基于高通量測(cè)序分析喙核桃內(nèi)生真菌多樣性

張桂華李旦 何承忠

(1. 西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224；4. 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

喙核桃(Annamocarya sinensis)屬于胡桃科(Juglandaceae)喙核桃屬常綠喬木，是第三紀(jì)古熱帶孑遺植物[1]，為?全國極小種群野生植物保護(hù)實(shí)施方案?中保護(hù)物種，?中國植物紅皮書?中瀕危等級(jí)物種，2021年?國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄?中的二級(jí)保護(hù)植物。喙核桃僅在中國西南部和越南北部有分布，中國僅分布于貴州、廣西、云南[2]。喙核桃繁育困難，自我更新能力弱，野外分布范圍極其狹窄，多年來人為破壞嚴(yán)重，植株數(shù)量極少，極度瀕臨滅絕[3]，有必要對(duì)其展開多方面研究，以解決其瀕臨滅絕的問題。

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細(xì)胞間隙的微生物，可分為植物內(nèi)生真菌、細(xì)菌及放線菌[4，5]。植物內(nèi)生菌與宿主植物之間長期協(xié)同進(jìn)化，形成互利共生關(guān)系，植物能提供內(nèi)生菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，內(nèi)生菌的一些代謝物質(zhì)如生長激素、抗生素、分泌蛋白酶等可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育[6，7]，并且可以協(xié)助參與植物活性成分和次生代謝產(chǎn)物的合成，有些內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物還可以增加宿主植物對(duì)外界惡劣環(huán)境的抗逆性及提高宿主植物的抗病性[8]。Wu 等[9]發(fā)現(xiàn)三七內(nèi)生菌的豐富度大小影響植株正常發(fā)育；Fadaei 等[10]研究表明杜鵑花類菌根真菌能增強(qiáng)杜鵑花科植物的耐鹽性。

對(duì)植物內(nèi)生真菌的分離主要是通過體外培養(yǎng)法純化得到。然而近年來的研究表明，傳統(tǒng)的純化培養(yǎng)法所鑒定的微生物僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%[11]。有的內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，是因人工培養(yǎng)基缺乏來自宿主植物的某些具有相互作用的活性物質(zhì)，從而導(dǎo)致一些內(nèi)生菌不可培養(yǎng)[12]。高通量測(cè)序技術(shù)是新一代測(cè)序方式，具有測(cè)序速度快、信息量大、準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)，將此技術(shù)應(yīng)用于揭示微生物的物種和群落多樣性具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)性[13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，喙核桃自身繁育困難，種子萌發(fā)率極低，無法通過嫁接、扦插等無性繁殖方法擴(kuò)大種群數(shù)量，利用組織培養(yǎng)的方法對(duì)其展開腋芽誘導(dǎo)以及愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)育成完整植株的試驗(yàn)研究，均因內(nèi)生真菌污染導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)喙核桃幼嫩莖段和葉片中真菌rDNA ITS 基因進(jìn)行提取并測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)喙核桃幼嫩莖段和葉片中內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行分析，探討喙核桃內(nèi)生真菌的多樣性，以期為其內(nèi)生真菌資源開發(fā)利用及其他研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2021年12月采摘課題組前期培育于西南林業(yè)大學(xué)苗圃的新鮮、健康、無蟲害喙核桃3年實(shí)生苗幼嫩莖段和葉片作為內(nèi)生真菌測(cè)序所用試驗(yàn)材料。

1.2 材料處理

莖段和葉片材料采集后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，使用洗潔精溶液浸泡20 min，并用軟毛刷擦拭清理材料表面，之后流水沖洗6 h。將沖洗好的材料移至超凈工作臺(tái)上，進(jìn)行不同消毒處理(表1)。

表1 材料預(yù)處理方法

詳細(xì)步驟為:(1)把莖段和葉片移入無菌培養(yǎng)瓶中，使用75%乙醇浸泡消毒5 s 后取出，用無菌水清洗3 次，每次2 min；(2)將莖段和葉片均分為18 等份，取出其中6 份材料裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為B 處理；(3)將余下12 份移入1%新潔爾滅溶液中，浸泡消毒1 min 后取出，用無菌水清洗3 次，每次2 min，再用0.1%氯化汞溶液消毒6 min 后取出，無菌水清洗6 次，每次2 min；(4)將完成消毒的莖段和葉片材料接種至DKW 培養(yǎng)基，(20 ± 3)℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)；(5)暗培養(yǎng)2 d 后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出6 份材料裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為A 處理；(6)暗培養(yǎng)14 d 后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出6 份材料，裝入無菌凍存管－80℃冷凍保存，作為C 處理。

1.3 樣品建庫測(cè)序

將凍存的樣品送北京百邁客生物科技有限公司做進(jìn)一步建庫測(cè)序。具體流程如下:提取樣品總DNA 后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，在引物末端加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000 進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Sequenced Reads)，結(jié)果以FASTQ 文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列(Reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

1.4 信息分析流程

1.4.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 首先使用Trimmomatic v0.33軟件對(duì)測(cè)序得到的Raw Reads 進(jìn)行過濾；然后使用cutadapt 1.9.1 軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads；使用Usearch v10 軟件，通過overlap 對(duì)每個(gè)樣品的Clean Reads 進(jìn)行拼接，然后根據(jù)不同區(qū)域的長度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長度過濾；使用UCHIME v4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Reads)。

1.4.2 OTUs(Operational Taxonomic Units)分析使用Usearch 軟件對(duì)Reads 在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得OTUs。

1.4.3 物種注釋及分類學(xué)分析 以UNITE 為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，得到每個(gè)特征對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平(門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R 語言工具繪制樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

1.4.4 Alpha 多樣性指數(shù)分析 使用QIIME 2 軟件，對(duì)樣品Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

1.4.5 真菌生態(tài)功能預(yù)測(cè)分析 軟件FUNGuild(Fungi Functional Guild)是可用于解析真菌OTUs的工具，基于該軟件對(duì)樣品進(jìn)行生態(tài)功能分析。

1.4.6 真菌關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析 進(jìn)行斯皮爾曼(Spearman)秩相關(guān)分析并篩選相關(guān)性大于0.1 且P值小于0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，并基于Python 繪制真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌ITS 序列數(shù)量與OTUs 數(shù)量分布

18 個(gè)喙核桃樣品中，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生477 021條質(zhì)控序列，平均產(chǎn)生478 005 條質(zhì)控序列。對(duì)所有樣本的有效序列以97%的一致性進(jìn)行OTUs 聚類，然后對(duì)OTUs 序列進(jìn)行物種注釋，共得到832 個(gè)序列，分屬于7 門、33 綱、78 目、163科、278 屬。物種豐度稀釋曲線上升到一定高度后趨于平穩(wěn)(圖1)，表明測(cè)序的深度已足夠代表樣品中大多數(shù)真菌種類，Alpha 多樣性分析結(jié)果能夠代表物種的豐富度。

圖1 樣品稀釋曲線

Venn 圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTUs 數(shù)目，可直觀地表現(xiàn)樣本的OTUs 數(shù)目組成相關(guān)性及重疊情況。由圖2 可知，從喙核桃莖段和葉片中檢測(cè)到的真菌共有OTUs 為686 個(gè)，特有OTUs 分別為114 個(gè)和32 個(gè)，分別占真菌總OTUs 的13.70%、3.85%。

圖2 真菌OTUs 分布Venn 圖

2.2 喙核桃莖段和葉片內(nèi)生真菌群落多樣性和豐富度分析

ACE 或Chao 1 指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高，從表2 可以看出，喙核桃內(nèi)生真菌具有較高的豐富度。真菌ACE 指數(shù)均表現(xiàn)為莖段大于葉片。C 處理Chao 1 指數(shù)表現(xiàn)為葉片大于莖段，Chao 1 是度量物種豐富度的指標(biāo)，其與豐度、均勻度無關(guān)，但是對(duì)稀有物種很敏感，推測(cè)葉片材料中某些稀有菌種在長時(shí)間組培條件下大量繁殖導(dǎo)致C 處理的Chao 1 指數(shù)升高。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)是用來估算菌群多樣性的，Shannon指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，菌群多樣性越高，Shannon 指數(shù)對(duì)群落的豐富度以及稀有OTUs 更敏感，而Simpson 指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTUs 更敏感[14]。Shannon 指數(shù)在A 處理中表現(xiàn)為葉片小于莖段，B 處理中表現(xiàn)為葉片略大于莖段，C 處理中表現(xiàn)為葉片指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于莖段，即自然狀態(tài)下，葉片的真菌多樣性略高于莖段，經(jīng)過2 d 的組織培養(yǎng)后，莖段真菌多樣性高于葉片，但經(jīng)過14 d 組織培養(yǎng)后，莖段真菌的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葉片。Simpson 指數(shù)在A、B 處理中則表現(xiàn)為莖段大于葉片，即自然狀態(tài)和經(jīng)過2 d 的組織培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌的均勻度均表現(xiàn)為葉片大于莖段，而經(jīng)過14 d 組織培養(yǎng)后，莖段Simpson、Shannon指數(shù)降低，葉片的Simpson 指數(shù)略微增大，推測(cè)是由于莖段和葉片在長時(shí)間培養(yǎng)過程中某些稀有真菌急劇增長成為優(yōu)勢(shì)菌屬所致。

表2 Alpha 多樣性指數(shù)分析

2.3 喙核桃莖段和葉片內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 門水平群落結(jié)構(gòu) 由圖3 可以看出，喙核桃葉片和莖段中內(nèi)生真菌門類主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)及未鑒別的菌門(Unclassified)。其中，子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度在葉片和莖段中分別為65.43%和74.08%，為優(yōu)勢(shì)菌門；其次是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，相對(duì)豐度分別為22.54%和12.40%；未得到分類學(xué)注釋的菌門相對(duì)豐度分別為8.86%和11.60%。

圖3 內(nèi)生真菌門水平群落結(jié)構(gòu)

2.3.2 屬水平群落結(jié)構(gòu) 從圖4 可以看出，無論是莖段還是葉片，其屬水平豐度前15 的菌屬均為枝頂孢屬(Acremonium)、維希尼克酵母屬(Vishniacozyma)、枝孢屬(Cladosporium)、被孢霉屬(Mortierella)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、色二孢屬(Diplodia)、亞隔孢殼屬(Didymella)、鏈格孢屬(Alternaria)、酵母屬(Saccharomyces)、擲孢酵母屬(Sporidiobolus)、戈盧別夫氏酵母屬(Golubevia)、馬拉色菌屬(Malassezia)、莖點(diǎn)霉屬(Setophoma)、刺盤孢屬(Colletotrichum)，同時(shí)還有大量未被分類學(xué)注釋的菌屬。

圖4 莖段和葉片內(nèi)生真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)

從圖5 可以看出，不同處理時(shí)期，各菌屬豐度占比具有明顯變化，自然狀態(tài)下(B 處理)，枝頂孢屬為喙核桃莖段中的優(yōu)勢(shì)菌屬，其豐度占比高達(dá)51.80%，而在葉片中的豐度僅為1.74%；維希尼克酵母屬為喙核桃葉片中的優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度占比為14.12%，但其在莖段中的占比僅為9.99%。經(jīng)過2 d 的組織培養(yǎng)后(A 處理)，莖段中豐度前15 的菌屬占比總體呈下降趨勢(shì)，僅占34.75%，與自然狀態(tài)下相比，下降34.45 個(gè)百分點(diǎn)；葉片中的維希尼克酵母屬豐度大幅增長，占比達(dá)24.77%，與自然狀態(tài)下相比，增長10.65 個(gè)百分點(diǎn)，豐度前15 的菌屬占比較自然狀態(tài)下增長16.44 個(gè)百分點(diǎn)。經(jīng)過14 d 的組織培養(yǎng)后(C 處理)，枝頂孢屬和維希尼克酵母屬依舊為莖段和葉片中的優(yōu)勢(shì)菌屬，較自然狀態(tài)，莖段中分別增長13.68 個(gè)百分點(diǎn)和9.21 個(gè)百分點(diǎn)，葉片中枝頂孢屬增長23.86 個(gè)百分點(diǎn)，維希尼克酵母屬則下降5.86 個(gè)百分點(diǎn)；一些菌屬則相對(duì)豐度大幅下降甚至消失，如莖段中亞隔孢殼屬。表明短期組織培養(yǎng)能降低部分菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)導(dǎo)致部分優(yōu)勢(shì)菌屬急劇增長，經(jīng)過長期組織培養(yǎng)后，部分優(yōu)勢(shì)菌屬急劇生長占據(jù)主要生態(tài)位和微生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致其他菌屬相對(duì)豐度降低，甚至消失。此外，喙核桃內(nèi)生真菌在屬水平上仍有較多的菌屬未能被鑒定。

圖5 不同處理下莖段和葉片內(nèi)生真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)

2.4 喙核桃莖段和葉片真菌的生態(tài)功能預(yù)測(cè)

對(duì)3 個(gè)處理的喙核桃莖段和葉片樣本進(jìn)行FUNGuild 真菌功能預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，喙核桃莖段中3 種基本營養(yǎng)型豐度占比分別為共生營養(yǎng)型占15.28%、腐生營養(yǎng)型占49.90%、病理營養(yǎng)型占34.82%，葉片的3 種基本營養(yǎng)型占比為共生營養(yǎng)型占11.25%、腐生營養(yǎng)型占48.93%、病理營養(yǎng)型占39.82%。由圖6 可知，根據(jù)Guilds 小類，又分為植物病原菌(Plant Pathogen)、動(dòng)物病原菌(Animal Pathogen)、真菌寄生菌(Fungal Parasite)、植物內(nèi)生菌(Endophyte)、植物腐生菌(Plant Saprotroph)、木腐生真菌(Wood Saprotroph)、糞腐生真菌(Dung Saprotroph)、外生菌根真菌(Ectomycorrhizal)、叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal)、土壤腐生菌(Soil Saprotroph)、動(dòng)物寄生蟲(Animal Parasite)、動(dòng)物共生真菌(Animal Endosymbiont)、附生真菌(Epiphyte)、杜鵑花類菌根真菌(Ericoid Mycorrhizal)及未定義腐生菌。其中，植物病原菌在自然狀態(tài)(B 處理)的葉片樣本中占比最高，為36.40%，在莖段樣本中占比25.26%；組織培養(yǎng)2 d 后(A 處理)，其占比最多下降21.37個(gè)百分點(diǎn)；經(jīng)過14 d 組織培養(yǎng)后(C 處理)，與B處理比較，至多增長7.30 個(gè)百分點(diǎn)，但其豐度始終低于自然狀態(tài)下。其次，未定義的腐生菌、糞腐生菌、動(dòng)物病原菌在自然狀態(tài)下的相對(duì)豐度低于經(jīng)過組培處理后的；植物內(nèi)生菌、土壤腐生菌的相對(duì)豐度經(jīng)過組培處理后明顯升高，動(dòng)物共生真菌相對(duì)豐度經(jīng)過組培處理后明顯降低。

圖6 真菌生態(tài)功能預(yù)測(cè)

2.5 真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

以相關(guān)性最高的前50 個(gè)屬繪制真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖，從圖7可以看出枝頂孢屬的平均豐度遠(yuǎn)大于其他屬，每個(gè)屬在平均豐度上均存在一個(gè)甚至多個(gè)與其存在關(guān)聯(lián)的屬。除外囊菌屬(Taphrina)與Archaeorhizomyces、尾孢菌屬(Cercospora)與蠟殼菌屬(Sebacina)、枝頂孢屬(Acremonium)與黑團(tuán)孢屬(Periconia)、裂殼屬(Schizothecium)與枝鼻菌屬(Cladorrhinum)等少數(shù)幾個(gè)屬間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系外，其余大多數(shù)屬間呈正相關(guān)關(guān)系，如煤炱屬(Capnodium) 與Scolecoxyphium、擬魏克酵母屬(Wickerhamiella) 與毛孢子菌屬(Cutaneotrichosporon) 等。該關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具有較高的模塊度(0.417)和平均聚類系數(shù)(0.318)。

圖7 真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(屬水平)

3 討論與結(jié)論

本研究首次采用高通量測(cè)序方法對(duì)喙核桃莖段和葉片內(nèi)生真菌的多樣性與群落結(jié)構(gòu)展開分析，以97%的一致性進(jìn)行OTUs 聚類，共得到內(nèi)生真菌OTUs 832 個(gè)，分屬于7 門、33 綱、78 目、163科、278 屬。分析結(jié)果顯示喙核桃內(nèi)生菌具有高豐富度和多樣性，自然狀態(tài)下喙核桃莖段真菌豐富度高于葉片，但多樣性低于葉片，經(jīng)過長期組織培養(yǎng)后，莖段中的優(yōu)勢(shì)真菌屬急劇增長，導(dǎo)致莖段整體真菌群落多樣性大幅度下降，而葉片中真菌群落多樣性在組織培養(yǎng)后增高，表明喙核桃內(nèi)生真菌分布具有隨環(huán)境改變而變化、不同組織分布不同的特點(diǎn)，與惠建超[15]、臧威[16]等研究得到的內(nèi)生真菌群落在不同環(huán)境以及根、莖、葉中分布具有明顯差異的結(jié)論一致。

從門水平群落結(jié)構(gòu)看，喙核桃葉片和莖段中內(nèi)生真菌主要包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、球囊菌門、羅茲菌門、油壺菌門等，其中子囊菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，擔(dān)子菌門為亞優(yōu)勢(shì)菌門。據(jù)McInroy 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物內(nèi)生真菌以子囊菌門和擔(dān)子菌門為主，這與本研究結(jié)果一致。Beinforde 等[18]研究表明子囊菌門大多數(shù)為腐生菌，可以分解難降解性有機(jī)質(zhì)，在養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用，作為喙核桃內(nèi)生優(yōu)勢(shì)真菌的子囊菌門真菌在其養(yǎng)分循環(huán)中同樣起重要作用。從屬水平群落結(jié)構(gòu)看，豐度前15 的菌屬包括枝頂孢屬、維希尼克酵母屬、枝孢屬、被孢霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、莖點(diǎn)霉屬等，其中枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。張向月[19]、周麗思[20]等研究表明，枝頂孢屬、枝孢屬具有促生、抗逆、抗病害和產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物等功能。枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為喙核桃的優(yōu)勢(shì)菌屬，可能也具有相應(yīng)功能。Broeckling 等[21]研究認(rèn)為被孢霉屬相較其他真菌更易在貧瘠生境中生長，從而導(dǎo)致其相對(duì)豐度較其他類群真菌高，推測(cè)是其在喙核桃植株內(nèi)有高豐度的原因。de Oliveira Rocha 等[22]研究表明鐮刀菌可造成植物根、莖、葉的腐爛萎蔫，引起苗枯、穗腐、植物種子和塊莖的腐爛等；于莉等[23]研究表明莖點(diǎn)霉屬真菌是一種重要的病原菌，有強(qiáng)烈的纖維素酶活性，會(huì)引起植物的莖腐、枝枯癥狀，這些菌屬是導(dǎo)致組培試驗(yàn)中材料污染、死亡及腐爛的主導(dǎo)因素。

喙核桃莖段和葉片中的真菌以腐生營養(yǎng)型為主，平均相對(duì)豐度分別為49.41%，其次為病理營養(yǎng)型(37.32%)，而共生營養(yǎng)型的平均相對(duì)豐度較低，僅為13.26%。在Guilds 小類中，發(fā)現(xiàn)植物病原菌在自然狀態(tài)的葉片樣本中占比最高，在已知的植物病害中，70%～80%是由植物病原真菌引起的[24]，推測(cè)其是喙核桃幼苗在野外條件下存活率低的原因之一，同時(shí)也是導(dǎo)致組培試驗(yàn)失敗的致病真菌。石晶盈等[25]研究發(fā)現(xiàn)感染內(nèi)生菌的植株往往比未感染內(nèi)生菌的植株更具生存競爭力，并表現(xiàn)出生長快速、抗病害、抗動(dòng)物危害等生存優(yōu)勢(shì)；Huang 等[26]研究發(fā)現(xiàn)具有菌根真菌定植的植物可能因其真菌共生體提高10%～20%的光合作用效率；曲躍軍等[27]研究發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌可以作為因傷害引起的植物病原體的生物防治真菌，還可以利用其代謝物質(zhì)提高農(nóng)作物的效率。外生菌根真菌菌絲體既可以增加植物根系吸收面積來增強(qiáng)植物獲取水分和營養(yǎng)的能力，還可以提高作物對(duì)干旱、重金屬、病蟲害的抵抗力[28]，推測(cè)這些真菌在喙核桃植株內(nèi)具有一定的促生長發(fā)育和增強(qiáng)抗逆、抗病能力。此外，動(dòng)物病原菌、真菌寄生菌、動(dòng)物寄生蟲、動(dòng)物共生真菌等也被檢測(cè)出來，其與各種腐生菌和寄生菌組成了多功能的營養(yǎng)型。

喙核桃內(nèi)生真菌具有較高豐富度和多樣性，且有較多的菌屬及菌種未能被鑒定，說明喙核桃植物的內(nèi)生真菌還有很廣的研究面，值得繼續(xù)深入研究。子囊菌門為其優(yōu)勢(shì)菌門，豐度占比最高達(dá)74.08%，枝頂孢屬、維希尼克酵母屬為其優(yōu)勢(shì)菌屬和亞優(yōu)勢(shì)菌屬，經(jīng)組織培養(yǎng)處理后，能降低部分真菌的相對(duì)豐度，但不能使其滅亡，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度的急劇增長。真菌以腐生營養(yǎng)型為主，平均相對(duì)豐度達(dá)49.41%，真菌生態(tài)功能群包括植物病原菌、動(dòng)物病原菌、真菌寄生菌、植物內(nèi)生菌、植物腐生菌、木腐生菌、糞腐生真菌、外生菌根真菌、叢枝菌根真菌、土壤腐生菌、動(dòng)物寄生蟲、動(dòng)物共生真菌、附生植真菌、杜鵑花類菌根及未定義腐生菌。真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系顯示每個(gè)屬在平均豐度上均存在一個(gè)甚至多個(gè)與其存在關(guān)聯(lián)的屬，除少數(shù)幾個(gè)屬間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其余大多數(shù)屬間呈正相關(guān)關(guān)系。

致謝:本研究依托西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院完成。