六價鉻對不同時期妊娠小鼠及胚胎的損傷作用

汪 君，劉燕群，2，魯雄兵，陳靖雯，陳雯婕，孫書萌，羅傲添，劉欣宇

1.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056

2.江漢大學(xué)持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430056

六價鉻是重金屬鉻化合物中毒性最強的。較高劑量的六價鉻會對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生嚴重的毒性作用。六價鉻容易進入體細胞、肝臟、腎臟、消化道、呼吸道、骨骼，在人體內(nèi)累積，且具有致癌性[1]。六價鉻可以改變DNA分子結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)基因突變，使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從而影響子一代的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[2]。一定劑量的六價鉻可以損傷小鼠的生殖功能[3]。

六價鉻可以損傷睪丸及其附屬腺的結(jié)構(gòu)，使得精液質(zhì)量、精漿中微量元素及生化水平異常，減少精子的發(fā)生，損傷男性生殖系統(tǒng)，經(jīng)六價鉻處理后的精子與卵母細胞結(jié)合受精的成功率顯著降低[4]。六價鉻對女性生殖系統(tǒng)的損傷機制甚少報道。本研究在雌性小鼠妊娠不同時期進行染毒，旨在比較不同時期六價鉻對胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級 育 齡 期 KD 小 鼠， 合 格 證 號：No.42010200005824，購于三峽大學(xué)。小鼠毛色純白有光澤，體格健壯，日齡42 d，活動度高。買回后于空調(diào)（24±1）℃除濕模式下適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。將KD鼠隨機分為3組，每組6只雌鼠，6只雄鼠，并另養(yǎng)6只雌鼠備用。

1.2 主要實驗儀器與試劑

重鉻酸鉀（K2Cr2O7），生產(chǎn)于山東西亞化學(xué)股份有限公司，純度99.8%。JA2003B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）等。

1.3 溶液配制

重鉻酸鉀LD50溶液：鑒于相關(guān)文獻［5］報道，小鼠的重鉻酸鉀半數(shù)致死量為171 mg/kg[7]，本實驗選取重鉻酸鉀342 mg，用雙蒸水40 mL溶解，配成LD50原液，然后稀釋成1/6LD50溶液，低溫保存，以供實驗灌胃所需。

1.4 實驗方法及觀察指標

1.4.1 預(yù)實驗 共分3組，重鉻酸鉀（1/4LD50），重鉻酸鉀（1/6LD50），重鉻酸鉀（1/8LD50），適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后于20：00合籠，雌雄比1∶1，次日8：00，用生理鹽水對細棉簽潤濕，輕輕插入小鼠陰道0.5 cm處并轉(zhuǎn)動一下后取出，將棉簽上的陰道分泌物均勻地涂在載玻片上，95%酒精溶液固定10min后，HE染色5min，用自來水順載玻片邊緣沖掉多余染液，風(fēng)干后觀察，涂片中觀察到精子為懷孕第0 d，從懷孕第3 d起灌胃，共灌胃7 d，灌胃期間密切觀察小鼠的活動狀態(tài)，第8 d解剖，對其進行觀察，斷頭取血，并取其胚胎，濾紙脫水，稱重，根據(jù)胚胎的發(fā)育情況，分為劣質(zhì)胚胎（畸形細胞及桑椹胚期以前細胞）、優(yōu)質(zhì)胚胎（桑椹胚及囊胚），找出胚胎質(zhì)量最好的一組，確定正式實驗重鉻酸鉀濃度。

1.4.2 正式實驗 共分為3組：卵泡期染毒組、植入期染毒組、空白對照組。使用苦味酸對小鼠頭、尾、上下左右腿做標記。卵泡期染毒組雌性小鼠重鉻酸鉀染毒1次/d，連續(xù)3 d。間隔2 d后，于20：00～22：00按雌∶雄=1∶1合籠，次日8：00檢查陰栓，合籠3 d。查到陰栓日記為D1，稱取小鼠此時的體質(zhì)量。植入期染毒組在D4～D6染毒，1次/d，連續(xù)3 d?？瞻讓φ战M注射等量生理鹽水與飼料。灌胃期間記錄每只小鼠的體質(zhì)量變化以及活動狀態(tài)，若有情況異常者，則記錄下變化，若有死亡者，則分析原因適度改變實驗變量重新開展實驗。孕小鼠D14稱量孕鼠體質(zhì)量，斷頸處死，剖腹取子宮，剝離去除結(jié)締組織，濾紙吸干，剪開子宮壁，取出胚胎，計數(shù)胚胎數(shù)和死胎數(shù)，再分離胚胎與胎盤，分別稱量子宮、胚胎、胎盤的重量；樣品使用固定液儲存。分別對子宮、卵巢、胚胎做病理切片，拍照留存，觀察其結(jié)構(gòu)變化。

1.4.3 指標檢測 分別稱量小鼠懷孕1 d和解剖當日的體質(zhì)量，對子宮，胚胎，胎盤稱重，記錄下胚胎數(shù)和死胎數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析法（ANOVA），進行描述性和方差同質(zhì)性檢驗，使用多重比較進行縱向比較兩個時期作用強度，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 六價鉻染毒對不同時期孕體體質(zhì)量的影響

卵泡期染毒組孕體體質(zhì)量增加量明顯低于空白對照組，植入期染毒組孕體體質(zhì)量增加量明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；植入期染毒組孕體體質(zhì)量增加量低于卵泡期染毒組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其中，F(xiàn)=15。見表1。HE染色可見卵泡外周有異型的梭形細胞，呈片狀排布，瘤細胞層次增多，見圖1。

圖1 重鉻酸鉀染毒對卵泡期小鼠卵巢的影響

表1 六價鉻染毒對不同時期孕體體質(zhì)量的影響（±s） g

表1 六價鉻染毒對不同時期孕體體質(zhì)量的影響（±s） g

組別空白對照組（n=6）卵泡期染毒組（n=6）植入期染毒組（n=6）D1體質(zhì)量33.50±2.881 35.83±2.639 33.83±2.714 D14體質(zhì)量48.83±2.483 46.83±2.483 44.50±2.588體質(zhì)量增加量15.33±1.862 11.00±1.414 10.67±1.633

2.2 六價鉻染毒對子宮的影響

卵泡期染毒組子宮臟器系數(shù)為（1.910±0.255）%，明顯低于空白對照組的（2.964±0.487）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 17＜0.05）；植入期染毒組子宮臟器系數(shù)為（2.394±0.320）%，明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.017＜0.05）；植入期染毒組子宮臟器系數(shù)高于卵泡期染毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.037＜0.05）。其中，F(xiàn)=12.380。HE染色可見子宮肌層中出現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺體及大小不一形態(tài)各異的異型細胞和大量漿細胞，見圖2。

圖2 重鉻酸鉀染毒對植入期小鼠子宮的影響

2.3 六價鉻染毒對胎盤的影響

卵泡期染毒組胎盤臟器系數(shù)為（0.347±0.016）%，明顯低于空白對照組的（0.397±0.030）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002＜0.05）；植入期染毒組子宮臟器系數(shù)為（0.312±0.021）%，明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 01＜0.05）；卵泡期染毒組胎盤臟器系數(shù)高于植入期染毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.018＜0.05）。其中，F(xiàn)=14.345。 HE染色顯示，胎盤間質(zhì)水腫，血管減少，胎盤絨毛滋養(yǎng)層有中性粒細胞浸潤。

2.4 六價鉻染毒對胚胎的影響

空白對照組胚胎平均質(zhì)量為（0.536±0.045）g，明顯高于卵泡期染毒組的（0.342±0.038）g和植入期染毒組的（0.395±0.035）g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；植入期染毒組胚胎平均質(zhì)量高于卵泡期染毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035＜0.05），其中，F(xiàn)=38.389。如表2所示，空白對照組6只小鼠均未出現(xiàn)死胎；卵泡期染毒組每只小鼠均出現(xiàn)了死胎，其中，有3只小鼠有2個死胎，有3只小鼠有1個死胎；植入期染毒組中4只小鼠出現(xiàn)了死胎，其中懷胎數(shù)目最多的小鼠出現(xiàn)了3個死胎，其余3只小鼠均有1個死胎。卵泡期染毒組死胎率明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002＜0.05）；植入期染毒組死胎率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027＜0.05）；卵泡期染毒組死胎率高于植入期染毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.024＜0.05）。

表2 六價鉻染毒對不同時期小鼠胚胎數(shù)目的影響 只

3 討論

六價鉻作為人類致癌物，其生殖毒性廣為探討，特別是對長期接觸鉻的高危作業(yè)人群，測定工人中孕婦體內(nèi)尿鉻含量，發(fā)現(xiàn)尿鉻含量越高，新生兒體質(zhì)量以及出生頭圍越?。?］。在六價鉻接觸水平達到一定濃度條件下，鉻作業(yè)男工的精子存活率明顯下降，鉻作業(yè)中女工月經(jīng)異常，主要表現(xiàn)為痛經(jīng)和月經(jīng)周期的紊亂，并且鉻作業(yè)中女工的自然流產(chǎn)率和死產(chǎn)率較高，妊娠結(jié)局較差[7]。

六價鉻在大鼠的器官發(fā)生期（妊娠的7～15 d）具有強烈的胚胎發(fā)育毒性，可導(dǎo)致胚胎外觀、骨骼、內(nèi)臟的畸形率增高，表現(xiàn)為有腭裂、脊柱膨出和骨骼發(fā)育不全等。本實驗采用重鉻酸鉀對卵泡期（妊娠前2 d）和植入期（妊娠的4～6 d）經(jīng)灌胃途徑染毒，旨在尋找六價鉻染毒的敏感位點。分別對小鼠懷孕1 d和解剖當日的體質(zhì)量進行稱重，計算小鼠體質(zhì)量增加量，從而比較三組體質(zhì)量增加量以反映六價鉻染毒對孕體的影響。稱取子宮、胚胎、胎盤的重量，計算子宮和胎盤的臟器系數(shù)，使用臟器系數(shù)反映臟器的萎縮程度，對照空白組，比較卵泡期染毒組和植入期染毒組的臟器系數(shù)降低程度。使用胚胎平均質(zhì)量（每只孕鼠受精情況不一致，導(dǎo)致子宮中胚胎數(shù)量各不相同）反映胚胎的發(fā)育程度。記錄死胎數(shù)。制備常規(guī)石蠟切片，經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄，在高倍鏡下觀察其病理變化。實驗結(jié)果顯示，卵泡期染毒組和植入后期染毒組體質(zhì)量增加量明顯低于空白對照組；卵泡期染毒組和植入期染毒組的臟器系數(shù)相比空白對照組都有了一定程度下降；卵泡期染毒組和植入期染毒組均出現(xiàn)了死胎，表明六價鉻對小鼠的生殖系統(tǒng)有損傷作用。卵泡期染毒組相比植入期染毒組，子宮的臟器系數(shù)下降更為明顯，表明早期染毒對生殖系統(tǒng)的影響更大。卵泡期染毒組死胎率相比植入期染毒組更高且卵泡期染毒組的胚胎平均質(zhì)量較植入期染毒組低，表明卵泡期染毒組胚胎發(fā)育程度較植入期染毒組低，說明胚胎發(fā)育早期對六價鉻的毒性更為敏感，六價鉻對子宮和胚胎的毒性隨著染毒時間的延長增強，具有時間依賴性[8]。另外，觀察胚胎的病理切片，可以發(fā)現(xiàn)卵泡期的胚胎受損程度較強，提示在卵泡期染毒也就是孕前染毒損傷了卵母細胞的遺傳物質(zhì)，使得胚胎無法正常發(fā)育。卵泡期分泌雌激素，雌激素對于整個妊娠期起著至關(guān)重要的作用，對后續(xù)胚胎發(fā)育有著較大的影響，卵泡期染毒受損嚴重是否與雌激素有著密不可分的聯(lián)系，需要進一步進行實驗，實時監(jiān)測孕小鼠體內(nèi)雌激素的量。

植入期染毒組相比卵泡期染毒組胎盤的臟器系數(shù)下降更為明顯，表明植入期染毒組對胎盤的損傷較大。結(jié)合胚胎發(fā)育學(xué)知識，這可能與小鼠胚胎在植入子宮后才伴隨著胎盤的形成有關(guān)，單純植入期在胎盤發(fā)育初始染毒有較強毒性作用，本實驗研究結(jié)果有待進一步證實。