嬰幼兒配方食品中致病微生物的污染狀況及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

◎ 劉曉暉，何 偉，鳳淳雅，付婧超，任明月，何 苗

（1.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長(zhǎng)春 130103；2.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

食源性致病微生物主要通過(guò)污染食物導(dǎo)致人類(lèi)中毒或死亡，其引起的食源性疾病已經(jīng)成為世界性的公共衛(wèi)生難題[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)于2018—2021年發(fā)生過(guò)多起由蠟樣芽孢桿菌污染食物造成的食物中毒事件[3-7]。嬰幼兒配方食品是免疫力低下、未發(fā)育完全的嬰幼兒等特殊人群獲得能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，對(duì)于6月齡以下人工喂養(yǎng)的嬰兒，更是其唯一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[8]。因此，對(duì)嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與分析意義重大。

微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（Microbiological Risk Assessment，MRA）是當(dāng)前國(guó)際食品安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種工具，是人類(lèi)感染微生物后，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生的不良后果進(jìn)行識(shí)別，以微生物的定量關(guān)系來(lái)判斷或估計(jì)人類(lèi)發(fā)生中毒的概率[9]。微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是微生物風(fēng)險(xiǎn)分析體系的基礎(chǔ)，其主要分析過(guò)程分為危害識(shí)別、危害特征描述、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)特征描述等4 個(gè)部分[10]。

本文圍繞嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況進(jìn)行簡(jiǎn)單分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并對(duì)蠟樣芽孢桿菌現(xiàn)行評(píng)估的難點(diǎn)、復(fù)雜性及其前景作簡(jiǎn)單論述，為制定更為合理的食品安全監(jiān)管和評(píng)價(jià)機(jī)制提供決策依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

按照《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》（2022年）要求，結(jié)合本市實(shí)際情況，隨機(jī)抽取百貨商場(chǎng)、便利店/零售店、超市和網(wǎng)店等場(chǎng)所嬰幼兒食品203 份，其中嬰兒配方食品87 份、較大嬰兒和幼兒配方食品54 份、嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品62 份。采樣包裝完整，在保質(zhì)期內(nèi)且避免污染。

1.2 設(shè)備、培養(yǎng)基與試劑

LightCycler480 II 型熒光定量PCR 儀（羅氏）；Q7全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)杜邦）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒）；HITACHI 離心機(jī)（日本）；ML105型電子天平（Mettler Toledo）；嘔吐型基因PCR 試劑（20211004）、腹瀉型基因PCR 試劑（2021080），購(gòu)自北京卓誠(chéng)惠生；胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒和PCR 引物，由上海生工提供。

1.3 檢驗(yàn)與判定方法

按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14—2014）[11]方法進(jìn)行檢驗(yàn)，依據(jù)試劑盒方法開(kāi)展熒光PCR 定量和嘔吐型基因檢測(cè)，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)控樣品為陽(yáng)性對(duì)照。參考“Standard 1.6.1-Microbiological Limits for Food”嬰兒配方食品蠟樣芽孢桿菌限量標(biāo)準(zhǔn)（n=5，c=0，m≤100 CFU·g-1）進(jìn)行判定[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》（2022年），本次實(shí)驗(yàn)共完成檢品203 批次，檢出蠟樣芽孢桿菌23 株。其中，檢出嘔吐型基因3 例。和其他兩類(lèi)比較，嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品感染嘔吐型蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同類(lèi)型嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)情況見(jiàn)表1。

表1 不同類(lèi)型嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)情況表

2.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.2.1 危害識(shí)別

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為兼性厭氧、能夠產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀食源性致病菌[13]，其廣泛分布于土壤與食物中，能產(chǎn)生腸毒素，對(duì)人體危害極大。根據(jù)其基因型和產(chǎn)生腸毒素機(jī)制的不同，分為腹瀉型毒素和嘔吐型毒素，二者的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉和嘔吐等癥狀。

蠟樣芽孢桿菌引起的腹瀉主要是由于人攝入污染食物后，在小腸中產(chǎn)生腸毒素而引發(fā)的感染。腸毒素種類(lèi)繁多，而與胃腸道食物中毒有關(guān)的腸毒素只有腸毒素Nhe、溶血素BL 和細(xì)胞毒素K[14]。據(jù)報(bào)道[15-18]，三者主要通過(guò)作用小腸上皮細(xì)胞，在穿孔毒素作用下使小腸上皮細(xì)胞形成孔洞，導(dǎo)致Na+和Ca2+流失，細(xì)胞電位失衡而凋亡或死亡。其臨床表現(xiàn)主要為攝入污染食物8～16 h 后出現(xiàn)腹痛、腹瀉和偶爾惡心，癥狀持續(xù)12～24 h。

嘔吐型毒素是一種非核糖體產(chǎn)生的離子型環(huán)狀十二肽，產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌的質(zhì)粒與炭疽桿菌毒力質(zhì)粒pXO1 具有較高的序列相似性[19]，因此被單獨(dú)分為一個(gè)亞群，歸入新種副炭疽芽孢桿菌（Bacillus paranthracis）[20]。其產(chǎn)生的嘔吐毒素具有耐酸、耐熱的特性，不受胃蛋白酶的影響[21]。推測(cè)嘔吐毒素進(jìn)入人體后經(jīng)胃進(jìn)入十二指腸與5-HT3受體結(jié)合，刺激迷走神經(jīng)導(dǎo)致嘔吐癥狀。嘔吐毒素能將K+導(dǎo)入線(xiàn)粒體內(nèi)，通過(guò)抑制脂肪酸的氧化破壞線(xiàn)粒體的活性[22]。淀粉能促進(jìn)嘔吐毒素的產(chǎn)生，因此嘔吐毒素食物中毒事件多與進(jìn)食米面等淀粉含量高的食物有關(guān)[23]。一般誤食被污染的食品0.5 h 后就會(huì)有頭暈嘔吐，伴有腹瀉、發(fā)燒和四肢無(wú)力等現(xiàn)象。

2.2.2 危害特征描述

蠟樣芽孢桿菌分為有毒菌株與無(wú)毒菌株，有毒菌株可引起動(dòng)物和人的食物中毒，偶見(jiàn)由該菌引起的眼部感染、皮下膿腫、肝衰竭等疾病[24]。攝入蠟樣芽孢桿菌有毒菌株污染的食物后主要引起嘔吐和腹瀉等急性腸胃炎癥狀，因此其劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)的終點(diǎn)是以疾病的發(fā)病來(lái)界定的。國(guó)際公認(rèn)的蠟樣芽孢桿菌腸毒素閾值為0.1～1.0 μg，即攝入這個(gè)濃度范圍的腸毒素可產(chǎn)生中毒癥狀。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的研究得出腸毒素含量只要高于1.0 μg 即可造成蠟樣芽孢桿菌食物中毒[25]，而食物中蠟樣芽孢桿菌超過(guò)102CFU·g-1時(shí)即可產(chǎn)生足夠致病的腸毒素，引發(fā)中毒癥狀[26]。因此，本次評(píng)估以102CFU·g-1作為蠟樣芽孢桿菌食物中毒的閾值標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 暴露評(píng)估

（1）樣品初始污染情況。通過(guò)對(duì)不同采樣地點(diǎn)、不同亞類(lèi)的203 批次嬰幼兒配方食品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果空白對(duì)照未見(jiàn)蠟樣芽胞桿菌菌株，樣品中共檢出蠟樣芽孢桿菌23 株，以數(shù)值>100 CFU·g-1為陽(yáng)性，比率占總體樣本的11.33%；檢出嘔吐性基因3 份，陽(yáng)性檢出的構(gòu)成比為10.83%。其中，嬰幼兒谷類(lèi)輔助食品的檢出率和構(gòu)成比較大，疑似其淀粉成分的比例和蠟樣芽孢桿菌的依賴(lài)性相關(guān)。

（2）暴露人群與消費(fèi)量。蠟樣芽孢桿菌對(duì)人群的影響主要是通過(guò)攝入被蠟樣芽孢桿菌有毒菌株污染的食物。本暴露評(píng)估主要是針對(duì)免疫力低下、未發(fā)育完全的嬰幼兒等一類(lèi)食用嬰幼兒配方食品的特殊人群。結(jié)合《社區(qū)居民膳食營(yíng)養(yǎng)與健康狀況的調(diào)查分析》[27]和嬰幼兒對(duì)1～3 段配方食品的平均日常攝入情況（80～300 g·d-1），暫定嬰幼兒對(duì)配方食品的日均攝入量為200 g·d-1。

（3）風(fēng)險(xiǎn)暴露評(píng)估。采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估理論，通過(guò)計(jì)算膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商（Risk Quotient，RQ），評(píng)估嬰幼兒配方食品中暴露蠟樣芽孢桿菌的風(fēng)險(xiǎn)大小，RQ的值越小風(fēng)險(xiǎn)越低。當(dāng)RQ≥100%時(shí)表示有較大的風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)RQ≤100%時(shí)表示風(fēng)險(xiǎn)在可接受范圍內(nèi)。膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商計(jì)算為

式中：RQ為暴露風(fēng)險(xiǎn)商，%；EDI為嬰幼兒食品的日均攝入量（Estimated Daily Intake），CFU·g-1·d-1；ADI為每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake），CFU·g-1·d-1，以102CFU·g-1為參考；C為嬰幼兒食品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量，CFU·g-1；P為嬰幼兒食品日均攝入量，kg·d-1；bw為體重，kg。

嬰幼兒體重按20 kg 計(jì)算，則EDI=100 CFU·g-1·0.2 kg·20 kg-1·d-1=400 CFU·g-1·d-1；ADI=102CFU·g-1·20 kg·kg-1·d-1=2 000 CFU·g-1·d-1。RQ=EDI/ADI×100%=20%。

2.2.4 風(fēng)險(xiǎn)特征描述

把風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的輸出數(shù)據(jù)與劑量-反應(yīng)關(guān)系模型結(jié)合起來(lái)，可以導(dǎo)出嬰幼兒配方食品中暴露蠟樣芽孢桿菌的風(fēng)險(xiǎn)大小。本研究嘗試運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的理論，對(duì)本市市售嬰幼兒配方食品進(jìn)行暴露評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)23批次樣本中有蠟樣芽孢桿菌的檢出，暴露風(fēng)險(xiǎn)商數(shù)值較?。≧Q＜100%），同時(shí)發(fā)現(xiàn)嘔吐性毒素菌株3 例，說(shuō)明本市嬰幼兒配方食品中暴露蠟樣芽孢桿菌的危險(xiǎn)性雖尚在可控范圍內(nèi)，但也應(yīng)引起足夠重視。

3 討論

蠟樣芽孢桿菌屬芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，可在8～55 ℃條件下存活，但在pH ≤2 或含水量≤0.95%時(shí)無(wú)法生存[28]。然而一旦侵入宿主后，若不能快速準(zhǔn)確診斷治療，其分泌的毒素上升后將會(huì)對(duì)宿主造成很大的危害。盡管有時(shí)定量檢測(cè)的結(jié)果未能達(dá)到引起食物中毒的閾值，但不能排除蠟樣芽孢桿菌在適宜條件下大量繁殖和引起腹瀉及嘔吐的可能，因此不能忽視其在嬰幼兒配方食品中的潛在污染。

由于蠟樣芽孢桿菌族不同物種之間普遍存在質(zhì)粒水平或垂直轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致它們的表型、致病性和宿主特異性方面有明顯的差異，目前尚需借助全基因組單核苷酸多態(tài)性分析（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）和多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）等基因分析手段對(duì)其不同菌種加以區(qū)分和鑒別[27]。本研究采用PCR 法結(jié)合試劑盒分離出3 份嘔吐性基因，提示蠟樣芽孢桿菌在市售的嬰幼兒配方食品中尚有潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加強(qiáng)此方面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和分析工作。

我國(guó)對(duì)食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作起步較晚，體系機(jī)制還不夠完善，工作缺乏制度化、法制化和系統(tǒng)化的保障，而微生物本身的特點(diǎn)又決定了微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的復(fù)雜性，必須考慮不確定性和變異性。不確定性的種類(lèi)包括模型不確定性、生長(zhǎng)過(guò)程不確定性和參數(shù)不確定性等。進(jìn)行定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的核心部分就是劑量-反應(yīng)分析，但相關(guān)劑量-反應(yīng)模型的缺乏亦影響了嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌評(píng)估的確定。而基因型、菌株類(lèi)型和環(huán)境條件的改變等方面也是產(chǎn)生變異性的至關(guān)要素。因此，對(duì)蠟樣芽孢桿菌中毒風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估普遍是基于模型預(yù)測(cè)的菌體水平相關(guān)聯(lián)的腸毒素水平，而不是實(shí)際食品中預(yù)測(cè)的腸毒素水平，即劑量-反應(yīng)關(guān)系。不同類(lèi)型的腸毒素和它們的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及是否存在一定的相互作用關(guān)系尚不明確。可見(jiàn)，各種不確定性和變異性都給微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作帶來(lái)了具大挑戰(zhàn)。

為盡快提高嬰幼兒配方食品中蠟樣芽孢桿菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的科學(xué)性、有效性，宜做好以下幾點(diǎn)工作。①建立相關(guān)的云數(shù)據(jù)庫(kù)或平臺(tái)，加強(qiáng)微生物學(xué)、流行病學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)學(xué)等多學(xué)科的融匯與交合，建立完善的蠟樣芽孢桿菌的劑量-反應(yīng)關(guān)系。②加強(qiáng)蠟樣芽孢桿菌交互模型的研究，模擬真實(shí)的微生物生長(zhǎng)和變化，降低分析結(jié)果的不確定性和變異性。③借鑒先進(jìn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估理念和手段，利用數(shù)學(xué)模型、量子計(jì)算機(jī)等先進(jìn)手段，構(gòu)建符合我國(guó)國(guó)情的致病微生物危害性評(píng)估新技術(shù)、新方法。