乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法研究進(jìn)展

劉利娟

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鶴壁 458030）

乳制品日漸成為成人和兒童的主要蛋白質(zhì)來源，而牛乳的組成比較復(fù)雜，其中含有3%～4%的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)能在機(jī)體內(nèi)氧化產(chǎn)生能量，是人體必需的能源物質(zhì)。乳蛋白中有較高的必需氨基酸利用率，是因?yàn)槿榈鞍字泻卸喾N人體所必需的氨基酸，且分子量較小，較易吸收[1]，所以牛乳中的蛋白是人類比較理想的優(yōu)質(zhì)蛋白。對(duì)于不同的樣品，怎樣選擇合適的前處理方法，怎樣達(dá)到最優(yōu)的檢測(cè)結(jié)果，已日益成為科學(xué)研究者們最關(guān)注的焦點(diǎn)。本文綜述了乳及乳制品中蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，尤其是方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)以及研究的現(xiàn)狀等，以便于選擇合適的乳及乳制品中蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法。

1 凱氏定氮法

凱氏定氮法是1883 年凱氏發(fā)明的一種用于氮的測(cè)定的方法，這已成為分析化學(xué)中一個(gè)經(jīng)典的測(cè)量方法并且被廣泛使用。這種方法分兩個(gè)階段，最開始是經(jīng)典的凱氏定氮法，但是傳統(tǒng)的方法采用混合指示劑對(duì)顏色變化進(jìn)行判斷滴定終點(diǎn)，誤差較大。為確保滴定結(jié)果的準(zhǔn)確性，多采用電位滴定法或酸度計(jì)結(jié)合的方法完成測(cè)定。但是氨在蒸餾時(shí)容易發(fā)生倒吸，堿的加入量不好控制，故研制了自動(dòng)定氮儀，它可以快速測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，也可有效防止消化、蒸餾過程中的人為誤差，在提高效率的同時(shí)提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，用酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量[1]。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)凱氏定氮法和其他方法的比較研究甚多。如霍麗娜進(jìn)行了杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測(cè)定奶粉和糧食中氮及蛋白質(zhì)含量的研究分析，結(jié)果表明凱氏定氮法同杜馬斯燃燒法相比較，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差更大，穩(wěn)定性較差，但杜馬斯燃燒法的測(cè)定結(jié)果略高于凱氏定氮法，因凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是通過凱氏因子換算出來的，結(jié)果不包含所有的氮，所以測(cè)得的蛋白質(zhì)的含量較杜馬斯燃燒法偏低[2]。盧錦斌、張利敏[3]等人對(duì)改良凱氏定氮法進(jìn)行了研究，國內(nèi)外主要圍繞消煮、蒸餾及滴定三個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，其中消煮環(huán)節(jié)中，Bowman等[4]采用雙氧水測(cè)定法，大大地提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性。易中華、肖世平等人進(jìn)行了水楊酸鈉比色法與凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量的比較研究，結(jié)果表明比色法比較簡單易行，比較適合基層實(shí)驗(yàn)室推廣，但是比色法對(duì)環(huán)境污染比較大[5]。朱文秀等人進(jìn)行了自動(dòng)定氮儀法與國標(biāo)凱氏定氮法測(cè)定油菜籽蛋白質(zhì)含量的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自動(dòng)定氮儀較國標(biāo)大大縮短了工作時(shí)間，提高了工作效率，且此方法更易推廣[6]。

該方法的優(yōu)點(diǎn)是通用性強(qiáng)，測(cè)定費(fèi)用低，易實(shí)現(xiàn)，儀器簡單且測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，但也存在時(shí)間長、靈敏度低等缺點(diǎn)。凱氏定氮法測(cè)的是總蛋白的量，一些非蛋白氮無法檢測(cè)出，一些商販利用摻入非蛋白氮的方法牟取利益，例如三聚氰胺事件。對(duì)此2010 年6 月1 日新的國家標(biāo)準(zhǔn)開始實(shí)施，即GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，此標(biāo)準(zhǔn)代替了GB/T 5009.5-2003，更加完善了蛋白質(zhì)檢測(cè)準(zhǔn)確性的內(nèi)容。

2 分光光度法

2.1 雙縮脲法

近幾年國內(nèi)對(duì)雙縮脲法的研究與國外相比較多，如周艷星[7]對(duì)乳制品飲料中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較分析，雙縮脲的方法可以快速測(cè)定蛋白質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是靈敏度不高。李宏梁等人的雙縮脲法和凱氏定氮法測(cè)定牛乳中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較研究。

該方法適合檢測(cè)總蛋白質(zhì)的含量，它具有操作簡單、測(cè)量速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)必須使用代表性很強(qiáng)的樣品，由于要使用其他參考方法測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)總含量，這種測(cè)定工作較為費(fèi)力費(fèi)時(shí)。所以雙縮脲法不宜用來測(cè)定樣品種類多、彼此差異大的樣品的總蛋白含量。

2.2 考馬斯亮藍(lán)法

考馬斯亮藍(lán)法是由Bradford于1976年建立的，它有G-250和R-250 兩種，其原理是在酸性條件下，G-250 染料與堿性氨基酸以及芳香族氨基酸殘基結(jié)合，G-250 染料的最大吸收峰由465 nm 增加到595 nm，溶液顏色從棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，樣品中蛋白質(zhì)的濃度與該染料的吸光度（595 nm）成正比關(guān)系[6]，從而測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

周艷星[7]等人進(jìn)行了考馬斯亮藍(lán)法與雙縮脲法檢驗(yàn)乳制品中蛋白質(zhì)含量的分析比較，結(jié)果顯示考馬斯亮藍(lán)法操作更加簡單，更加快速準(zhǔn)確。馮昕等人進(jìn)行了考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定乳與乳制品中蛋白質(zhì)含量的研究，在牛血清白蛋白溶液中加入氨基酸及酚類物質(zhì)，該法精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，抗干擾能力強(qiáng)。南亞等人進(jìn)行了考馬斯亮藍(lán)G-250 法快速測(cè)定牛乳中的蛋白質(zhì)的研究。

該方法具有高精度、高效率、檢測(cè)過程簡便、抗干擾能力強(qiáng)、所需試劑少等優(yōu)點(diǎn)，但此方法由于測(cè)定誤差大，不適用于不同蛋白的檢測(cè)，可應(yīng)用于醫(yī)療保健及食品行業(yè)的蛋白質(zhì)測(cè)定。

2.3 Folin－酚試劑法

Lowry 法是雙縮脲法的發(fā)展，它結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，是最靈敏的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，該復(fù)合物在色氨酸殘基、芳香族氨基酸殘基、酪氨酸的作用下，使磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽還原，在750 nm 波長處有最大吸收。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。

國內(nèi)外近幾年采用福林酚法的文獻(xiàn)比較少，這種方法大部分被用來測(cè)低濃度的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)，如高英等人用福林酚法測(cè)定腦蛋白水解物溶液中多肽的含量；黃滿紅等人對(duì)生活污水中蛋白質(zhì)測(cè)試方法進(jìn)行了研究，由于生活污水中有腐殖質(zhì)物質(zhì)，研究還對(duì)該方法做出了改進(jìn)，設(shè)置了2 個(gè)平行，從而提高了準(zhǔn)確率。

該測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是耗費(fèi)時(shí)間長，操作時(shí)間要精準(zhǔn)的控制，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制麻煩，并且專一性較差，干擾物質(zhì)比較多。

2.4 茚三酮法

國內(nèi)外對(duì)茚三酮的研究相對(duì)較少，文獻(xiàn)中對(duì)茚三酮的研究主要是對(duì)蛋白質(zhì)水解度檢測(cè)。這種方法是比較古老的方法，國內(nèi)最新的研究是羅艷華等人進(jìn)行蛋白水解物水解度測(cè)定研究，分別對(duì)OPA 法、TNBS 法、茚三酮比色法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)茚三酮方法因吸光度波動(dòng)大，方法的重現(xiàn)性差。另外還有楊文博等人對(duì)蛋白質(zhì)水解度測(cè)定方法的研究；檀志芬等對(duì)蛋白質(zhì)水解度的研究，這種方法非常靈敏，但是顯色劑穩(wěn)定性較差。

2.5 BCA 法

銅離子在蛋白質(zhì)的作用下還原成亞銅離子，在堿性條件下亞銅離子與BCA 結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物，在562 nm 處具有最大吸收峰。在一定條件下，復(fù)合物的吸光度值與蛋白質(zhì)的濃度成正比例關(guān)系。BCA 是一種極敏感的蛋白呈色劑，BCA 法的測(cè)定范圍較寬，測(cè)定蛋白質(zhì)簡單、靈敏且快捷。這種方法在醫(yī)學(xué)上的研究也很廣泛，如王麗等人利用BCA 法對(duì)百日咳疫苗中間品蛋白含量進(jìn)行了有效性檢驗(yàn)分析，此方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)；曹玉華等人測(cè)神奇靈藥顆粒中的蛋白含量；周志軍等人用此法檢測(cè)人凝血因子中蛋白質(zhì)的含量，該方法步驟簡單，比經(jīng)典的Lowry 法快4 倍，且操作更加方便，檢測(cè)下限能夠降至25 μg/mL，最低檢測(cè)量為0.5 μg。

3 電泳法

3.1 SDS-PAGE 凝膠電泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠較好地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，它根據(jù)濃縮膠和分離膠是否相連分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。由于在不連續(xù)系統(tǒng)中蛋白在進(jìn)入分離膠之前可以等速濃縮，所以通常使用的是不連續(xù)系統(tǒng)。在以前的研究中用這種方法測(cè)的小肽等小分子比較多，而近幾年的研究中多用此方法來測(cè)定β-乳球蛋白和乳清蛋白的含量等，如韓奕奕等人用凝膠電泳法（SDS-PAGE）測(cè)定對(duì)β-乳球蛋白的測(cè)定；金江玉等人將此方法廣泛應(yīng)用于液態(tài)乳中水解蛋白的摻假實(shí)驗(yàn)等。

為了提高檢測(cè)的靈敏性，秦慧等人又對(duì)電泳做出了改進(jìn)，進(jìn)行了雙向電研究，改良了考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法，改良后蛋白質(zhì)靈敏性高，質(zhì)譜兼容性好。

3.2 高效毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（CE）作為一種最新的色譜分離技術(shù)，主要有毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細(xì)管等速電泳（CIE）、毛細(xì)管等電聚焦（CIF）、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）及無膠篩分毛細(xì)管電泳（NGSCE）等多種模式。毛細(xì)管電泳具有選擇性和解析能力強(qiáng)、靈敏度高、樣品和溶劑消耗少、易于量化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析領(lǐng)域。

近幾年來對(duì)此法的研究多集中在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域，主要用于對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子的研究，如趙新穎等人在乳品蛋白檢測(cè)中有所應(yīng)用；李曉斌用于化妝品及食品分析研究；張慧潔等人使用毛細(xì)管電泳儀測(cè)定膠原蛋白的分子質(zhì)量分布；王有等人用毛細(xì)管電泳法代替凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行分離檢測(cè)。

毛細(xì)管電泳具有分離度極高、分離速率高、消耗樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，但是因注射量小、波長有限等原因?qū)е聶z測(cè)濃度非常受限。

4 色譜法

4.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）具有簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，所以近年來越來越多的企業(yè)更傾向使用此法對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。它同氣相質(zhì)譜而言，能夠分離高沸點(diǎn)、受熱不穩(wěn)定的的混合物，所以應(yīng)用范圍更加廣泛。其缺點(diǎn)在于對(duì)分子結(jié)構(gòu)特性相似的蛋白難以達(dá)到完全分離，流動(dòng)相試劑大多為有機(jī)試劑，對(duì)人體和環(huán)境都會(huì)造成不同程度的危害，且檢測(cè)成本較高。

近幾年使用該法對(duì)牛奶中的摻偽檢驗(yàn)的研究比較多。如魏秀蓮等人用液相色譜法快速檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法研究；黃艷紅等人用此方法測(cè)定乳品中的三聚氰胺。同時(shí)，該方法還可應(yīng)用于飼料、醫(yī)學(xué)等方面的研究，例如魏姜勉建立了高效飼料氨基酸檢測(cè)方法，方法適用于大豆、豆粕、魚粉和混合飼料的檢驗(yàn)中；張連龍采用高效液相色譜雙柱法測(cè)定了低聚異麥芽糖含量。

4.2 HPLC 聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜聯(lián)用的技術(shù)應(yīng)用廣泛，主要有高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）、高效液相色譜-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（HPLC-ICP-AES）、高效液相色譜-毛細(xì)管電泳（HPLC-CE）、高效液相色譜-等速電泳（HPLC-ITP）等。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠有效分離和鑒定難揮發(fā)、高沸點(diǎn)和熱不穩(wěn)定化合物，廣泛地應(yīng)用于食品、環(huán)保、生化、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

國內(nèi)外對(duì)此法均有研究，如甘賓賓等人將該技術(shù)運(yùn)用在食品安全中；蔡勤仁等人用此法對(duì)飼料中的三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定；國外的Monfort Ana?lle 等人采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）同時(shí)定量母乳中19 種分析物。

5 結(jié)束語

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)乳及乳制品中蛋白質(zhì)的方法也在不斷地改進(jìn)，方法之間的檢出限、檢測(cè)精度、適用范圍不同，不同的方法均有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。雖然新建立的許多方法操作簡單、檢測(cè)快速、靈敏度和重現(xiàn)性良好，但存在檢測(cè)費(fèi)用高、不能夠大批量檢測(cè)等缺點(diǎn)。因此，對(duì)于乳及乳制品的檢驗(yàn)，建立可操作性強(qiáng)、適用范圍廣、檢測(cè)成本低的最快速、最微量的檢驗(yàn)方法將是未來研究的重點(diǎn)方向。