陳雪蓮 綜述 鄒文軍,2 審校

(1.南通大學(xué)無錫臨床學(xué)院眼科，江蘇 無錫 214002；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院眼科，江蘇 無錫 214002)

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)炎性脫髓鞘性疾病，以視神經(jīng)、脊髓和大腦受累為主要特征[1]，該疾病在亞洲人群中高發(fā)，易復(fù)發(fā)且致盲、致殘率高，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。60%～80%的NMOSD患者血清水通道蛋白4 抗體陽性(aquaporin 4 immunoglobulin G，AQP4‐IgG)[3]，其病理特征主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，AQP4和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)丟失，顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤及小膠質(zhì)細(xì)胞激活[4]。然而臨床上還有20%～30% NMOSD患者血清AQP4‐IgG陰性[5]，這表明NMOSD的發(fā)病可能與其他因素相關(guān)。目前關(guān)于NMOSD動(dòng)物模型主要建立在AQP4‐IgG致病基礎(chǔ)上，包括通過破壞或繞過血腦屏障(blood‐brain barrier，BBB)方式被動(dòng)轉(zhuǎn)移AQP4‐IgG或直接轉(zhuǎn)移AQP4特異性T細(xì)胞等。但現(xiàn)有的動(dòng)物模型尚不能完全模擬NMOSD患者，尤其血清AQP4‐IgG陰性NMOSD患者的臨床與病理特征，因此本文將對(duì)近年來國內(nèi)外文獻(xiàn)中建立的NMOSD動(dòng)物模型進(jìn)行綜述，為更加理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備提供思路。

1 破壞BBB 被動(dòng)轉(zhuǎn)移AQP4-IgG

1.1 EAE 相關(guān)動(dòng)物模型

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(exper imental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一種廣泛應(yīng)用于多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[6]，該模型通常由髓鞘衍生蛋白或佐劑肽的主動(dòng)免疫或活性髓鞘特異性CD4+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)，其特征是免疫細(xì)胞介導(dǎo)的CNS脫髓鞘和神經(jīng)變性。研究[7]發(fā)現(xiàn)當(dāng)EAE動(dòng)物出現(xiàn)CNS炎癥的臨床癥狀時(shí)，BBB被打開，這時(shí)給EAE大鼠腹腔注射AQP4‐Ig G，可以加劇E AE進(jìn)程，并誘發(fā)NMO樣病變，如補(bǔ)體激活、免疫球蛋白沉積、脊髓血管周圍區(qū)域的粒細(xì)胞浸潤、AQP4和星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失等[8]。但是，AQP4‐IgG是否只有在存在CNS抗原性T細(xì)胞的情況下才致病尚不明確。隨后，一項(xiàng)研究[9]證明僅使用完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)進(jìn)行預(yù)處理破壞BBB，足以讓AQP4‐IgG在體內(nèi)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。Saini等[10]對(duì)EAE小鼠長(zhǎng)期多次腹腔注射AQP4‐IgG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠體重持續(xù)下降，并且有明顯脫髓鞘、軸突損傷和炎性細(xì)胞浸潤。為建立臨床和病理上與人NMO更為接近的重癥急性實(shí)驗(yàn)性NMO模型，Kurosawa等[11]將純化的AQP4‐IgG或高親和力的抗AQP4單克隆抗體注射到髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)免疫的Lewis大鼠腹腔中，結(jié)果誘導(dǎo)了典型的AQP4和GFAP缺失的星形細(xì)胞病變，并以劑量依賴方式動(dòng)員中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致NMO早期病變擴(kuò)大及繼發(fā)性脫髓鞘和軸突損傷。

EAE相關(guān)NMOSD動(dòng)物模型是研究該疾病形成初始階段的合適模型，證明了AQP4‐IgG具有致病作用。但EAE動(dòng)物涉及髓鞘致敏的T細(xì)胞的靶向反應(yīng)與NMOSD中AQP4‐IgG靶向的體液反應(yīng)不同，且EAE動(dòng)物不僅破壞BBB，而且營造了CNS炎性環(huán)境，這與NMOSD自身的炎性反應(yīng)可能會(huì)混淆。

1.2 細(xì)胞因子破壞BBB

Kitic等[12]將白介素‐1β(interleukin‐1β，IL‐1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor‐α，TNF‐α)、白細(xì)胞介素‐6(interleukin‐6，IL‐6)、干擾素‐ γ(interferon‐γ，INF‐ γ)或趨化因子CXCL2等細(xì)胞因子立體定向注射到AQP4‐IgG血清陽性大鼠的紋狀體中，結(jié)果導(dǎo)致AQP4‐IgG廣泛滲漏到CNS中，但是只有IL‐1β可導(dǎo)致大腦半球白細(xì)胞的遷移及聚集、血管周圍中性粒細(xì)胞浸潤區(qū)域AQP4表達(dá)降低和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這些表明IL‐1β改變了BBB的通透性，從而可使外周血中的AQP4‐IgG滲入到注射細(xì)胞因子的大腦半球內(nèi)而引起CNS損傷，而且NMO損傷區(qū)域激活的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞含有更多的IL‐1β，表明IL‐1β作為重要的繼發(fā)因子在CNS損傷形成和炎性細(xì)胞聚集的過程中發(fā)揮重要作用。

此模型有利于研究炎性細(xì)胞因子對(duì)AQP4‐IgG陽性動(dòng)物CNS損害的致病作用，并為細(xì)胞因子的治療提供依據(jù)，不足之處是只有注射部位附近小片區(qū)域有病變，并且對(duì)外科操作要求較高。

1.3 脈沖聚焦超聲開放BBB

研究[13]證明聚焦超聲聯(lián)合微泡對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障具有滲透作用。管陽太等[14]在EAE模型基礎(chǔ)上，通過低頻聚焦超聲開放BBB，然后經(jīng)尾靜脈注射NMO患者血清及補(bǔ)體，使AQP4‐IgG及補(bǔ)體可以進(jìn)入CNS。Yao等[13]在聚焦超聲聯(lián)合微泡處理血清AQP4‐IgG陽性大鼠后立即靜脈注射重組人AQP4‐IgG，第5天出現(xiàn)腦部出現(xiàn)局限性的NMO病理改變，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷、炎癥和脫髓鞘。當(dāng)超聲聚焦于脊髓時(shí)，AQP4‐IgG陽性大鼠脊髓也出現(xiàn)類似的NMO病理改變，頸髓免疫染色也顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物丟失、脫髓鞘、炎癥和活化補(bǔ)體沉積。

聚焦超聲聯(lián)合微泡為AQP4‐Ig G陽性大鼠提供了一種非侵入性的、有針對(duì)性的方法來制造NMO病理。這些發(fā)現(xiàn)表明AQP4‐IgG陽性大鼠的BBB通透性增高，并且在沒有潛在的損傷或炎癥情況下，AQP4‐IgG足以造成NMO病理改變。但是該方法需要仔細(xì)選擇超聲暴露參數(shù)，包括聲壓、脈沖寬度和重復(fù)頻率以及總暴露時(shí)間等，但對(duì)于一些更精確的應(yīng)用，比如視神經(jīng)等需要進(jìn)一步探索。

2 繞過BBB 被動(dòng)轉(zhuǎn)移AQP4-IgG

2.1 AQP4-IgG 和人類補(bǔ)體局部注射

聯(lián)合AQP4‐IgG和人類補(bǔ)體經(jīng)鞘內(nèi)注射到小鼠腦脊液循環(huán)中[15]，結(jié)果誘導(dǎo)視神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞病理變化，并發(fā)現(xiàn)AQP4和GFAP的丟失，此外還觀察到局灶性脫髓鞘。將AQP4‐IgG與補(bǔ)體直接注射入小鼠腦內(nèi)，7 d后發(fā)現(xiàn)大腦出現(xiàn)明顯脫髓鞘現(xiàn)象及AQP4和GFAP丟失[16]。而Zhang等[17]將AQP4‐Ig G和補(bǔ)體注射到CD59-/-小鼠L5～L6脊髓鞘內(nèi)，2 d后小鼠表現(xiàn)出縱向廣泛的脊髓病理改變(超過3個(gè)節(jié)段)，并且軟腦膜附近和白質(zhì)多個(gè)位置可見AQP4和GFAP的縱向廣泛丟失，以及白蛋白外滲和病灶附近反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色增加。Asavapanumas等[18]在CD1小鼠視交叉附近連續(xù)3 d輸注AQP4‐Ig G和補(bǔ)體，視神經(jīng)表現(xiàn)出特征性的NMO病理學(xué)改變，如粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤、活化補(bǔ)體的沉積、脫髓鞘和軸突損傷，并伴有AQP4的喪失和GFAP的免疫反應(yīng)性改變。當(dāng)給CD59-/-小鼠注射NMO‐IgG或給野生型小鼠注射具有增強(qiáng)補(bǔ)體效應(yīng)功能的突變NMO抗體時(shí)，視神經(jīng)病理加重，還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)的顯著喪失。

此類動(dòng)物模型不需要破壞C N S，只需將AQP4‐Ig G與補(bǔ)體注入大腦、脊髓或視交叉等部位，AQP4‐IgG即可與星形膠質(zhì)細(xì)胞上的AQP4結(jié)合，繼而造成病理性損傷，因此此類動(dòng)物模型較易建立。其次該類模型僅需少量AQP4‐Ig G，而且脫髓鞘行為是可以量化的，因此它是研究NMOSD治療的理想工具。但是因?yàn)樾∈笞陨淼难a(bǔ)體系統(tǒng)薄弱，并且由于小鼠血清可強(qiáng)烈抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑，因此AQP4‐IgG不能激活小鼠自身補(bǔ)體[19]。最后NMOSD主要是由血液循環(huán)中抗體的存在引起的，而不是由腦脊液中抗體的存在引起的。因此，此類模型并不能準(zhǔn)確地模擬NMOSD的生理過程。

2.2 AQP4-IgG 局部注射

繞過BBB，給Lewis大鼠腦內(nèi)或鞘膜局部注射AQP4‐Ig G后，可發(fā)現(xiàn)大鼠針跡周圍產(chǎn)生了明顯病變，5 d后可觀察到AQP4、GFAP和髓鞘明顯丟失，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，血管中心性補(bǔ)體沉積，血腦屏障破壞以及小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元死亡[20]。Yao等[21]給CD59-/-大鼠腦內(nèi)注射AQP4‐IgG，3 d后動(dòng)物出現(xiàn)后肢癱瘓，脊髓、視神經(jīng)、腦室周圍和腦室表面均有炎癥和活化補(bǔ)體沉積現(xiàn)象，其中頸段脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷最為明顯。這些研究都表明在單獨(dú)注射AQP4‐IgG的情況下，動(dòng)物利用了自身內(nèi)源性補(bǔ)體。

大鼠可利用自身內(nèi)源性補(bǔ)體，這與人NMOSD的發(fā)病機(jī)制更為相似，對(duì)于研究AQP4‐IgG致病機(jī)制具有較大價(jià)值。但上述研究發(fā)現(xiàn)部位局限于注射區(qū)域，缺乏視神經(jīng)或脊髓等好發(fā)部位的觀察證據(jù)，也無法模擬出NMOSD病程中視神經(jīng)及脊髓易受累的疾病特點(diǎn)。最后該模型沒有涉及觸發(fā)AQP4‐IgG產(chǎn)生或進(jìn)入CNS的免疫機(jī)制，也沒有解決NMO病理在脊髓和視神經(jīng)中的優(yōu)先定位。

2.3 AQP4-IgG 陽性血清局部注射

Zhang等[22]將AQP4‐IgG陽性NMOSD患者血清注入到大鼠視神經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔，3 d后視神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的AQP4‐Ig G表達(dá)。視覺誘發(fā)電位(visual evoked potential，VEP)顯示N1‐P1峰值和瞳孔對(duì)光反射在第1周內(nèi)降低，之后一直保持在較低水平，并且視盤周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的厚度也大大減少。3周后發(fā)現(xiàn)RGC消失，視神經(jīng)出現(xiàn)典型的NMOSD樣病理改變，包括AQP4‐IgG沉積、局部星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷、脫髓鞘、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、巨噬細(xì)胞浸潤和軸突損傷。Matsumoto等[23]、Nobuyoshi等[24]將視神經(jīng)暴露于AQP4‐IgG陽性患者的血清中，可發(fā)現(xiàn)RGC密度降低，AQP4和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)減少，還有大量炎性細(xì)胞浸潤。

此類模型證明了AQP4‐IgG陽性血清對(duì)視神經(jīng)具有一定的致病作用，并且對(duì)研究視神經(jīng)及視網(wǎng)膜病理具有較強(qiáng)的可操作性，彌補(bǔ)了其他動(dòng)物模型關(guān)于視神經(jīng)病變?nèi)狈ρ芯康牟蛔?，但是操作過程對(duì)視神經(jīng)本身具有一定程度的損傷，無法判斷視神經(jīng)病變是否與損傷有關(guān)。

3 AQP4 特異性T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型

早期研究[25]表明AQP4特異性T細(xì)胞在NMO發(fā)病中具有潛在作用，而使用AQP422‐36或AQP4289‐303肽對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫的研究未發(fā)現(xiàn)病理學(xué)改變。Jones等[26]通過使用AQP4肽免疫AQP4敲除的C56BL/6小鼠產(chǎn)生AQP4特異性T細(xì)胞，這種方法消除了使用野生型小鼠產(chǎn)生的T細(xì)胞的潛在免疫耐受性。將AQP4特異性T細(xì)胞極化為更強(qiáng)的促炎性Th17表型，觸發(fā)針對(duì)CNS富含AQP4區(qū)域的攻擊，然后招募免疫系統(tǒng)的其他成分，如抗體和補(bǔ)體，造成星形細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致更嚴(yán)重的脫髓鞘和神經(jīng)功能障礙。然而，盡管存在廣泛的炎癥和脫髓鞘，但作為NMO標(biāo)志的AQP4缺失并未出現(xiàn)。在另一項(xiàng)研究[27]中，用AQP4207‐232肽免疫Lewis大鼠產(chǎn)生AQP4特異性T細(xì)胞，從淋巴結(jié)分離肽特異性T細(xì)胞系。接受AQP4特異性T細(xì)胞的大鼠在腦和脊髓中顯示出炎癥，但沒有星形膠質(zhì)細(xì)胞或髓鞘損傷。然而，將AQP4207‐232特異性T細(xì)胞與來自NMO患者血清的AQP4‐IgG一起轉(zhuǎn)移，則會(huì)產(chǎn)生更嚴(yán)重的病理變化及T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的實(shí)質(zhì)浸潤和補(bǔ)體沉積。

該模型證實(shí)AQP4反應(yīng)性T細(xì)胞可導(dǎo)致CNS少突膠質(zhì)細(xì)胞損害的潛在作用，利于嘗試針對(duì)AQP4抗原的特異性免疫治療，但操作步驟較多，精細(xì)度要求較高，成功率較低。該模型為研究疾病發(fā)病機(jī)制中T細(xì)胞介導(dǎo)的抗體非依賴性途徑提供了工具。

4 結(jié)語

目前NMOSD的動(dòng)物模型研究已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，對(duì)研究該疾病發(fā)病機(jī)制或評(píng)估新的治療方法具有重大意義。BBB的破壞是NMOSD發(fā)病機(jī)制的第一步，通過破壞BBB使抗體順利進(jìn)入CNS是研究AQP4‐IgG致病作用的重要模型。然而EAE動(dòng)物模型不僅破壞了BBB，其自身CNS的炎癥狀態(tài)對(duì)AQP4‐Ig G造成的炎癥作用具有干擾作用，且兩者之間的免疫反應(yīng)完全不同，因此對(duì)于研究NMOSD免疫機(jī)制作用甚微。紋狀體內(nèi)注射細(xì)胞因子相關(guān)模型證明了細(xì)胞因子在NMOSD發(fā)病機(jī)制中的重要作用，這對(duì)于研究細(xì)胞因子治療具有重要意義。聚焦超聲聯(lián)合微泡打開BBB是一種相對(duì)無創(chuàng)性操作，對(duì)研究AQP4‐Ig G致病機(jī)制具有一定意義，但是目前尚不清楚聚焦超聲聯(lián)合微泡這一操作對(duì)CNS是否造成傷害。而繞過BBB局部注射AQP4‐Ig G對(duì)于研究大腦、脊髓或視神經(jīng)這些具體部位的局限性病變具有較大意義，尤其是彌補(bǔ)了其他動(dòng)物模型缺乏關(guān)于研究視神經(jīng)病變的不足。上述模型均證明AQP4特異性抗體在疾病過程的作用，但是NMOSD患者CNS的炎癥病變特點(diǎn)是T細(xì)胞浸潤，因此AQP4特異性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型證明了其在病變形成中的潛在作用，并支持NMOSD病變可能是由于T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)AQP4的體液免疫反應(yīng)的復(fù)雜相關(guān)作用引起的。因此該模對(duì)研究針對(duì)AQP4抗原的特異性免疫治療具有重大意義。

鑒于現(xiàn)有動(dòng)物模型的各種缺點(diǎn)以及缺乏在視神經(jīng)和脊髓中的自發(fā)性免疫反應(yīng)，目前應(yīng)繼續(xù)推動(dòng)NMOSD動(dòng)物模型的研究。并且約40%的NMOSD患者在患病前已經(jīng)存在自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等[28]，這些免疫性疾病的特異性自身抗體對(duì)于NMOSD的可能發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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