楊亞藍，宗上綱，王莉，王峰

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052； 2.河南省醫(yī)學科學院，河南 鄭州 450052)

免疫治療新時代的到來，極大地改變了腫瘤治療模式[1]。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞作為新興的過繼性免疫治療策略，已成為近年來腫瘤治療研究領域的熱點和焦點[2-3]。血液中的T細胞經(jīng)過分離活化、基因修飾和改造、體外擴增、體內(nèi)回輸?shù)纫幌盗羞^程，可識別特定腫瘤表面抗原并發(fā)揮靶細胞殺傷作用[3]。目前，CAR-T細胞治療B細胞白血病或淋巴瘤亞群，總體緩解率高且作用持久，這給腫瘤免疫治療帶來革命性的改變[4-5]。同時，CAR-T細胞免疫療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中的成功為實體瘤的治愈提供了新的希望，一系列CAR-T細胞的早期臨床試驗在實體瘤中開展[6-9]。與血液系統(tǒng)疾病相比，選擇適當?shù)哪[瘤特異性抗原、增加CAR-T細胞在腫瘤位點的歸巢、中和免疫抑制微環(huán)境、克服CAR-T細胞毒性是阻礙實體瘤中CAR-T細胞發(fā)揮療效的重要因素。本綜述回顧了CAR-T 細胞的研究進展，指出了CAR-T細胞在實體瘤治療中面臨的挑戰(zhàn)和新的策略，旨在為CAR-T細胞治療實體瘤的臨床前實驗和臨床試驗提供新的思路。

1 CAR-T細胞的發(fā)展

CARs是基因工程受體，主要由細胞外抗原識別域(胞外域)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導域(內(nèi)域)共4部分組成[10]。胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域主要為靶抗原-抗體的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)，由重鏈可變區(qū)(heavy chain variable，VH)和輕鏈可變區(qū)(light chain variable，VL)組成，是CAR-T細胞特異性識別靶細胞的“定位器”，通過引起主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)非依賴性T細胞活化[11]，發(fā)揮特異性殺傷作用。鉸鏈區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域是細胞外和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的“連接器”，有助于CARs表達和穩(wěn)定性的增強、CARs和抗原的相互識別、CAR-T激活的刺激信號的募集及免疫突觸形成。鉸鏈區(qū)的長度和組成差異是影響CARs的重要因素，最常用的鉸鏈區(qū)來自CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列?？缒そY(jié)構(gòu)域的主要功能是將CARs錨定在T細胞膜上，通常為CD3ζ、CD4、CD8α 或 CD28的跨膜區(qū)。胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域主要由刺激因子CD3ζ鏈組成，常與CD28、ICOS、OX40(CD134)和4-1BB (CD137)等共刺激分子結(jié)合[12-13]，是激活T細胞所必需的“信號器”，可介導細胞增殖、細胞因子分泌和細胞殺傷。

CAR-T細胞歷經(jīng)五代，其主要區(qū)別在于特定的共刺激分子不同[1-2]。90年代設計的第一代CAR-T細胞僅包含CD3ζ信號域，由于缺乏共刺激分子，T細胞活化的觸發(fā)和持久性極不穩(wěn)定，臨床研究顯示其療效有限或無效[14]。為克服這一缺點，第二代CAR-T細胞將CD3ζ與共刺激分子[CD28、4-1BB (CD137)、ICOS、OX40(CD134)等]串聯(lián)，從而使CAR-T細胞持續(xù)增殖，在多種實體瘤中展現(xiàn)更強的抗腫瘤活性[12-13,15-16]。CD28和4-1BB(CD137)為最常見的、美國食品藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準的共刺激域，均與患者反應率高相關(guān)[17]。為了更好地激活T細胞，第三代CAR-T細胞將2個共刺激分子與CD3ζ串聯(lián)，使細胞因子分泌增多，對癌細胞增殖的抑制作用增強[18]。三代CAR-T細胞在實體瘤中展現(xiàn)不同的療效[19-20]。通過編碼細胞因子的基因，第四代CAR-T細胞在激活時分泌大量炎癥細胞因子，如白細胞介素(interleukin，IL)-12[21]、IL-15和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子[22-23]等，以進一步增強T細胞應答并招募先天免疫細胞(巨噬細胞和NK細胞等)，從而對抗免疫抑制性腫瘤微環(huán)境?；蚣尤胱詺⒒蛘{(diào)控細胞衰竭，以提高CAR-T細胞的安全性和可控性[24]。有研究表明，四代CAR-T細胞在肝癌[25]、三陰性乳腺癌[26]、神經(jīng)母細胞瘤[27]等顯示出顯著的抗腫瘤活性。第五代CAR-T細胞也稱為“通用型”CAR-T細胞，利用基因編輯技術(shù)敲除健康供者T細胞上的T細胞抗原受體和Ⅰ型人類白細胞抗原基因，以降低免疫排斥反應，避免移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)的發(fā)生[28-30]。在實體瘤模型中，第五代CARs通過基因改造增強了T細胞增殖、存活及抗腫瘤作用，但第五代CAR-T細胞的安全性和有效性有待研究[28]。

2 CAR-T細胞治療面臨的挑戰(zhàn)

2.1 CAR-T細胞靶抗原的選擇CARs通過識別并結(jié)合特定的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)，進而激活下游信號通路以引發(fā)T細胞介導的靶細胞殺傷[2,31]。目前正在研究實體瘤中的多個靶點用于CAR-T細胞治療，包括人表皮生長因子受體-2、癌胚抗原、唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2、IL-13Rα、表皮生長因子受體、黏蛋白1和前列腺特異性膜抗原。由于大多數(shù)TAA在腫瘤和健康組織上均有表達，CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞的同時會破壞正常細胞，引起“靶向腫瘤外”毒性。同種異體CAR-T細胞的輸注甚至導致GVHD的發(fā)生。此外，與血液腫瘤相比，實體瘤具有獨特的抗原異質(zhì)性特點，CAR-T細胞優(yōu)先殺傷靶抗原高表達的腫瘤細胞，且治療后靶抗原下調(diào)和丟失，這種“脫靶效應”不僅削弱了CAR-T療法的效果，而且使腫瘤細胞能順利逃避T細胞的免疫監(jiān)視，從而引起耐藥和腫瘤復發(fā)[32]。因此，定位適當和特定的靶抗原是實體瘤CAR-T細胞療法面臨的極大挑戰(zhàn)。

單抗原靶向CAR-T細胞易誘發(fā)耐藥性和腫瘤復發(fā)。在臨床前模型中，雙靶向或多靶向CAR-T細胞，如膠質(zhì)母細胞瘤(HER2/IL13Rα2)、髓母細胞瘤(HER2/IL13Rα2/EphA2)，不僅可以改善抗腫瘤反應，還可以減少抗原逃逸以防止復發(fā)，但其安全性仍需進一步研究[33]。此外，將上調(diào)腫瘤相關(guān)抗原的表達、靶向腫瘤限制性翻譯后修飾作為創(chuàng)新策略，以增強特異性抗原識別，以期更有效地控制腫瘤生長。

2.2 CAR-T細胞歸巢不良CAR-T細胞的靶向運輸和腫瘤浸潤能力是實體瘤中CAR-T細胞療效欠佳的重要原因[34]。腫瘤微環(huán)境中一系列屏障的形成阻礙了CAR-T細胞歸巢，包括物理屏障(基質(zhì)成分)、代謝屏障(氧化應激、無氧糖酵解及乳酸堆積)及免疫屏障(可溶性抑制因子、免疫抑制性靶點及細胞)[34-35]。采用局部給藥的策略，避免了CAR-T細胞向疾病部位的運輸，并限制了靶向外腫瘤毒性。臨床前模型已經(jīng)證明在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、惡性胸膜間皮瘤中局部CAR-T細胞治療具有卓越的效果，相應的臨床試驗正在進行[36-37]。然而，這種方法受到其高技術(shù)復雜性的限制，且局限于單個腫瘤病變/寡轉(zhuǎn)移性疾病。

過表達CAR-T細胞中的趨化因子受體作為另一新策略，可促進CAR-T細胞向高表達同源配體的腫瘤部位遷移，增強T細胞的持久性，并可招募宿主體內(nèi)的免疫細胞(如樹突狀細胞等)，從而顯著增強抗腫瘤功效[38-39]。這在胰腺癌、卵巢癌[38]、膠質(zhì)母細胞瘤[39]和惡性間皮瘤[40]等的臨床前模型中被證實，其有效性及安全性有待進一步在體內(nèi)驗證。此外，過表達調(diào)控基質(zhì)降解酶的基因、靶向成纖維細胞活化蛋白等策略，可通過調(diào)節(jié)物理屏障，來提高腫瘤穿透性，以便將治療效果擴展到復雜的實體瘤和轉(zhuǎn)移灶[41-42]。

2.3 中和免疫抑制微環(huán)境CAR-T細胞治療實體瘤的臨床效果受到免疫抑制性微環(huán)境的限制，例如缺氧、氧化應激、腫瘤源性細胞因子抑制、免疫抑制性檢查點及細胞等[32,35]。既往研究表明，腫瘤細胞可釋放多種免疫抑制因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β 和前列腺素E2，激活抑制性免疫細胞(調(diào)節(jié)性T細胞、髓源性抑制細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞)，從而形成腫瘤免疫抑制性微環(huán)境。通過基因工程敲除免疫檢查點(程序性死亡受體1、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4、淋巴細胞激活基因3等)[29,43]、改造抑制性細胞因子受體[39]、調(diào)控代謝及凋亡相關(guān)基因[41]等，以逆轉(zhuǎn)CAR-T細胞的耗竭表型，改善實體瘤中的T細胞浸潤和功能。在腎細胞癌、黑色素瘤等實體瘤相關(guān)的臨床前研究中，敲除免疫檢查點的CAR-T細胞抗腫瘤活性顯著提高，相應的臨床試驗在食管癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、轉(zhuǎn)移性腎癌、黑色素瘤、乳腺癌等實體瘤中開展[44]。此外，CAR-T細胞和免疫檢查點阻斷劑聯(lián)合療法被認為是有期望的策略。

2.4 克服CAR-T細胞相關(guān)毒性盡管CAR-T細胞在某些類型的癌癥患者中取得了持久的臨床反應，特別是表達CD19的難治性和復發(fā)性B細胞惡性腫瘤，但其可能會發(fā)生與誘導強大的免疫效應反應直接相關(guān)的毒性[45]。最常觀察到的免疫介導的毒性是細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)和免疫效應細胞相關(guān)的神經(jīng)毒性綜合征(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)。CRS與超生理細胞因子產(chǎn)生和大量體內(nèi)T細胞擴增有關(guān)，可能導致發(fā)燒、低血壓、缺氧、惡心、疲勞、多器官衰竭，甚至死亡。早期識別和管理CRS的癥狀和體征，可以預防或逆轉(zhuǎn)大多數(shù)患者的器官功能障礙。ICANS的特征是腦脊液細胞因子水平升高和血腦屏障破壞，通常表現(xiàn)為中毒性腦病、癲癇發(fā)作、運動無力、腦水腫和昏迷。ICANS通常發(fā)生在CRS癥狀消退后，在大多數(shù)無永久性神經(jīng)功能缺損的患者中是可逆的。設計新的CARs結(jié)構(gòu)以最大限度地降低引發(fā)CRS和ICANS的風險，同時優(yōu)化腫瘤抗原的識別和有效的T細胞信號傳導。熟練掌握CRS和ICANS的癥狀和體征，是早期識別和管理這些并發(fā)癥的可靠前提。

3 以CAR-T細胞治療為主導的綜合治療的前景

研究表明，CAR-T細胞單一療法對實體瘤的療效有限。CAR-T細胞聯(lián)合其他治療的綜合性治療策略，可能作為實體瘤治療的可發(fā)展新策略[46]。目前聯(lián)合療法研究主要是在臨床前環(huán)境中。

3.1 聯(lián)合放療放射治療可誘導腫瘤壞死和細胞凋亡。研究表明，放療可能是通過增加靶抗原表達、CAR-T細胞浸潤和細胞因子/趨化因子表達，以及通過增強內(nèi)源性靶抗原特異性免疫以促進更持久的反應，間接提高CAR-T細胞的功效[47-48]。此外，放射治療可能通過促進內(nèi)皮細胞表面的黏附分子表達顯著增加，影響腫瘤血管正?；?，從而促進免疫效應細胞的歸巢和遷移[48]。

3.2 聯(lián)合化療化療和CAR-T細胞聯(lián)合治療具有一定的抗腫瘤協(xié)同作用。臨床前研究顯示，低劑量化療給藥不僅能減輕腫瘤負荷、增強腫瘤細胞對免疫治療的敏感性，而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，其細胞毒性作用促進了腫瘤抗原的識別和呈遞，這有利于中和免疫抑制性細胞，延長CAR-T細胞的持久性[49-50]。

3.3 聯(lián)合靶向治療或表觀遺傳抑制劑抗血管生成劑和檢查點抑制劑的組合在多種實體瘤類型的許多臨床試驗中提供了更強大的治療選擇[51]。大量的臨床前和臨床證據(jù)表明抗血管生成在克服免疫治療耐藥性方面起著關(guān)鍵作用。臨床前研究表明，CAR-T細胞與抗血管生成療法聯(lián)合使用時，可以通過上調(diào)內(nèi)皮細胞上的黏附分子使腫瘤血管正?；纳芓細胞功能障礙，從而增強T細胞歸巢和殺傷作用[52]。另一臨床前研究表明，靶向CDK7的小分子抑制劑和EGFR CAR-T細胞的聯(lián)合治療可抑制三陰性乳腺癌模型中的免疫耐藥、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[53]。

3.4 聯(lián)合其他免疫治療T細胞表面免疫檢查點受體的獲得性表達是介導T細胞衰竭的重要機制。研究表明，添加抗程序性死亡受體1單克隆抗體[52,54]或能夠分泌抗程序性死亡受體-配體1的CAR-T細胞[55]可以阻斷受體的抑制作用，減少CAR-T細胞的衰竭，從而提高其清除腫瘤的療效和持久性。同樣地，抗細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4抗體也可增加T細胞活性，改善免疫功能活性[43]。

4 挑戰(zhàn)與展望

CAR-T細胞療法極大地改變了當前腫瘤免疫治療的模式[1-2,31]。盡管CAR-T細胞療法正在被廣泛研究并在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了極大的成功，但其在實體瘤中的安全性和有效性仍不清楚[9]。這與實體瘤中缺乏腫瘤特異性抗原、低水平CAR-T細胞浸潤、抑制性腫瘤微環(huán)境及CAR-T細胞的毒性等密切相關(guān)[10,32,34]。目前許多研究嘗試通過選擇不同靶抗原、聯(lián)合共刺激分子、調(diào)節(jié)促炎性或抑制性細胞因子或阻斷免疫檢查點等，改善CAR-T細胞的靶細胞殺傷活性，延長其持久性和穩(wěn)定性，促進免疫細胞歸巢，從而提高對腫瘤的清除功效。盡管存在挑戰(zhàn)，與放射療法、化學療法、靶向療法或其他免疫療法的聯(lián)合療法新策略仍在不斷發(fā)展[43,46-47,51,54]，并可能為未來更有效和更安全的治療提供方向。