張亞楠，張亞慧，楊佳欣，高志祥，王占黎*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院外語(yǔ)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古包頭 014040）

布魯氏菌?。ê?jiǎn)稱(chēng)布?。且环N人、畜共患性全身傳染性疾病，其病原菌是布魯氏桿菌。布魯氏桿菌的毒力或致病力很強(qiáng)，人類(lèi)接觸患病動(dòng)物后，細(xì)菌可通過(guò)口、皮膚黏膜和呼吸道進(jìn)入人體，產(chǎn)生的內(nèi)毒素是主要的致病因子，可引起菌血癥和毒血癥[1]。布魯氏桿菌進(jìn)入人體后可侵襲到各個(gè)器官，包括脊柱、髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)等部位。臨床癥狀主要表現(xiàn)為波狀熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛。布魯氏桿菌生存能力頑強(qiáng)，在干燥、低溫的環(huán)境中均能存活，并且具有很強(qiáng)的抗滅活能力。因此，采取科學(xué)、合理檢驗(yàn)方法有效防控布病，做到早發(fā)現(xiàn)早治療尤為重要。本研究旨在探討膠體金試紙條法、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和IgG/IgM酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)IgG/IgM法（ELISA IgG/IgM法）檢測(cè)布魯氏桿菌IgG抗體在布魯氏菌病診斷中應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年12月19日就診于內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心門(mén)診的58例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：因發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、腰痛、咳嗽而就診，具有流行病學(xué)接觸史（與牛羊有所接觸），疑似布病。神志清醒。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并血液系統(tǒng)疾病及其他傳染病。根據(jù)中國(guó)布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)，SAT最低抗體滴度為1∶100，WHO和美國(guó)CDC將抗體滴度定為1∶160，結(jié)合我國(guó)具體國(guó)情和WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，實(shí)驗(yàn)室初篩中加入了膠體金試紙條、ELISA IgG/IgM法等試驗(yàn)。

1.2 檢驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金試紙條法 取10 μL血清于膠體金試紙條加樣孔中，滴加3滴稀釋液，20 min后觀察結(jié)果，如果檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)均出現(xiàn)條帶，即為陽(yáng)性；如果質(zhì)控線(xiàn)出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線(xiàn)沒(méi)有出現(xiàn)條帶，即為陰性；如果質(zhì)控線(xiàn)沒(méi)有出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線(xiàn)出現(xiàn)條帶或檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)均沒(méi)有出現(xiàn)條帶，即為無(wú)效樣本。

1.2.2 RBPT 于檢查當(dāng)天清晨采集就診患者空腹靜脈血液5 mL，置于含分離膠的金黃色頭蓋真空采血管內(nèi)，待血液凝固，3 000 r/min離心20 min，取血清備用。具體操作：用蠟筆在載玻片上劃分方格，取30 μL血清樣本于方格內(nèi)，滴加等量布魯氏桿菌病虎紅平板抗原，用牙簽混勻，室溫靜置持續(xù)觀察結(jié)果5 min，如果血清出現(xiàn)凝集反應(yīng)（渾濁、顆粒狀或塊狀物質(zhì)），即為陽(yáng)性。

1.2.3 SAT 取5支試管備用。第1支試管加2.3 mL濃度的0.5%石碳酸生理鹽水，第2支試管為空白對(duì)照管，不加生理鹽水；第3、4、5支試管加0.5 mL 0.5%石碳酸生理鹽水。向第1支試管中加0.2 mL血清樣本，混勻后分別取0.5 mL血清稀釋液于第2、3支試管中；將第3支試管中的混合液混勻后取0.5 mL加到第4支試管中，混勻后再?gòu)牡?支試管中取0.5 mL混合液加到第5支試管中；最后從第5支試管中取0.5 mL混合液棄去。用0.5%石碳酸生理鹽水稀釋抗原，稀釋比例1∶10，再分別將0.5 mL稀釋后的抗原加到第2～5支中（稀釋比例分別為1∶25，1∶50，1∶100，1∶200）。將5支試管充分震蕩后，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中20～22 h。取出試管后室溫下冷卻，觀察試管的沉淀及清亮程度，并與比濁管比對(duì)?！?”無(wú)凝集，為均勻粉紅色；“++”出現(xiàn)明顯卷邊，凝集塊間液體稍清亮；“+++”凝集反應(yīng)較強(qiáng)；“++++”凝集塊呈菌叢狀，凝集塊間液體清亮明顯。比濁管的配置，見(jiàn)表1。

表1 比濁管的配置

1.2.4 ELISA IgG/IgM法 加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品和已稀釋樣本于相應(yīng)反應(yīng)孔中，封板后室溫溫育60 min。移去封板紙，棄去孔中液體，用300 μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干，在每1微孔中加入100 μL酶聯(lián)物。封板后室溫溫育30 min。移去封板紙，棄去孔中液體，再次用300 μL洗滌液洗板3次。每孔加TMB底物液100 μL，室溫避光溫育20 min。之后在每一微孔中加入100 μLTMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕搖動(dòng)微孔板以使試劑混合均勻。加終止液后60 min內(nèi)在450 nm處測(cè)OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成數(shù)據(jù)分析。一致性采用Kappa檢驗(yàn)（Kappa＞0.75表明一致性極好，Kappa在0.4～0.75內(nèi)表明一致性較為理想，Kappa＜0.4表明一致性差）；受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)計(jì)算每種方法的敏感度、特異度。

2 結(jié)果

2.1 4種方法檢測(cè)58例患者血清結(jié)果 膠體金試劑條、RBPT、SAT、ELISA IgG/IgM法檢測(cè)58例患者血清，結(jié)果顯示，膠體金試紙條法檢測(cè)布魯氏桿菌IgG抗體呈陽(yáng)性12例（20.69%），RBPT檢測(cè)出16例陽(yáng)性（27.59%），SAT檢測(cè)出11例陽(yáng)性（18.97%），ELISA IgG/IgM法檢測(cè)布魯氏桿菌呈陽(yáng)性12例（20.69%），見(jiàn)表2。

表2 4種方法檢測(cè)58例患者血清結(jié)果

2.2 4種方法診斷結(jié)果及效能分析 以4種方法檢查結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行診斷效能的計(jì)算，結(jié)果顯示：RBPT檢測(cè)出敏感度100.00%、特異度89.36%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值68.75%、陰性預(yù)測(cè)值100%；膠體金試紙條法檢測(cè)出敏感度81.82%、特異度93.62%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值75.00%、陰性預(yù)測(cè)值95.65%；ELISA IgG/IgM法檢測(cè)出敏感度100.00%、特異度97.87%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值91.67%、陰性預(yù)測(cè)值100.00%，見(jiàn)表3、表4。

表3 4種方法檢查結(jié)果

表4 4種方法診斷效能（%）

2.3 ROC曲線(xiàn) 膠體金試紙條ROC曲線(xiàn)下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.737，1.000]，RBPT試驗(yàn)ROC曲線(xiàn)下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.891，1.000]，ELISA IgG/IgM法試驗(yàn)ROC曲線(xiàn)下漸進(jìn)95%置信區(qū)間為[0.965，1.000]，見(jiàn)圖1。

圖1 ROC曲線(xiàn)

2.4 4種方法可靠性及項(xiàng)間相關(guān)性分析 4種方法一致性分析采用Fleiss Kappa，且Fleiss Kappa值為0.934。各項(xiàng)之間相關(guān)性分析結(jié)果顯示，膠體金試紙條法與SAT之間的相關(guān)性為0.730，RBT與SAT之間的相關(guān)性為0.784，ELISA IgG/IgM法與SAT之間的相關(guān)性為0.947，見(jiàn)表5。

表5 4種方法可靠性及項(xiàng)間相關(guān)性分析

3 討論

布魯氏菌病是國(guó)家二類(lèi)動(dòng)物疫病，也是人畜共患疾病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)健康的危害特別大[2]。每年的第1季度末、第2季度初期和第3季度是布魯氏菌傳播的高峰期，應(yīng)嚴(yán)格對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢疫工作、疫苗接種，定期抽檢調(diào)查動(dòng)物及養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的環(huán)境質(zhì)量[3]。檢疫工作一般選擇細(xì)菌學(xué)診斷、全乳環(huán)狀實(shí)驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)[4]。檢疫工作時(shí)如若發(fā)現(xiàn)可疑目標(biāo)，立即采取隔離觀察或無(wú)害化處理，及時(shí)有效阻斷布魯氏桿菌的傳播。因此，采用科學(xué)有效的實(shí)驗(yàn)室檢查方法檢測(cè)布魯氏桿菌十分必要。

本文采用膠體金試紙條、RBPT、ELISA IgG/IgM法和SAT檢測(cè)布魯氏桿菌，結(jié)果表明：膠體金試紙條快速檢測(cè)試驗(yàn)和RBPT為定性試驗(yàn)，準(zhǔn)確度略低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，但是檢測(cè)速度快，可做大批量篩查；SAT和ELISA（IgG/IgM）法為定量試驗(yàn)，準(zhǔn)確度高，但是SAT檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，ELISA IgG/IgM法價(jià)格比較貴。4種方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，分析原因如下：膠體金試紙條法假陽(yáng)性常見(jiàn)原因主要包括布魯氏桿菌抗原間交叉反應(yīng)、血清中的內(nèi)、外源性物質(zhì)干擾等。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)源性干擾物質(zhì)包括類(lèi)風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、人抗動(dòng)物抗體等，容易造成膠體金假陽(yáng)性[5]。外源性干擾物質(zhì)包括標(biāo)本凝固不全便開(kāi)始離心，血清中殘留的纖維蛋白原黏附在硝酸纖維素膜上造成假陽(yáng)性；此外試劑本身質(zhì)量問(wèn)題、溶血、乳糜血等原因均可對(duì)膠體金檢測(cè)結(jié)果造成干擾[6]。膠體金雙抗原夾心法、免疫層析法則容易產(chǎn)生假陰性。

RBPT主要檢測(cè)項(xiàng)目是IgG抗體，具有較高的敏感度，且有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、出結(jié)果快的優(yōu)點(diǎn)，可用于大規(guī)模普查[7]。但是該方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，會(huì)造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失，并且加大工作人員的工作量[8]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，布魯氏桿菌細(xì)胞壁脂多糖上的O-鏈抗原作為RBPT檢測(cè)的診斷靶點(diǎn)，與大腸桿菌O157、沙門(mén)氏桿菌等O-鏈抗原具有高度相似性，容易發(fā)生交叉凝集反應(yīng)導(dǎo)致假陽(yáng)性[9]。抗原質(zhì)量是影響RBPT結(jié)果的關(guān)鍵因素。此外，反應(yīng)溫度、時(shí)間、抗凝劑、纖維蛋白原和藥物易對(duì)RBPT產(chǎn)生假陽(yáng)性。根據(jù)布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 269-2007）[10]要求反應(yīng)在30 ℃、5 min后判斷結(jié)果。有研究證明，虎紅平板表面溫度會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。商品化的紙質(zhì)反應(yīng)板難以控制溫度，可通過(guò)加熱玻璃反應(yīng)板消除溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的影響[11]。每次試驗(yàn)時(shí)須設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照，在規(guī)定的時(shí)間范圍內(nèi)完成檢測(cè)。血清樣本放置的時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越低，假陽(yáng)性率越高?？鼓难獫{中含有纖維蛋白原，帶有正電荷的纖維蛋白原與帶有負(fù)電荷的虎紅發(fā)生靜電結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)的超分子反應(yīng)[12]。相比之下，SAT不受樣本類(lèi)型的影響，血清和血漿樣本的檢測(cè)結(jié)果一致。因此，RBPT試驗(yàn)采血時(shí)必須使用促凝管，要求血清樣本新鮮透亮、無(wú)細(xì)菌污染和溶血，在規(guī)定溫度和時(shí)間下進(jìn)行檢測(cè)。

ELISA相對(duì)RBPT和膠體金試紙條法敏感度和特異度更高，可避免人工操作帶來(lái)的誤差。該方法通過(guò)檢測(cè)血清中的IgG、IgM，可有效鑒別急性、慢性布魯氏菌病。但是，布魯氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌0∶9的脂多糖在ELISA試驗(yàn)上可發(fā)生抗原交叉反應(yīng)，常規(guī)上使用ELISA抑制試驗(yàn)測(cè)定布魯氏菌屬和耶爾森氏菌屬抗體的特異度，并且該方法成本高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢查[13]。

SAT作為國(guó)際上推薦使用的檢測(cè)方法，被當(dāng)作布魯氏菌病的確證試驗(yàn)。該方法不易受到非特異度抗體的干擾，假陰性檢出率低，具有較高的敏感度和特異度，適用于布魯氏桿菌臨床診斷[14]。但是，SAT主要檢測(cè)IgM類(lèi)抗體，其維持時(shí)間較IgG抗體短，所以SAT陽(yáng)性檢出率低于RBPT。此外，SAT易受到人為因素的干擾，操作時(shí)間長(zhǎng)，耗時(shí)24 h以上，檢測(cè)時(shí)需用大量血清和布魯氏桿菌凝集抗原。

綜上所述，在臨床實(shí)際血清學(xué)檢查的工作中，RBPT敏感度高，ELISA敏感度高且特異度強(qiáng)。四種試驗(yàn)方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可結(jié)合使用快速診斷布魯氏菌病。另外，應(yīng)該配合臨床其他檢查手段，比如超聲、CT等綜合判斷布魯氏菌病。最后，在治療的過(guò)程中，應(yīng)該科學(xué)治療，對(duì)癥下藥，醫(yī)患雙方積極配合，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。