季圓清,周宇航,張通,謝華麗,董丹,陳寧,范曉光*
1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)2(浙江震元制藥有限公司,浙江,紹興,312071)
L-茶氨酸(以下簡稱茶氨酸)是存在于茶樹植物中的一種特殊氨基酸,約占茶葉總游離氨基酸含量的60%~70%,占茶葉干重的1%~2%。茶氨酸最早由日本學者從玉露綠茶中分離得到并將其命名,其化學名稱為N-乙基-γ-谷氨酰胺。茶氨酸賦予茶葉鮮美的味道和獨特的風味,其在茶葉中的含量會在一定程度上影響茶的質(zhì)量和價格[1]。除了獨特的風味之外,茶氨酸對人體健康有許多有益作用,如緩解壓力、改善睡眠質(zhì)量、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、抑制高血壓、抗氧化、抗腫瘤以及提高記憶力等[2]。1964年,日本批準茶氨酸作為食品添加劑使用,在使用過程中不作限制用量[3]。1985年,美國食品藥品監(jiān)督管理局確認茶氨酸是一般公認為安全的物質(zhì)(generally recognized as safe,GRAS),在食品中使用沒有特定用量限制[3]。2014年,我國批準茶葉茶氨酸為新食品原料。
茶氨酸主要應用于食品和飲料,其次是保健品和藥品。根據(jù)恒州博智(QYResearch)的統(tǒng)計,2021年全球茶氨酸市場銷售額達到了0.6億美元,預計2028年將達到0.9億美元,年復合增長率為6.6%。鑒于茶氨酸的應用價值和市場潛力,本文結(jié)合近幾年國內(nèi)外相關的研究報道及課題組的工作,對植物中茶氨酸的合成途徑以及茶氨酸的生產(chǎn)技術研究進展進行綜述,并對生物法制備的茶氨酸在食品行業(yè)中的應用進行了展望。
茶氨酸主要是在C.sinensis的根中合成,這里也是冬季茶氨酸的臨時貯存場所。當春季到來,茶氨酸就被運輸?shù)接籽恐衃8]。茶氨酸的合成受到氨態(tài)氮(NH4-N)、硝態(tài)氮(NO3-N)、光、溫度和鹽等非生物因素的影響。懸浮培養(yǎng)茶葉細胞實驗表明,氮素絕對量以及NH4-N和NO3-N的比值對茶氨酸合成的影響最大[9]。此外,茶氨酸可以被茶氨酸氨基水解酶水解,產(chǎn)生谷氨酸和乙胺。水解反應主要發(fā)生在葉片中[10]。
圖1 茶樹中茶氨酸的合成途徑Fig.1 Pathway of theanine synthesis in Camellia sinensis
C.sinensis和少數(shù)植物能夠完全依靠自身代謝合成茶氨酸,而其他植物只能利用外源底物合成茶氨酸。CHENG等[11]考察了茶樹(C.sinensis)、金花茶(C.nitidissima)、山茶(C.japonica)、玉米(Zeamays)、鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)和番茄(Solanumlycopersicum)中的代謝物。結(jié)果表明,上述植物中都有谷氨酸的積累,但只有茶樹屬植物(Camellia)和玉米(Z.mays)中有乙胺和茶氨酸的積累,且C.sinensis中茶氨酸的積累量最多。如果將同位素標記的乙胺供給上述植物的根和葉,那么在這些植物中都可以檢測到茶氨酸。因此,這些植物中都存在能夠催化茶氨酸合成的酶。
由于茶氨酸與谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)非常相似,TS與L-谷氨酰胺合成酶(L-glutamine synthetase,GS)兩種酶具有高度同源性。研究表明,C.sinensis來源的TS1與GS3的同源性為99%,TS2與GS1的同源性為97%,而TS1和TS2之間的同源性僅為83%[12]。隨后,研究人員分別從Z.mays[13],A.thaliana[14]和S.lycopersicum[15]中克隆并鑒定了GS編碼基因,其中A.thaliana中的GS具有合成谷氨酰胺和茶氨酸的活性,說明在底物合適的情況下,一些植物可以通過GS合成茶氨酸。
從茶葉或茶渣中直接提取、分離和純化茶氨酸是最直接、有效和安全的生產(chǎn)方式,也能最大程度上保持茶氨酸的天然活性和功能。茶氨酸的提取方法主要包括沉淀法、離子交換樹脂法及膜分離法。沉淀法是利用茶氨酸可溶于水的特點,先用熱水浸提茶葉,再將醋酸鉛加入浸提液中沉淀除去蛋白質(zhì)、多酚和一部分色素,最后過濾、濃縮和精制后獲得天然茶氨酸產(chǎn)品[16]。這種方法產(chǎn)品得率低,容易引入大量重金屬離子,操作復雜,易造成茶氨酸的損失。離子交換樹脂法是利用茶氨酸兩性電解質(zhì)的特性,采用強酸性陽離子對其進行分離純化的過程[17]。將茶葉浸提物經(jīng)絮凝和沉淀除去蛋白質(zhì)和一些色素,再通過吸附進一步除去色素、多酚等大分子有機物,然后將濾液通過離子交換樹脂獲得粗品茶氨酸,粗產(chǎn)物最后用無水乙醇重結(jié)晶獲得純度大于90%的產(chǎn)品。這種方法收率很低,而且原料成本很高。膜分離法富集茶氨酸是利用不同孔徑大小的膜將茶氨酸與雜質(zhì)分離,從而達到富集和初步純化茶氨酸的效果[18]。通過該方法獲得的產(chǎn)品純度和得率較低,僅適用于茶氨酸生產(chǎn)的初步分離。
目前我國已經(jīng)批準茶葉茶氨酸作為新食品原料,但茶葉中茶氨酸的含量僅為7~12 mg/g干重,且采用提取法制備的茶氨酸大多為黃色粉末,純度普遍較低(>20%)。如需獲得高純度產(chǎn)品,需要增加繁瑣的提取工序,如多步的樹脂吸附及分離,從而顯著增加了生產(chǎn)成本,影響了產(chǎn)品的終端應用??傮w來說,利用提取法制備茶氨酸無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)和應用的要求。
化學合成法是獲得高純度茶氨酸的有效方法,也是近年來茶氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。以谷氨酸供體(主要是酯型谷氨酸供體或乙?;劝彼峁w)為原料,通過保護α-氨基和α-羧基、活化γ-羧基、與乙胺或乙胺供體反應、脫除保護基等步驟制備茶氨酸?;瘜W合成法生產(chǎn)茶氨酸始于20世紀50年代,經(jīng)不斷的發(fā)展已經(jīng)形成了包括焦谷氨酸法(L-吡咯烷酮酸法)[19]、N-取代谷氨酸γ-酯法[20]和N-取代谷氨酸酐法[21]在內(nèi)的多種合成工藝。
化學合成茶氨酸具有成本低、純度高、可大規(guī)模生產(chǎn)等特點。但是,化學合成產(chǎn)品易形成D、L-型消旋體,需要對其分離才能得到L型茶氨酸。日本學者在這一領域做了很多工作,成功通過固定化消旋酶技術分離了D、L-型茶氨酸,但分離成本較高,產(chǎn)品收率較低。此外,消費者難以接受化學合成的“非天然”茶氨酸,導致化學合成產(chǎn)品的應用局限在保健品和藥品,無法應用于對安全性要求較高的食品和飲料中。
酶催化法制備茶氨酸具有立體選擇性強、底物特異性強、催化時間短、產(chǎn)量高以及催化劑可再生等優(yōu)勢,已成為近年來的研究熱點。國內(nèi)外的研究表明共有5種微生物來源的酶可以催化茶氨酸的合成,包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)、L-谷氨酰胺酶、GS、γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase,GMAS) 以及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)。GGT和L-谷氨酰胺酶可以直接催化γ-谷氨?;霓D(zhuǎn)移反應,無需消耗ATP;GS,GMAS和γ-GCS能夠以谷氨酸為底物合成茶氨酸,但需要消耗ATP。表1中列舉了酶催化法制備茶氨酸的典型案例。
表1 酶催化法制備茶氨酸Table 1 Enzymatic Synthesis of Theanine
2.3.1 GGT
GGT廣泛存在于各種生物中,可以催化γ-谷氨酰肽中鍵的水解,并將γ-谷氨?;D(zhuǎn)移到氨基酸或肽,即同時催化水解反應與轉(zhuǎn)肽反應。細菌來源的GGT具有廣泛的底物特異性,但只有E.coli和Bacillusspecies來源的GGT可以用于茶氨酸的合成。SUZUJI等[22]首次證明E.coliK-12來源的GGT(EcGGT)可催化谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為60%。而使用谷氨酸γ-甲酯代替谷氨酰胺作為γ-谷氨?;w,EcGGT的酶活提高了1.2倍,轉(zhuǎn)化率提高到95%[23]。進一步使用B-FITTER軟件分析EcGGT中與溫度因素相關的所有氨基酸殘基,篩選出Glu387殘基進行突變,突變體E387Q的反應溫度提高了10 ℃,可以催化120 mmol/L谷氨酰胺產(chǎn)生106.9 mmol/L的茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為89.1%[24]。與E.coli相比,Bacillusspecies來源的GGT的催化活力更高。但使用9 U/mLB.subtillis168來源的GGT催化1 mol/L谷氨酰胺產(chǎn)生450 mmol/L茶氨酸,但轉(zhuǎn)化率只有45%[25]。通過對B.licheniformis來源的GGT(BlGGT)中Asn450殘基進行突變,突變體N450A和N450D的催化效率從16.04 mmol/(L·s)提高到123.65 mmol/(L·s)以上,而且其轉(zhuǎn)肽活性和水解活性的比例從3.5提高到7.6以上[37]。在使用25 μg/mL BlGGT/N450D催化250 mmol/L谷氨酰胺反應中,最終產(chǎn)生235 mmol/L的茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為94%[26]。LI等[27]從海洋細菌B.amyloliquefaciens中獲得了耐鹽的GGT(BaGGT),并通過易錯PCR方法對其突變,突變體V319A/S437G轉(zhuǎn)肽活性和水解活性的比例從1.6提高到35.6。使用20 μg/mL BaGGT/V319A/S437G催化200 mmol/L谷氨酰胺產(chǎn)生166 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為83%。
使用GGT催化的優(yōu)勢在于它并不依賴ATP,且反應條件溫和,操作簡便。但該酶也存在一個嚴重的缺點,在其反應過程中通常需要添加較高濃度的乙胺并控制pH值在適宜范圍內(nèi),以防止底物谷氨酰胺的水解以及由于自轉(zhuǎn)肽作用產(chǎn)生副產(chǎn)物γ-谷氨酰谷氨酰胺。
2.3.2L-谷氨酰胺酶
L-谷氨酰胺酶屬于一種酰胺基水解酶,在各類原核和真核生物中都有廣泛分布。一些微生物來源的L-谷氨酰胺酶可以催化谷氨酰胺的γ-谷氨?;蚴荏w分子羥胺的轉(zhuǎn)移反應,其中來源于Pseudomonasspecies的L-谷氨酰胺酶具有合成茶氨酸的活性。TACHIKI等[28]首次從P.nitroreducensIFO 12694中分離出L-谷氨酰胺酶,證明其可以分別以羥胺、甲胺和乙胺作為受體分子。使用0.5 U/mL該酶催化0.7 mol/L谷氨酰胺產(chǎn)生0.27 mol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為54%。SHUAI等[29]利用15.5%蔗糖溶液處理P.nitroreducensSP.001細胞后,滲透沖激下L-谷氨酰胺酶酶活提高239%。使用1 U/mL該酶催化0.75 mol/L谷氨酰胺產(chǎn)生0.49 mol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為66%。此外,真菌Trichodermakoningii來源的L-谷氨酰胺酶也可以催化茶氨酸的合成,但轉(zhuǎn)化率較低[30]。
L-谷氨酰胺酶的性質(zhì)與GGT相似,即不需要消耗ATP就可以合成茶氨酸,但對于底物濃度和pH等反應條件的要求較高。為了增強L-谷氨酰胺酶的穩(wěn)定性和重復利用性,研究人員使用介孔二氧化硅(mesoporous silica,MPS)作為固定化載體來固定L-谷氨酰胺酶,并通過氧化鋯對MPS進行表面修飾以提高載體在高pH值下的穩(wěn)定性,從而增加了固定化酶在茶氨酸生產(chǎn)中的使用次數(shù)[38]。
2.3.3 GS
GS在ATP的存在下主要催化谷氨酸鹽和游離氨合成谷氨酰胺,與生命系統(tǒng)中氮代謝和谷氨酰胺的合成息息相關。一些細菌來源的GS具有催化茶氨酸合成的能力。TACHIKI等[39]首次從MicrococcusglutamicusATCC 13032中分離出GS,證明其可以分別以甲胺或乙胺為底物合成γ-谷氨酰甲胺和茶氨酸。隨后,YAMAMOTO等[40]從PseudomonastaetrolensY-30中分離出GS(PtGS),證明其對乙胺的活性比氨高出7%。該酶的基因序列已被測出(GenBank No.AB233456),并在大腸桿菌中成功表達,重組GS顯示出與原酶相同的特性,并且活力提升了30倍。
細菌來源的GS催化的連接反應需要連續(xù)供應ATP,因此ATP的再生對于GS的工業(yè)應用至關重要。在研究GS催化合成茶氨酸時,開發(fā)了一種使用面包酵母再生ATP的有效途徑。該途徑被稱作“能量轉(zhuǎn)移與發(fā)酵偶聯(lián)”,即利用酵母代謝葡萄糖產(chǎn)生ATP,從而為酶催化反應提供能量。YAMAMOTO等[31]利用100 U/mL的PtGS和60 g/L的酵母細胞催化200 mmol/L谷氨酸可產(chǎn)生170 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為85%。而ZHOU等[32]使用0.1 mg/LB.subtillis168來源的GS和30 g/L的酵母細胞催化200 mmol/L谷氨酸產(chǎn)生87.8 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為44%。
2.3.4 GMAS
GMAS在ATP的存在下主要催化谷氨酸和甲胺合成N-甲基-γ-谷氨酰胺(N-methyl-γ-glutamine,γ-GMA),在甲胺營養(yǎng)型細菌的碳代謝中發(fā)揮重要作用。KIMURA等[41]首次從Methylophagasp.AA-30中分離出GMAS,該酶顯示出較寬的底物特異性范圍,并能以乙胺為底物合成茶氨酸。YAMAMOTO等[42]從MethylovorusmaysNo.9中也分離出GMAS(MmGMAS),該酶對乙胺具有極高的親和力,在中性pH值條件下催化低濃度乙胺合成茶氨酸的效率比PtGS高出20倍。該酶的基因序列已被測出(GenBank No.AB333782),并在大腸桿菌中成功表達。重組GMAS顯示出與原酶相同的特性,并且活力提升了23倍。
與GS相似的是,GMAS催化需要使用ATP。LIU等[33]利用聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)再生ATP,使用30 U/mL的MmGMAS和8 U/mL的PPK催化400 mmol/L谷氨酸產(chǎn)生340 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率達到84%。相比之下,利用“能量轉(zhuǎn)移與發(fā)酵偶聯(lián)”途徑再生ATP[34],使用30 U/mL的MmGMAS和60 g/L的酵母細胞催化600 mmol/L谷氨酸產(chǎn)生約600 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率為100%,顯示出良好的工業(yè)應用前景。
2.3.5 γ-GCS
γ-GCS在ATP的存在下主要催化谷氨酸和半胱氨酸為合成γ-谷氨酰半胱氨酸,這是谷胱甘肽合成的第一步反應。MIYAKE等[35]指出大腸桿菌γ-GCS具有廣泛的底物特異性,能夠催化谷氨酸和脂肪胺類化合物生成γ-谷氨酰胺類化合物。利用大腸桿菌γ-GCS和自身糖代謝產(chǎn)生的ATP,可以催化414 mmol/L谷氨酸產(chǎn)生12.1 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率只有3%。HIBI等[43]解析了大腸桿菌γ-GCS的晶體結(jié)構(gòu),三維模型顯示出底物谷氨酸結(jié)合口袋具有高度專一性,而半胱氨酸結(jié)合口袋能夠接受與半胱氨酸大小和極性相似的化合物,如乙胺、甘氨酸等,但是催化茶氨酸合成的活性較低。YAO等[36]采用隨機突變方法對大腸桿菌γ-GCS定向進化,突變體γ-GCS13B6酶活力是野生型的14倍,可以催化200 mmol/L谷氨酸產(chǎn)生174 mmol/L茶氨酸,轉(zhuǎn)化率達到87%。
從已報道的利用酶催化法制備茶氨酸的研究可以看出(表1),使用高度親和乙胺的GMAS結(jié)合ATP再生系統(tǒng)是最有效的合成茶氨酸的手段。但是酶催化法也存在一些問題,如催化體系復雜、底物價格昂貴、酶制備和酶反應需要分步進行、設備占用率高等,因此生產(chǎn)成本明顯高于化學法。雖然使用固定化方法能夠減少酶的使用成本,但對于含有ATP再生系統(tǒng)的酶催化體系進行固定化難度較大,且不易放大到工業(yè)規(guī)模。與酶催化法相比,微生物發(fā)酵法路線簡單、培養(yǎng)基原料價格低廉、設備占用率低,更適用于茶氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。表2中列舉了發(fā)酵法制備茶氨酸的典型案例。
表2 發(fā)酵法制備茶氨酸Table 2 Production of theanine by fed-batch fermentation
2.4.1 乙胺流加發(fā)酵制備茶氨酸
GMAS以谷氨酸和乙胺為底物,且反應需要消耗ATP??紤]到谷氨酸為微生物的初級代謝產(chǎn)物,而ATP通過呼吸作用可以產(chǎn)生,因此理論上只需要在微生物細胞內(nèi)構(gòu)建谷氨酸到茶氨酸的代謝途徑,增強葡萄糖到谷氨酸和茶氨酸的代謝通量,并在發(fā)酵過程中流加前體物乙胺,即可實現(xiàn)茶氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)。
谷氨酸棒桿菌屬于GRAS菌株,并且天然能夠產(chǎn)生谷氨酸。本課題組以谷氨酸高產(chǎn)菌C.glutamicumGDK-9作為出發(fā)菌株構(gòu)建茶氨酸生產(chǎn)菌株(圖2)[44]。構(gòu)建質(zhì)粒pXTuf 在GDK-9中過表達MmGMAS,流加乙胺發(fā)酵檢測到茶氨酸的產(chǎn)生,但還有大量谷氨酸的殘留。敲除谷氨酸分泌蛋白基因Ncgl1221,重組菌株13032ΔNcgl1221/pXtuf-gmasMm在5 L發(fā)酵罐發(fā)酵48 h可以產(chǎn)生42 g/L茶氨酸,對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達到19.6%,副產(chǎn)物丙氨酸和谷氨酸含量小于1 g/L,賴氨酸的含量為1.86 g/L。此外,嘗試以基因組整合方式替代質(zhì)粒表達MmGMAS,但是三拷貝tuf-gmasMm重組菌株的茶氨酸產(chǎn)量依然較低。
Ncgl1221-谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白;GMAS-γ-谷氨酰甲胺合成酶圖2 代謝工程改造C. glutamicum構(gòu)建茶氨酸生產(chǎn)菌Fig.2 Metabolic engineering of C. glutamicum for theanine production
與谷氨酸棒桿菌相比,大腸桿菌具有生長周期短、營養(yǎng)需求低、基因表達元件豐富等特點。本課題組以野生型E.coliW3110作為出發(fā)菌株,構(gòu)建無質(zhì)粒的茶氨酸生產(chǎn)菌株[45-46]。首先引入Paracoccusaminovorans來源的GMAS,并使用“T7RNA聚合酶-T7啟動子”系統(tǒng)控制并增強gmasPa的表達。其次,過表達內(nèi)源的檸檬酸合酶基因gltA和C.glutamicum來源的谷氨酸脫氫酶基因cgl2079,增加前體物谷氨酸的合成。然后,敲除琥珀酰CoA合成酶基因sucCD,阻斷三羧酸循環(huán),讓碳代謝更多流向茶氨酸合成,同時過表達C.glutamicum來源的丙酮酸羧化酶基因cgl0689,回補缺失的草酰乙酸。最后,過表達Mannheimiasucciniciproducens來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckMs,減少羧化反應ATP的消耗。對5 L發(fā)酵罐中乙胺的流加方式進行了優(yōu)化,在最優(yōu)條件下,重組菌株E.coliTH11發(fā)酵26 h可以產(chǎn)生70.6 g/L茶氨酸,對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達到42%,副產(chǎn)物乙酸的含量小于1 g/L,具有較好的工業(yè)應用前景。
惡臭假單胞菌是一種革蘭氏陰性、非致病性的土壤細菌,具有魯棒性強、營養(yǎng)需求低、生長迅速等特點。BENNINGHAUS等[47]以PseudomonasputidaKT2440為出發(fā)菌株構(gòu)建茶氨酸生產(chǎn)菌株。首先,利用內(nèi)源的Ptac控制的gdhA基因替換甘油代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白基因glpR,增強谷氨酸合成的同時,提高菌株對于甘油的利用率。然后,使用pEV1質(zhì)粒過表達MethylorubrumextorquensDM4來源的GMAS,構(gòu)建出茶氨酸的合成代謝通路。接著,使用pEV3質(zhì)粒過表達Caulobactercrescentus來源的木糖操縱子xylXABCD,使菌株能夠利用木糖作為碳源。在2 L發(fā)酵罐中,重組菌株Thea1能夠利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生10 g/L茶氨酸,對碳源的轉(zhuǎn)化率為3.3%;能夠利用甘油產(chǎn)生17.2 g/L茶氨酸,對甘油的轉(zhuǎn)化率為13%。重組菌株TheaX能夠利用甘油和木糖產(chǎn)生21 g/L茶氨酸,對碳源的轉(zhuǎn)化率為3.3%。
2.4.2 葡萄糖從頭發(fā)酵制備茶氨酸
盡管乙胺流加發(fā)酵可有效生產(chǎn)茶氨酸,但乙胺本身具有細胞毒性,其沸點為16.6 ℃,氣化后對人體健康不利,對外部環(huán)境有害,因此需要特殊設備進行補料。此外,沒有完全代謝的乙胺會在胞外大量積累,限制菌體生長,弱化ATP再生,從而抑制茶氨酸的合成。為減少乙胺使用過程中的危險性,直接利用葡萄糖從頭發(fā)酵制備茶氨酸是有效的解決方案,但難點在于如何在細胞中構(gòu)建高效的乙胺合成途徑。
尚未報道微生物中存在乙胺的合成途徑。在茶樹中,乙胺主要通過丙氨酸的脫羧反應產(chǎn)生。BAI等[49]通過分析茶樹根系中氨基酸含量和不同氮源引起的基因表達差異,首次解析了CsAlaDC編碼基因。該酶與其他物種的絲氨酸脫羧酶高度同源,但對丙氨酸脫羧活性為絲氨酸脫羧活性的8~10倍。而FENG等[50]采用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)同時表達CsAlaDC和PtGS,以丙氨酸和谷氨酸為底物產(chǎn)生3.82 mmol/L的茶氨酸,進一步說明CsAlaDC可以用于茶氨酸的合成。HAGIHARA等[48]通過在大腸桿菌中構(gòu)建重組質(zhì)粒, 共表達Pseudomonassyringae來源的PsGMAS、CsAlaDC、以及B.subtilis168來源的丙酮酸脫氫酶BsAld,可實現(xiàn)從葡萄糖到茶氨酸的從頭合成途徑(圖3)。此外,敲除了內(nèi)源的GGT基因,減少茶氨酸的降解反應。重組菌株TEA6△ggt在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵48 h產(chǎn)生16.1 g/L茶氨酸,對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為13.3%。
乙醛的胺化反應是乙胺合成的另一途徑,反應效率取決于轉(zhuǎn)氨酶的活性。HAGIHARA等[48]鑒定并篩選得到了一種來源于PseudomonasputidaKT2440的轉(zhuǎn)氨酶(transaminase,PpTA8),能夠有效催化乙醛的胺化反應。通過質(zhì)粒共表達PsGMAS、BsAld、PpTA8以及內(nèi)源的乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,EutE),構(gòu)建出全新的從葡萄糖到茶氨酸的從頭合成途徑(圖3)。此外,在敲除了內(nèi)源的GGT基因后,減少茶氨酸的降解反應。重組菌株TEA4△ggt在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵48 h產(chǎn)生8.1 g/L茶氨酸,對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為5.3%。
GMAS-γ-谷氨酰甲胺合成酶;EutE-乙醛脫氫酶;PpTa8-轉(zhuǎn)氨酶;BsAld-丙氨酸脫氫酶; CsAlaDC-丙氨酸脫羧酶;gdhA-谷氨酸脫氫酶編碼基因;gltA-檸檬酸合成酶編碼基因圖3 代謝工程改造E.coli構(gòu)建茶氨酸生產(chǎn)菌Fig.3 Metabolic engineering of E.coli for theanine production
心理壓力是抑郁癥、情緒波動、免疫和年齡相關疾病、心血管疾病以及不同類型癌癥的主要原因。茶氨酸作為一種新興的食品添加劑,除了可以改善風味之外,更重要的是可以通過影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)(如γ-氨基丁酸和多巴胺)含量,緩解神經(jīng)緊張,使人產(chǎn)生輕松感。茶氨酸作為天然鎮(zhèn)靜劑、抗抑郁劑在日本、美國的市場認可度較高,已形成上百種的功能食品、飲料以及保健品。雖然我國批準茶葉茶氨酸(以茶葉為原料,經(jīng)提取、過濾、濃縮等工藝制成的茶氨酸)作為新食品原料[51],但通過植物提取法獲得的茶葉茶氨酸收率低、成本高,已無法滿足日益增長的市場需求。
健康意識的提高和緊張的生活方式使人們更加追求天然健康補充劑和添加劑,而不是合成產(chǎn)品。因此,使用生物法替代植物提取法生產(chǎn)茶氨酸是必然的趨勢。目前,我國對于生物法制備的新食品原料具有嚴格的要求。以新食品原料γ-氨基丁酸[52]為例,其生產(chǎn)工藝是以L-谷氨酸鈉為原料經(jīng)希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)發(fā)酵、加熱殺菌、冷卻、活性炭處理、過濾、加入調(diào)配輔料(淀粉)、噴霧干燥等步驟而成。其中,L.hilgardii屬于GRAS菌株,原料L-谷氨酸鈉即味精是常見的食品添加劑。因此,菌種(發(fā)酵和產(chǎn)酶菌種)、原料以及工藝的安全性是新食品原料獲批的關鍵。從生產(chǎn)技術的角度,酶催化法制備茶氨酸需要使用乙胺作為原料,而微生物發(fā)酵法能夠以葡萄糖為原料直接制備茶氨酸。因此,微生物以糖質(zhì)原料直接發(fā)酵制備的茶氨酸更有成為新食品原料的潛質(zhì),但要特別注意微生物及工藝的安全性評價[53]。目前,葡萄糖從頭發(fā)酵制備茶氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率,與流加乙胺發(fā)酵相比還有很大差距。未來需要使用合成生物學方法,平衡前體物乙胺和谷氨酸的合成代謝,弱化前體物的支路代謝,篩選更高效的乙胺和茶氨酸合成用酶,構(gòu)建高產(chǎn)茶氨酸的生物安全性微生物,推動生物法制備的茶氨酸在食品行業(yè)中的全面應用。