COV2對COVID-19住院患者的研究結(jié)果也顯示，SARS-CoV-2內(nèi)源性抗體陰性的患者應(yīng)用上述2種抗體藥物獲益更大[31-32]。盡管上述研究的結(jié)果有相似之處，但因研究的總體樣本量較少，導(dǎo)致亞組分析并不充分，該結(jié)論仍應(yīng)謹慎對待。因此，我國上市的安巴韋單抗/羅米司韋單抗雖對感染晚期患者也具有治療效果，但也未被批準(zhǔn)用于重癥患者的治療。

4.2 病毒的變異與免疫逃逸

目前，多個SARS-CoV-2變異株已在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)并廣泛流行，不同變異株對各種中和抗體的敏感性不同。有研究結(jié)果表明，B.1.351(貝塔)變異株能抵抗靶向NTD中超抗原位點和RBD中受體結(jié)合基序的多個單抗(包括 LYCoV555和REGN10933)。最近流行的SARS-CoV-2變異株B.1.1.529(奧密克戎)，其顯著特征之一是在S蛋白處檢測到大量的突變點(約30個)，并且約15個突變位點位于中和抗體藥物的主要結(jié)合位點(RBD)，這表明奧密克戎變異株可能有更大的概率發(fā)生免疫逃逸[33]。免疫逃逸可能會產(chǎn)生嚴重后果，如果在全球范圍內(nèi)發(fā)生不受控制的傳播，可能導(dǎo)致感染、再感染，使病毒在變異過程中進一步增強適應(yīng)性并最終導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率升高。由于SARS-CoV-2變異株的存在使得單一抗體療法可能存在較高的失敗風(fēng)險。Ho等[34]的研究顯示，在B.1.351和B.1.1.7(阿爾法)變異株存在下LY-CoV555完全喪失中和活性，雙抗REGN-COV2和sotrovimab雖能夠中和變異株，但中和效力均顯著下降。2021年12月12日，騰盛博藥生物科技有限公司宣布，新的體外嵌合病毒實驗中和數(shù)據(jù)表明，雖然安巴韋單抗對抗奧密克戎變異株的活性顯著下降，但羅米司韋單抗不受影響，認為安巴韋單抗/羅米司韋單抗聯(lián)合療法保持對奧密克戎變異株的中和活性[28]。

5 總結(jié)與展望

當(dāng)前SARS-CoV-2的全球大流行已造成前所未有的健康和經(jīng)濟損失，危機還未得到有效控制。世界各國的公共衛(wèi)生系統(tǒng)都承受著巨大壓力，很多患者因救治不及時而喪生。盡管全球已有多個疫苗產(chǎn)品陸續(xù)被批準(zhǔn)用于人體預(yù)防免疫，但隨著疫苗接種規(guī)模不斷擴大，其不良反應(yīng)也日益凸顯，包括發(fā)熱、頭痛、肌痛、局部紅腫和疲倦等，甚至出現(xiàn)喉頭水腫、過敏性休克等嚴重不良反應(yīng)。此外，新型變異毒株的出現(xiàn)仍然是當(dāng)前抗擊COVID-19疫情的重大挑戰(zhàn)[11,35]。因此，開發(fā)出針對SARS-CoV-2的有效藥物仍是徹底戰(zhàn)勝疫情的有效手段之一。中和抗體藥物具有特異性好、安全性高、作用機制明確、便于大規(guī)模生產(chǎn)、能夠同時用于預(yù)防和治療等優(yōu)點，成為研發(fā)抗SARS-CoV-2藥物的新突破口。上述抗SARS-CoV-2中和抗體藥物的上市，說明有望通過該類藥物治愈COVID-19。

但中和抗體藥物也存在不足，如前述中提到的由于病毒變異而產(chǎn)生的免疫逃逸、抗體依賴性增強效應(yīng)以及對重癥患者的臨床效果不佳。建議在研發(fā)和使用中和抗體藥物的過程中，持續(xù)跟進變異株在全球的流行情況，開發(fā)更多結(jié)合不同位點特別是保守位點的廣譜單抗或雙抗療法。針對中和抗體藥物可能對體內(nèi)已產(chǎn)生內(nèi)源性抗體的患者療效較差的問題，建議在擬應(yīng)用藥物前常規(guī)檢測體內(nèi)是否已產(chǎn)生內(nèi)源性抗體，為患者是否適用于中和抗體療法提供決策。為改善重癥COVID-19患者的療效，可嘗試對抗體進行改造，以提高其體內(nèi)藥效、藥動學(xué)特性。