莫亞男，郝寶成，楊 珍，梁劍平，段慧榮，尚若鋒，王學(xué)紅，張紅娟，劉 宇

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

瘋草(Locoweed)并非植物分類的名詞術(shù)語，而是國際上對黃芪屬、棘豆屬與苦馬豆屬中含有苦馬豆素類有毒植物的統(tǒng)稱，主要分布于美國西部、亞洲和南美洲的牧區(qū)。長期采食瘋草會(huì)導(dǎo)致牲畜神經(jīng)功能障礙、繁殖能力降低、生長抑制甚至死亡。瘋草是對我國草原畜牧業(yè)發(fā)展危害最大的一類毒草。瘋草的主要毒性物質(zhì)是瘋草內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)生的一種吲哚茲定生物堿苦馬豆素(swainsonine，SW)。SW能競爭性抑制甘露糖苷酶活性，引發(fā)酶功能障礙和絡(luò)合物寡糖的積累，從而使不同的細(xì)胞特別是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生空泡化變性。同時(shí)SW通過影響各種糖類、糖蛋白及糖脂的合成以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此SW也是天然的抗癌抗腫瘤藥物、具有廣闊的臨床藥用前景。對瘋草內(nèi)生真菌及SW的研究能夠?yàn)榭鼓[瘤研究提供充足的SW來源，以及通過內(nèi)生真菌育種獲得無毒瘋草，進(jìn)而從根本上解決動(dòng)物瘋草中毒病以促進(jìn)我國西部草原畜牧業(yè)發(fā)展，具有重要意義。本文全面介紹了瘋草在中國的種類與分布、瘋草與內(nèi)生真菌互作關(guān)系、瘋草內(nèi)生真菌種屬及檢測方法、瘋草內(nèi)生真菌傳播方式與內(nèi)生真菌育種；SW的來源、毒理機(jī)制及生物合成通路最新進(jìn)展，以期為瘋草植株及其內(nèi)生真菌的改造利用提供理論基礎(chǔ)。

1 瘋草在中國的種類及分布

瘋草主要分布于海拔1 000 m以上干燥半干燥地區(qū)，具有抗旱耐寒特性以及強(qiáng)大的生命力，在中國西部草原上蔓延成災(zāi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國天然草場總面積為3.97億hm2，受毒草危害區(qū)域有3.33×107hm2。其中瘋草面積占毒草危害總區(qū)域的33%，對我國危害最嚴(yán)重[1]。目前中國存在47種瘋草，包括23種棘豆屬、23種黃芪屬、1種苦馬豆屬，其中有13種是嚴(yán)重的草地危害者，主要有甘肅棘豆、黃花棘豆、小花棘豆、冰川棘豆、莖直黃芪、毛瓣棘豆、鐮形棘豆等。西藏含有這類瘋草10種、青海9種、新疆6種、甘肅11種、寧夏5種，均為受瘋草危害最嚴(yán)重的省份；陜西、山西、四川、吉林、遼寧、河北及黑龍江也含有這類瘋草1種～4種[2]。畜牧業(yè)在我國西部地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)重要地位，而動(dòng)物采食瘋草中毒直接或間接使我國每年經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元人民幣。由此可見，對于瘋草的治理及改造利用刻不容緩。

2 瘋草與內(nèi)生真菌互作關(guān)系

最初人們認(rèn)為瘋草內(nèi)生真菌存在于植株的所有地上部分包括莖、葉鞘、葉、花及種子，之后汪治剛對老齡黃花棘豆植株的各部位進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)根中內(nèi)生真菌分離率為21.33%，莖基部為41.33%，表明瘋草根中也存在有內(nèi)生真菌[3]。瘋草種皮中的菌絲含量最高，主要分布于糊粉層，種胚中不含菌絲。在植物組織中，離地面最近的莖基部組織中的菌絲密度最高，其次是葉鞘和葉片，葉柄中最低。瘋草內(nèi)生真菌選擇性地侵染組織從而在植株中定植，其原因可能是組織間的營養(yǎng)成分不同或是從種子到植株的過程中內(nèi)生真菌有部分丟失所致。植物及其內(nèi)生真菌在長期的進(jìn)化過程中形成了互利共生關(guān)系。瘋草植株可提供內(nèi)生真菌需要的生長物質(zhì)及穩(wěn)態(tài)環(huán)境并通過種子幫助內(nèi)生真菌進(jìn)行傳播繁殖；此外，內(nèi)生真菌可提高植株的抗逆性并促進(jìn)植株生長，其毒性代謝物SW也可避免瘋草被動(dòng)物采食。

瘋草生長于干旱半干旱地區(qū)，具有抗旱耐寒、強(qiáng)生命力和高繁殖率等特點(diǎn)。在中國，它的覆蓋率和年產(chǎn)量遠(yuǎn)超其他的雜草有很大程度上源于其體內(nèi)的內(nèi)生真菌。自然條件下瘋草植株的遺傳變異也會(huì)影響瘋草內(nèi)生真菌在宿主中的定植，He[4]等人通過微衛(wèi)星標(biāo)記表征宿主的遺傳變異，采用PCR及HPLC檢測內(nèi)生真菌感染率以及SW水平，發(fā)現(xiàn)宿主基因型與地理位置、海拔高度及降水量顯著相關(guān)。當(dāng)宿主分化時(shí)，與共生菌的相互作用減少，在同一個(gè)宿主種群中也未能產(chǎn)生可檢測的SW。隨著海拔梯度的上升，黃花棘豆體內(nèi)產(chǎn)SW的鏈格孢屬瘋草內(nèi)生真菌數(shù)量增加，于海拔3 490 m處達(dá)到最高，說明高海拔地區(qū)更有利于瘋草內(nèi)生真菌生長，并起到保護(hù)植株的作用[5]。共生菌的植株中具有大量多元醇及滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)。含內(nèi)生真菌的植物根冠明顯大于不含內(nèi)生真菌的植物，表明兩種植株存在根與地上部分有機(jī)質(zhì)分布的差異。此外，有研究表明黃花棘豆內(nèi)生真菌AlternariasectionUndifilum可促進(jìn)擬南芥的生長，主要通過改變擬南芥的根部結(jié)構(gòu)、增加其葉綠素含量、上調(diào)生物素上游關(guān)鍵基因表達(dá)[6]。含內(nèi)生真菌的植物具有發(fā)達(dá)的根系和極強(qiáng)的抗旱能力，因?yàn)槠淙~片更加卷曲，可以有效地防止水分蒸發(fā)和損失。干旱脅迫下被侵染的小花棘豆具有更高的脯氨酸、過氧化物酶、葉綠素、可溶性蛋白及可溶性糖含量，其丙二醛及電導(dǎo)率與無菌植株相比更低，證明了內(nèi)生真菌提高小花棘豆抗旱能力的作用[7]。夏超發(fā)現(xiàn)在干旱條件下內(nèi)生真菌會(huì)通過增加醉馬草中脫落酸、吲哚乙酸及磷的含量、生物量及凈光合速率，促進(jìn)醉馬草的生長。而且內(nèi)生真菌可能作為潛在的遺傳物質(zhì)攜帶者將母本信息通過種子垂直傳播至下一代[8]。瘋草內(nèi)生真菌也可提高植株的抗病性，當(dāng)醉馬草內(nèi)生真菌Epichlo?gansuensis與麥角菌同時(shí)侵染醉馬草時(shí)，植株的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降低，主要是內(nèi)生真菌通過提高植株抗氧化物酶活性、光合作用、激素信號(hào)物質(zhì)及抗病相關(guān)代謝物含量，進(jìn)而提高植物自身的抵抗力以起到較好的抗病保護(hù)作用[9]。但當(dāng)共生體處于某些宿主生境型中，瘋草內(nèi)生真菌與宿主的關(guān)系會(huì)由共生關(guān)系轉(zhuǎn)為寄生關(guān)系，對宿主造成消耗。在種子萌發(fā)初期，瘋草內(nèi)生真菌的生長會(huì)消耗種子內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)，能量供應(yīng)減少導(dǎo)致無內(nèi)生真菌的瘋草發(fā)芽率、胚芽長及胚根長均高于瘋草內(nèi)生真菌共生體；在溫室環(huán)境中，共生體3個(gè)月幼苗的生物量也顯著低于無菌幼苗[10-11]。

3 瘋草內(nèi)生真菌種屬及檢測方法

瘋草內(nèi)生真菌種屬的劃分歸類自其被分離出后幾度產(chǎn)生更改，瘋草內(nèi)生真菌最初被劃分為鏈格孢屬(Alternariaspp)，而后根據(jù)GenBank中的序列信息將其歸屬于埃里格孢屬(Embellisiaspp)中。當(dāng)根據(jù)波浪狀芽管特征的分生孢子建立了波浪狀芽管孢屬(Undifilumspp)時(shí)，原本屬于埃里格孢菌屬的瘋草內(nèi)生真菌都被劃分至Undifilumspp中。后期研究人員用GAPDH、RPB2和TEF1多基因構(gòu)建進(jìn)化樹并根據(jù)多基因遺傳進(jìn)化分析，將Undifilum及Embellisiaastragali再次劃分至鏈格孢屬中，成為鏈格孢屬波浪狀芽管孢組[12-13]。Martinez利用真菌分離培養(yǎng)和PCR技術(shù)對南美幾種報(bào)道含有SW的巴塔哥尼亞黃芪屬植物進(jìn)行內(nèi)生真菌的檢測,從Astragaluspehuenches及A.illinii的種子中分離到1株共生內(nèi)生真菌。分離到的共生菌在體外均產(chǎn)SW，通過核糖體DNA分析，證明該菌屬于AlternariasectionUndifilum。AlternariasectionUndifilum極有可能與其他報(bào)道含有SW的南美黃芪屬植物有關(guān)聯(lián)[14]。王維夫等人采集了內(nèi)蒙古不同種群中的小花棘豆，從其中分離培養(yǎng)出的內(nèi)生真菌經(jīng)5.8S rDNA/ITS序列比對鑒定為Alternaria，并證明了該菌是小花棘豆含SW的唯一原因[15]。

瘋草內(nèi)生真菌的檢測是探索其在瘋草植株內(nèi)的分布情況與傳播方式等的重要手段。從傳統(tǒng)的菌絲體染色法、分離培養(yǎng)到目前的分子生物技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)都被廣泛應(yīng)用于瘋草內(nèi)生真菌的檢測。苯胺藍(lán)染色法用于觀察菌絲，雖然操作簡便，但是并不具有特異性。瘋草內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)法主要通過觀察真菌體外培養(yǎng)特性及其顯微形態(tài)來檢測與鑒定瘋草內(nèi)生真菌，但該法周期長且易受到環(huán)境因素干擾而不能準(zhǔn)確鑒定真菌種類。因此，科研人員期待找出更快速、準(zhǔn)確的方法用于檢測及鑒定瘋草內(nèi)生真菌。

傳統(tǒng)的PCR檢測法使用的引物是國際通用瘋草內(nèi)生真菌引物OR1/ITS5，但該引物特異性不強(qiáng)。之后陳麗[16]建立了多基因PCR檢測法，可通過當(dāng)家基因、生物堿合成基因以及育性基因?qū)ψ眈R草內(nèi)生真菌進(jìn)行檢測與鑒定，該方法不僅可判定內(nèi)生真菌存在與否，也可確定其類別、育性交配類型及共生體生物堿的類型，也為后續(xù)設(shè)計(jì)具有特異性的引物提供了思路。2016年劉建利設(shè)計(jì)出比OR1/ITS5特異性更高的瘋草內(nèi)生真菌引物OmtssuF/OmtssuR[17]。2021年時(shí)毛彥妮等人又構(gòu)建了基于瘋草內(nèi)生真菌中的swnK基因KS區(qū)域的SYGR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該基因?yàn)榀偛輧?nèi)生真菌中產(chǎn)SW特殊基因，其特異性高于基于ITS序列構(gòu)建的方法，靈敏性也較高，內(nèi)生真菌DNA的最低檢出限為0.009 ng/μL，可定量分析瘋草中內(nèi)生真菌含量[18]。

4 瘋草內(nèi)生真菌的傳播與繁育

瘋草內(nèi)生真菌在瘋草中的傳播方式主要是垂直傳播，但是瘋草種子帶菌率并非100%，且?guī)ЬN子長出的植株也未必帶菌，可能因?yàn)樗拗髋c內(nèi)生真菌的互利共生關(guān)系不穩(wěn)定以及內(nèi)生真菌通過種子的過渡不完全。我國的小花棘豆與美國絹毛棘豆存在同源種屬的內(nèi)生真菌，這種情況很難通過瘋草內(nèi)生真菌只存在垂直傳播方式進(jìn)行解釋。瘋草的莖和葉柄插入PDA培養(yǎng)3個(gè)月后會(huì)產(chǎn)生大量分生孢子，因此瘋草內(nèi)生真菌也可能存在水平傳播方式[11]。如果能夠明確瘋草內(nèi)生真菌的傳播方式，就可以利用內(nèi)生真菌育種，通過使改良的內(nèi)生真菌侵染不帶菌的瘋草植株，將其改造利用。

目前內(nèi)生真菌育種取得了較大進(jìn)展，我國學(xué)者采用無菌幼苗接種技術(shù)，將Epichlo?gansuensis菌株e7080成功轉(zhuǎn)入醉馬草中，構(gòu)建出e7080-醉馬草共生體，接種成功率為21%[16]。2021年李春杰等人通過愈傷組織接種法已人工構(gòu)建出禾草內(nèi)生真菌(Epichlo?bromicola)-大麥的新共生體，新共生體與野生大麥相比其單株種子產(chǎn)量與地上生物量均顯著增加。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程技術(shù)的提高及內(nèi)生真菌人工接種技術(shù)的發(fā)展，植物內(nèi)生真菌將被改造的更為優(yōu)良，使用內(nèi)生真菌育種將成為未來的熱點(diǎn)[19,20]。通過基因工程改造瘋草內(nèi)生真菌使其成為兼具抗性及無毒特性的菌株，并將之回接至瘋草植株中即可獲得優(yōu)良新共生體指日可待，這將為畜牧業(yè)的發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。

5 SW的來源

SW有3種來源，分別是從植物中提取、化學(xué)合成及真菌發(fā)酵?，F(xiàn)階段人們無法確定存在多少種含SW的植物，由于生長環(huán)境、類別、內(nèi)生真菌數(shù)量的不同，其SW含量也存在差異。但由于植物中的SW含量有限，過度收割會(huì)對草原生態(tài)造成破壞，加之提取過程十分復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故而該方法不適于大量生產(chǎn)SW。第2種來源是通過化學(xué)合成的方法生產(chǎn)SW。由于SW結(jié)構(gòu)中存在手性碳原子，所有的方法都需要先合成SW的前體或中間衍生物，然后通過幾個(gè)步驟轉(zhuǎn)換為SW。這使得合成難度增大且合成過程中會(huì)產(chǎn)生大量難以分離的手性異構(gòu)體，給化學(xué)合成SW帶來了極大的挑戰(zhàn)。第3種來源是通過真菌發(fā)酵提取SW。豆類絲核菌(R.leguminicola)、金龜子綠僵菌(M.anisopliae)、埃里格孢菌(Embellisiaspp.)以及稻瘟病菌(Magnaporthe)是主要產(chǎn)SW的真菌。現(xiàn)階段只有波浪狀芽管孢組屬可以從不同種的瘋草中分離得到。真菌發(fā)酵具有低成本、條件易控制、環(huán)境友好等優(yōu)勢。郝寶成等人于2019年通過紫外輻照、亞硝基胍處理AlternariasectionUndifilumoxytropis獲得了SW含量較高的U4、UD1突變株，其產(chǎn)量相比于原始菌株分別增加了16.02%和21.87%[21]。2021年Liang等人通過重離子輻照后成功獲得了穩(wěn)定的A.oxytropis突變體UO1，其SW的產(chǎn)率相較于野生型菌株高了14.84%。通過試驗(yàn)確定了其最佳培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)基pH為6.5，最佳接種濃度為每200 mL接種2 mL菌懸液，適當(dāng)添加生物合成前體L-哌啶酸和L-賴氨酸可以增加SW的合成[22]。當(dāng)SW的生物合成途徑及機(jī)理確定之后，可通過基因編輯改造瘋草內(nèi)生真菌，得到高產(chǎn)菌株從而提高SW產(chǎn)量，因此該方法在生物制藥領(lǐng)域具有巨大的潛力。

6 SW的毒理學(xué)機(jī)制

SW具有神經(jīng)毒性及生殖毒性，會(huì)導(dǎo)致牲畜神經(jīng)功能障礙、繁殖能力降低、生長抑制甚至死亡，其最新毒理學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展如下。

6.1 神經(jīng)毒性

SW造成神經(jīng)癥狀的主要原因是細(xì)胞內(nèi)α-甘露糖苷酶活性減弱。α-甘露糖苷酶是許多功能性蛋白質(zhì)糖基化的關(guān)鍵酶，α-甘露糖苷酶活性的抑制將引起寡糖絡(luò)合物聚集于溶酶體中，糖蛋白合成障礙。此外，SW能夠通過死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和自噬。然而目前有試驗(yàn)研究表明，SW可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活ULK1啟動(dòng)細(xì)胞自噬減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而將損傷降低[23]。自噬體與溶酶體融合，但SW能使溶酶體相關(guān)表達(dá)降低，引起溶酶體功能障礙，導(dǎo)致自噬晚期降解受阻，從而抑制自噬降解，最終引起細(xì)胞死亡[24]。故SW引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與自噬也是其造成神經(jīng)毒性的原因之一。小鼠圍產(chǎn)期時(shí)攝入SW將抑制海馬齒狀回及嗅球神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力，從而減少新生顆粒細(xì)胞存活數(shù)量，神經(jīng)元數(shù)量改變且顆粒細(xì)胞樹突復(fù)雜程度降低。新生小鼠齒狀回早期發(fā)育受損，神經(jīng)元遷移紊亂加之海馬中小棘蛋白和NeuN蛋白表達(dá)水平降低而影響海馬發(fā)育，從而造成對神經(jīng)系統(tǒng)的損害[25]。

6.2 生殖毒性

N-聚糖糖基化修飾對糖蛋白激素的活性具有重要的調(diào)控作用[26]?，F(xiàn)有研究表明SW通過抑制N-聚糖加工過程中的關(guān)鍵酶(溶酶體α-甘露糖苷酶-Ⅰ、高爾基體-α-甘露糖苷酶-Ⅱ、N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ及N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ)活性，改變糖基化修飾、破壞N-聚糖的糖鏈結(jié)構(gòu)，使雜合型N-聚糖數(shù)增多，復(fù)合型N聚糖數(shù)減少，低聚糖在細(xì)胞內(nèi)蓄積使促性腺激素分泌減少。同時(shí)性類固醇激素限速酶及生殖激素受體的表達(dá)量降低，因此該類激素分泌降低，與受體結(jié)合后活性下降，使其對下游類固醇激素分泌的調(diào)控作用失衡，最終導(dǎo)致機(jī)體繁殖障礙[27-28]。

7 SW生物合成通路研究

國內(nèi)外學(xué)者針對瘋草內(nèi)生真菌中SW生物合成途徑的初始步驟進(jìn)行了廣泛的研究。SW是賴氨酸經(jīng)過酵母氨酸、哌啶酸、1-哌啶-6-羧酸的代謝產(chǎn)物[29]。目前豆類絲核菌及金龜子綠僵菌的SW生物合成途徑已被推導(dǎo)出。在豆類絲核菌中，該過程是從賴氨酸開始進(jìn)行，途徑中會(huì)產(chǎn)生一個(gè)分支，一條支線是合成SW，另一條支線是合成豆類絲核菌素(SF)。在金龜子綠僵菌中，SW合成的前半部分有兩種途徑，最終都合成SW的前體物質(zhì)1-哌啶-6-羧酸(P6C)，然后再生成SW。但是氧化鏈格孢菌中的SW生物合成途徑中的類似步驟尚不清楚。

酵母氨酸還原酶(Sac)在氧化鏈格孢菌的SW代謝中發(fā)揮作用，P6C和哌啶酸都是SW合成的前體。王玨等通過構(gòu)建sac互補(bǔ)株C1 ，發(fā)現(xiàn)C1與sac敲除株M1及野生株OW7.8相比SW水平顯著提高，可能由于C1中的強(qiáng)啟動(dòng)子使sac過表達(dá)，從而促進(jìn)了C1SW的生成，也證明了sac在SW生物合成中的重要作用[30]。之后Li對OW7.8及M1進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序分析鑒定了41個(gè)可能與SW生物合成相關(guān)的基因，推測SW在真菌中的生物合成途徑包括P6C和P2C兩個(gè)分支[31]。通過對氧化鏈格孢菌的基因進(jìn)行測序、注釋，發(fā)現(xiàn)酵母氨酸脫氫酶(SDH)，酵母氨酸氧化酶(FAP2)，吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)，聚酮合酶(PKS)、細(xì)胞色素P450，酵母氨酸還原酶(SR)和甲基哌啶氧化酶(PIPOX)可能在SW生物合成途徑中發(fā)揮作用[32]。近年來，豆類絲核菌、金龜子綠僵菌、氧化鏈格孢菌以及印度旋花內(nèi)生真菌的基因組序列分析顯示這類產(chǎn)SW真菌共有的一個(gè)直系同源基因簇，被確定為SW合成基因簇(swainsonine biosynthesis gene cluster,SWN)，主要包括swnA、swnR、swnN、swnH1、swnH2和swnK等基因，進(jìn)一步證實(shí)了這些內(nèi)生真菌中存在相似的SW生物合成途徑。其中swnK基因是一個(gè)多功能酶編碼基因，由A、KS、AT、SDR、SDRe1等多個(gè)區(qū)域組成，包括預(yù)測的腺苷酸和?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域與其相關(guān)的硫醇化結(jié)構(gòu)域，β-酮?；厦附Y(jié)構(gòu)域和兩個(gè)還原酶結(jié)構(gòu)域，可能在SW生物合成中發(fā)揮重要作用。通過使用同源重組敲除綠僵菌中的ΔswnK，使其突變，該突變體不能產(chǎn)生SW，然后用野生型基因補(bǔ)充了突變體后能重新建立SW的生物合成，從而證明了swnK的作用[33]。其他的SWN基因群被預(yù)測是編碼兩個(gè)推斷的羥基酶和兩個(gè)還原酶，敲除金龜子綠僵菌中的swnR基因后，突變株的SW含量顯著降低，說明swnR是關(guān)鍵催化酶基因[34]。郝寶成等利用亞硝基胍誘變AlternariasectionUndifilumoxytropis篩選出D4突變株，并使用高通量測序技術(shù)對原始菌株和D4菌株進(jìn)行全基因組測序，獲得D4和原始株相關(guān)基因組片段后，注釋到產(chǎn)SW的關(guān)鍵基因swnK、swnH2、swnH1、swnR和關(guān)鍵酶預(yù)測氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、吡咯啉-5-羧酸還原酶、甲酸/甘油酸脫氫催化酶、酵母氨酸還原酶相似蛋白，并對A.oxytropis的SW生物合成通路進(jìn)行了最新的預(yù)測[21,35]。毛彥妮已將PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的Split-marker重組技術(shù)成功應(yīng)用于瘋草內(nèi)生真菌，克服了真菌靶向基因替換挑戰(zhàn)，并成功構(gòu)建KS基因敲除盒，該技術(shù)是研究瘋草內(nèi)生真菌基因功能的良好選擇[36]。目前，SW詳細(xì)的生物合成路徑仍不清楚，科研人員已經(jīng)獲得A.oxytropis中與SW合成相關(guān)的一些推測的關(guān)鍵酶的基因序列，并且基因敲除試驗(yàn)有了進(jìn)一步的突破。相信通過這些關(guān)鍵酶的逐步確定，可以進(jìn)一步細(xì)化SW生物合成的機(jī)理，為后續(xù)改造瘋草內(nèi)生真菌奠定了基礎(chǔ)。

8 展望

瘋草營養(yǎng)價(jià)值豐富，是一種潛在可利用的牧草資源，同時(shí)可以抵御干旱、寒冷和害蟲的侵害，能在惡劣的環(huán)境中旺盛生長。因此，瘋草被視為生態(tài)社區(qū)特定草地的重要組成部分，特別是當(dāng)前中國的西部草原環(huán)境逐年惡化，對草原的保護(hù)刻不容緩。不應(yīng)該簡單地挖除或消滅瘋草，而應(yīng)該對其進(jìn)行研究和利用。以前的研究專注于瘋草內(nèi)生真菌SW生物合成的性能、內(nèi)生真菌與其宿主瘋草間的關(guān)系以及植物的毒理機(jī)制。未來針對瘋草內(nèi)生真菌的研究主要集中于兩個(gè)方面，通過敲除逆向調(diào)節(jié)酶的基因增加SW產(chǎn)量，能夠?yàn)檠芯科湓诿庖哒{(diào)節(jié)、抗癌活性中的作用提供充足的SW來源；另外可以通過敲除假定的前調(diào)節(jié)酶使瘋草內(nèi)生真菌不產(chǎn)SW，在此基礎(chǔ)上通過人工構(gòu)建獲得不含SW的瘋草新品種，就能從根本上解決動(dòng)物瘋草中毒病并進(jìn)行中國西部草地中瘋草的綜合利用和管理。