孫瓊飛，屈勇剛*，李彥芳*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.動物疾病防控兵團(tuán)重點實驗室，新疆石河子 832003)

奶牛在分娩后子宮腔容易受到細(xì)菌污染，病原菌經(jīng)常持續(xù)存在，致使子宮疾病發(fā)生，這是導(dǎo)致母牛不孕的一個關(guān)鍵原因[1]。奶牛子宮炎是一種奶牛產(chǎn)后危害較大的子宮疾病，該病會破壞奶牛的繁殖性能并降低奶牛群的生產(chǎn)力和盈利能力。據(jù)統(tǒng)計，單以歐盟而言，每年僅因奶牛子宮炎造成的損失就高達(dá)1400萬歐元，我國每年因該病損失數(shù)億元[2]。因此，對該病的診斷和防治具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[3]。

目前對子宮炎的分類沒有金標(biāo)準(zhǔn)[4]。根據(jù)研究報道，診斷方法可分為現(xiàn)場診斷技術(shù)和實驗室診斷技術(shù)兩大類，主要包括臨床診斷、超聲診斷、Metricheck裝置評估、AHMS、細(xì)胞學(xué)診斷、生物標(biāo)志物、免疫細(xì)胞、病原學(xué)診斷等方法。如何做好該病的診斷，已成為國內(nèi)外研究的熱點之一。本文對該病的分類、不同類型的定義、診斷技術(shù)等方面進(jìn)行概述，旨在能為該病快速診斷和早期防治提供參考。

1 奶牛子宮炎的分類

奶牛子宮炎指產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎或子宮內(nèi)膜及深層組織的感染，可影響奶牛繁殖功能，可出現(xiàn)或不出現(xiàn)全身癥狀[5]。以奶牛產(chǎn)后21 d為界限，將奶牛子宮炎分為子宮炎和子宮內(nèi)膜炎，產(chǎn)后21 d內(nèi)的子宮感染為子宮炎，產(chǎn)后21 d后則為子宮內(nèi)膜炎。子宮炎又可分為產(chǎn)褥期子宮炎和臨床型子宮炎，而子宮內(nèi)膜炎又可分為臨床型子宮內(nèi)膜炎(clinical endometritis，CE)、亞臨床型子宮內(nèi)膜炎(subclinical endometritis，SE)[6-8]

1.1 產(chǎn)褥期子宮炎

產(chǎn)褥期子宮炎主要發(fā)生于產(chǎn)后早期，一般于產(chǎn)后10 d內(nèi)開始發(fā)病。發(fā)病前期，子宮內(nèi)部存在大量的紅褐色、有惡臭氣味的分泌物或者有白色或者黃色蛋白樣的子宮分泌物排出；后期子宮壁水腫變厚，整個子宮壁可能會出現(xiàn)一種急性炎癥滲出物，膿性分泌物的排出相比前期有所減弱。同時還可能伴隨其他的癥狀，例如體溫上升至39℃以上，奶牛的采食量明顯下降，產(chǎn)奶量直線下降，精神沉郁、衰竭等[9]。

1.2 臨床型子宮炎

在某些嚴(yán)重的細(xì)菌感染病例中，即使每天監(jiān)測直腸溫度，并未檢測到奶牛發(fā)熱，亦無全身癥狀，但在分娩后21 d內(nèi)，子宮異常增大且陰道內(nèi)可檢測到膿性子宮分泌物的奶?？蓺w類為臨床型子宮炎[5-7]。

1.3 臨床型子宮內(nèi)膜炎

Gobikrushanth M等[10]以產(chǎn)后21 d或者更長時間，臨床診斷通常通過陰門外部觀察，或者采用陰道鏡檢查法，來觀察奶牛子宮大小、形狀、子宮內(nèi)分泌物、以及子宮內(nèi)膜的厚度等指標(biāo)是否異常來判定。臨床型子宮內(nèi)膜炎(CE)伴隨著病原微生物的感染，奶牛的臨床癥狀有不同的表現(xiàn)，一般根據(jù)陰道分泌物情況被分為4個等級：0級為黏液清亮或半透明；1級為黏液中有白色或灰色濃斑；2級為分泌物中白色或灰色黏膿性物質(zhì)≤50%；3級為分泌物中白色或黃色膿性物>50%，有時呈血紅色[11]。與SE相比，CE對子宮內(nèi)膜組織損傷更大，更易造成不可逆的后果，或演變?yōu)镾E，長期危害奶牛生殖系統(tǒng)。

1.4 亞臨床子宮內(nèi)膜炎

患亞臨床子宮內(nèi)膜(SE)的奶牛陰道內(nèi)沒有膿性物質(zhì)，正常發(fā)情，但受胎率低下、屢配不孕，只能通過細(xì)胞學(xué)診斷[12]。一般通過測定子宮腔內(nèi)中性粒細(xì)胞(PMN)的比例，來診斷SE。在分娩后20 d～33 d，若 PMN%大于18%或產(chǎn)后34 d～47 d，PMN%大于5%即可診斷為SE[13-14]。因SE沒有明顯的臨床癥狀與健康奶牛不易分辨，在生產(chǎn)中往往容易被忽視，從而影響奶牛的繁殖性能。

2 奶牛子宮炎診斷技術(shù)

2.1 現(xiàn)場診斷

2.1.1 臨床診斷法 臨床上對奶牛子宮炎的診斷主要是通過外部觀察法、直腸檢查法和陰道檢查法。各種子宮內(nèi)感染臨床表現(xiàn)都會因病情的輕重有所區(qū)別。但發(fā)病奶牛一般會出現(xiàn)精神不佳，食欲減退，外陰流有黏性分泌物等癥狀，以此綜合奶牛的發(fā)情狀況以及黏性分泌物的性質(zhì)等癥狀，可得出初步診斷。直腸檢查法在該病診斷中也發(fā)揮著巨大的作用，但此檢測手段需要操作者擁有豐富的臨床經(jīng)驗，且能熟練掌握不同時期奶牛子宮的形態(tài)。因此，該方法具有一定的局限性。陰道檢查法是借助陰道內(nèi)窺鏡來對陰道內(nèi)膿性物質(zhì)的量進(jìn)行評估，從而對子宮內(nèi)膜炎進(jìn)行診斷，可以通過觀察子宮形態(tài)，里面是否有膿性分泌物來判斷，但該方法不能用于SE的診斷。

2.1.2 超聲診斷技術(shù) 隨著國內(nèi)外B超使用越來越普遍，越來越多的學(xué)者探究使用B超技術(shù)來診斷奶牛子宮炎。B超診斷主要是通過B超探頭采集奶牛子宮內(nèi)的聲像圖，觀察子宮形狀大小有無異常、子宮內(nèi)分泌物的量，以及子宮體或子宮角邊緣回聲強(qiáng)度是否規(guī)則，來輔助診斷子宮內(nèi)膜炎[15]。Kasimanickam R等[13]發(fā)現(xiàn)B超和細(xì)胞學(xué)方法聯(lián)合使用可以明顯提高SE的檢出率。Sharma A等[16]運(yùn)用多普勒超聲發(fā)現(xiàn)輕度子宮內(nèi)膜炎的脈搏、阻力指數(shù)和加速時間明顯高于中度和重度子宮內(nèi)膜炎，然而，與輕度子宮內(nèi)膜炎相比，中度和重度子宮內(nèi)膜炎的子宮中動脈血流速度、血流量和舒張末期血流速度明顯升高。

2.1.3 Metricheck裝置評估法(MT) 陰道分泌物是確定奶牛是否存在子宮內(nèi)炎癥反應(yīng)的最明顯指標(biāo)。目前，已有學(xué)者開發(fā)出一種用于檢測陰道分泌物的Metricheck裝置(MT)，可作為傳統(tǒng)陰道鏡檢查的替代品。McDougall S等[17]在奶牛授配前35 d用MT裝置和陰道鏡比較子宮炎的診斷效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT裝置和陰道鏡對子宮炎檢出率分別為60%和42%，MT裝置對子宮炎診斷的檢測靈敏度高于陰道鏡，但特異性比陰道鏡低。因此，MT裝置可以容易取到陰道內(nèi)分泌物，可以通過MT評估更多奶牛是否感染CE[18]。Kusaka H等[19]通過B超、MT、細(xì)胞刷三種不同方法監(jiān)測產(chǎn)后2周～7周的28頭奶牛，結(jié)果表明在產(chǎn)后7周B超和MT聯(lián)合使用，是一種實用監(jiān)測奶牛子宮健康的方法,在現(xiàn)場臨床診斷中，應(yīng)逐步推廣。

2.1.4 自動健康檢測系統(tǒng)(AHMS) 監(jiān)測反芻的時間和活動量是非侵入性傳感器技術(shù)的最新發(fā)展，可以用來評估奶牛的整體健康狀況，并有助于檢測患有子宮炎的奶牛。Liboreiro D N[20]等研究發(fā)現(xiàn)，與健康奶牛相比，患有子宮炎的奶牛，產(chǎn)犢后反芻率和活躍度降低。Stangaferro M L等[21]對1121頭奶牛調(diào)查，與臨床診斷相比，自動健康檢測系統(tǒng)(automated health monitoring system，AHMS)診斷準(zhǔn)確率明顯較高，但通過AHMS進(jìn)行健康指數(shù)評分，診斷子宮炎奶牛靈敏度為55%，對子宮炎和其他相關(guān)疾病靈敏度為78%。AHMS診斷有利于現(xiàn)場診斷，節(jié)省人力，可以及早發(fā)現(xiàn)奶牛異常，進(jìn)行早期治療。

2.2 實驗室診斷

2.2.1 細(xì)胞學(xué)診斷法 細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)是一種準(zhǔn)確、客觀、可靠的檢查方式，能有效區(qū)分不同類型的子宮炎，從而減少了假陽性的出現(xiàn)[22]。細(xì)胞學(xué)診斷通過子宮沖洗、子宮刷、子宮內(nèi)膜活檢、組織切片檢查等方法進(jìn)行。通過計算子宮內(nèi)膜中性粒細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之間的比例，得出產(chǎn)后不同時期中性粒細(xì)胞所占的闕值，用于診斷子宮內(nèi)膜炎，該方法是一種有效診斷SE的方法[23]。Wang M L等[24]對27頭產(chǎn)后30 d奶牛通過生理鹽水無菌沖洗子宮，子宮沖洗液通過離心，染色鏡檢，計算PMN的比例。將產(chǎn)后30 d奶牛子宮沖洗液中PMN比例18%設(shè)定為SE的閾值。Pascottini O B等[14]對42頭產(chǎn)后35 d奶牛通過細(xì)胞刷技術(shù)，無菌進(jìn)入子宮，將子宮內(nèi)膜細(xì)胞刷樣本涂抹在無菌載玻片上，染色鏡檢，計算PMN的比例。將產(chǎn)后35 d奶牛子宮內(nèi)膜PMN比例5%設(shè)定為奶牛子宮內(nèi)膜炎的閾值。當(dāng)陰道內(nèi)無膿性分泌物，且子宮內(nèi)膜PMN≤5%時判定為亞臨床子宮內(nèi)膜炎；當(dāng)陰道內(nèi)有膿性黏液或膿性分泌物，且子宮內(nèi)膜PMN≤5%時判定為臨床型子宮內(nèi)膜炎；當(dāng)2%<子宮內(nèi)膜PMN≤5%時判定為健康奶牛。因國內(nèi)外對于細(xì)胞學(xué)診斷法的診斷時間有所區(qū)別，最佳檢測時間不能確定，給子宮內(nèi)膜炎的診斷帶來很大困難。

2.2.2 生物標(biāo)志物診斷法 隨著越來越多的學(xué)者對奶牛子宮炎進(jìn)行深入研究，奶牛各項生理指標(biāo)不斷被發(fā)現(xiàn)。Beltman M E等[25]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后4周～5周內(nèi)的奶牛當(dāng)IGF-1濃度低于40 ng/mL時更容易出現(xiàn)子宮感染。Pascottini O B等[26]通過分析圍產(chǎn)期奶牛血清中各項指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，患有SE奶牛在產(chǎn)犢前1周，血清中鈣的含量低于健康奶牛；在產(chǎn)后14 d內(nèi)，血清中結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、非酯化脂肪酸、β-羥基丁酸、以及球蛋白的含量均高于健康奶牛，而胰島素樣生長因子低于健康奶牛；在產(chǎn)后35 d白蛋白含量低于健康奶牛?？傮w來說，患有SE的奶牛血清中與系統(tǒng)性炎癥和能量代謝相關(guān)的指標(biāo)更容易受到影響。Wang X等[27]研究發(fā)現(xiàn)外泌體表達(dá)的某些小RNA如mi R-218可以抑制IL-1β、IL-6、TNF-α，以及趨化因子MIP-1β和MIP-1α的活性，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。因此，mi R-218可能成為一項診斷奶牛子宮內(nèi)膜炎的生物學(xué)指標(biāo)。Dervishi E等[28]通過測定患子宮炎奶牛產(chǎn)前8周、4周和1周奶牛早期尿液代謝物特征，發(fā)現(xiàn)在分娩前8周30種代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，分娩前4周34種代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，診斷為子宮炎那周還有20種代謝產(chǎn)物發(fā)生改變，這種改變一直持續(xù)到診斷后4周和8周，因此，根據(jù)代謝產(chǎn)物變化，可把許多氨基酸、三羧酸循環(huán)代謝物和單糖的排泄以及半乳糖、亮氨酸、賴氨酸和泛酸的聯(lián)合檢測可作為子宮炎的預(yù)測生物標(biāo)志物。Wang Y Y等[29]運(yùn)用超高效液相色譜對健康和臨床型子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮分泌物進(jìn)行比較代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與正常子宮分泌物相比，臨床子宮內(nèi)膜炎中香豆酸、苯甲酸和雌馬酚的表達(dá)均下調(diào)；而L-苯丙氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸、亞油酸、花生四烯酸等代謝物表達(dá)均上調(diào)。生物標(biāo)志物的出現(xiàn)為我們早期預(yù)測和預(yù)防奶牛子宮炎提供了一種新的途徑和思路。

2.2.3 免疫細(xì)胞測定法 奶牛產(chǎn)后對傳染病的易感性增加，通常歸因于與過渡期相關(guān)的免疫功能紊亂。單核細(xì)胞在控制細(xì)菌感染的初始免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。Pomeroy B等[30]調(diào)查27頭奶牛在預(yù)產(chǎn)前42 d、14 d和產(chǎn)后14 d與子宮炎和乳腺炎的關(guān)系時，在這3個時間段CD14+T細(xì)胞比例增加，奶?；籍a(chǎn)后疾病的概率會大大增加，CD14+T細(xì)胞有可能會作為將來早期預(yù)測奶牛子宮炎的一個診斷性指標(biāo)。

2.2.4 病原學(xué)診斷法

2.2.4.1 傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng) 子宮炎采樣必須做好無菌操作，樣品采集后，分別通過血平板培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h～48 h，進(jìn)行子宮炎致病菌的分離和純化培養(yǎng)，再通過生化鑒定、生化分型將致病菌鑒別出來?？筛鶕?jù)實際需求篩選敏感藥物，用于子宮炎的治療?；撾[秘桿菌是臨床子宮內(nèi)膜炎的重要致病菌，革蘭氏陰性厭氧菌如壞死梭桿菌、產(chǎn)黑素普雷沃氏桿菌可能與化膿性隱秘桿菌協(xié)同作用，導(dǎo)致CE[31]。但細(xì)菌分離純化的過程操作繁瑣，需要花費(fèi)大量時間，且培養(yǎng)出的微生物不到微生物總數(shù)的1%，存在一定的弊端[32]。

2.2.4.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是近年來發(fā)展速度最快的一門生物技術(shù)，因不需要依賴于細(xì)胞生長，只需要簡單擴(kuò)增，就能將目的基因片段放大百萬倍。該技術(shù)主要包括普通PCR、多重PCR和熒光定量PCR等。Bicalho M L S等[33]研究表明，當(dāng)奶牛在產(chǎn)后1 d～3 d大腸埃希氏菌fimH陽性時，感染壞死梭形桿菌菌幾率較高，產(chǎn)后8 d～10 d患子宮炎幾率也增加；此外當(dāng)奶牛產(chǎn)后34 d～36 d壞死梭形桿菌iktA陽性時，感染化膿隱秘桿菌幾率增加，奶牛感染CE幾率也增加。王寧寧等[34]通過多重PCR技術(shù)對臨床型子宮內(nèi)膜炎進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、乳房鏈球菌敏感性良好。

2.2.4.3 高通量測序技術(shù) 高通量測序技術(shù)是一種高靶向性，一次性可以測得幾十萬到幾百萬個基因序列，在獸醫(yī)方面已經(jīng)廣泛用于畜禽疾病診斷、致病機(jī)理研究、耐藥性分析等[35]。Wang M L等[24]利用高通量測序技術(shù)對比了健康奶牛和患有子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮內(nèi)膜中的菌群分布，發(fā)現(xiàn)在CE梭桿菌豐度增加以及Trueperella和Peptoniphilus的獨(dú)特存在，為后續(xù)子宮內(nèi)膜炎疾病的診斷與治療提供科學(xué)信息。Carvalho M R等[36]發(fā)現(xiàn)類桿菌、卟啉單胞菌和梭桿菌似乎在屬水平上表現(xiàn)出協(xié)同作用，從而導(dǎo)致子宮炎癥。在物種水平上，壞死梭桿菌被確認(rèn)為主要與子宮炎相關(guān)因素之一。

3 展望

目前，國內(nèi)奶牛行業(yè)蓬勃發(fā)展，奶牛子宮炎已經(jīng)成為危害中國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展，影響乳制品產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。奶牛子宮炎診斷方法和判定標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，不同國家地區(qū)奶牛子宮炎的發(fā)病率也存在較大差異。但隨著越來越多的科研工作者對奶牛子宮炎的深入研究，奶牛子宮炎分類標(biāo)準(zhǔn)越來越清晰，研究者普遍以21 d為標(biāo)準(zhǔn)分為子宮炎和子宮內(nèi)膜炎，子宮炎又可分為產(chǎn)褥期子宮炎和臨床型子宮炎，而子宮內(nèi)膜炎又可分為臨床型子宮內(nèi)膜炎、亞臨床型子宮內(nèi)膜炎。也涌現(xiàn)出了許多新的檢測技術(shù)。臨床診斷、超聲技術(shù)、Metricheck 裝置評估法、AHMS等能在現(xiàn)場快速診斷奶牛子宮炎，這些方法敏感性高，適用于基層專業(yè)人員使用，特別是AHMS通過檢監(jiān)測奶牛反芻活動和活動量來判斷奶牛是否感染子宮炎，極大節(jié)省人力。傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法靈活度高，可重復(fù)操作，是使用最廣范的一種技術(shù)。細(xì)胞學(xué)、生物標(biāo)志物、免疫細(xì)胞、病原學(xué)診斷等需要嚴(yán)格依賴實驗室才能做出診斷。但這些法準(zhǔn)確率高、敏感性強(qiáng)，成本高，對操作人員具有嚴(yán)格要求，不適用于基層診斷。

綜上所述，只有明確不同類型奶牛子宮炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，特別是SE診斷標(biāo)準(zhǔn)，才能做到對不同類型奶牛子宮炎的準(zhǔn)確診斷。目前奶牛子宮炎快速診斷方法仍在研究階段，隨著越來越多的科研人員投入研究，相信在不久的將來，一定會研發(fā)出一種簡單快捷、準(zhǔn)確率高、敏感性強(qiáng)、成本低、特異性強(qiáng)的診斷方法。