歐頂琴 方育

盡管機械通氣是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者的重要治療措施，但其也可能導致呼吸機相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)。VILI的病理特征是血氣屏障的破壞，滲透性增加，從而引起肺水腫、白細胞浸潤(主要是中性粒細胞)和出血，產(chǎn)生細胞因子如白細胞介素-6 (IL-6)、白細胞介素-8 (IL-8)、白細胞介素-1β(IL-1β)等和活性氧(ROS)[1]。VILI可分為氣壓傷，容量傷，肺不張傷，生物傷。高氣道壓通氣可引起肺泡破裂，氣體泄漏，導致氣壓傷(如氣胸)[2,3]。高潮氣量引起的肺泡過度膨脹導致的肺損傷稱為容量傷[2]。低肺容量通氣可通過反復開放和閉合氣道和肺單位，造成肺不張傷[2]。同時，機械通氣過程中的機械力可引起機體生物學應答，包括肺部白細胞募集(如中性粒細胞)和炎癥介質(zhì)的釋放，全身炎性反應系統(tǒng)的激活，稱為生物傷[2,3]。肺保護性通氣策略主要從氣壓傷，容量傷和肺不張傷三方面預防VILI，其小潮氣量通氣可限制肺泡過度膨脹誘發(fā)的氣壓傷和容量傷，較高的呼氣末正壓通氣(positive end expiratory pressure，PEEP)可預防低肺容量引發(fā)的肺泡反復開放閉合帶來的肺不張傷，手法肺復張(用于再次膨脹已塌陷的肺單位的過程)涉及超過約35 cm H2O氣道壓的持續(xù)應用，可以膨脹肺不張區(qū)域，使肺通氣的不均一性最小化[2]。然而，關于生物傷的發(fā)生機制尚不明確，并且其預防措施較少。現(xiàn)將從炎性反應、血氣屏障功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激等在 VILI 中的作用進展綜述如下，進一步闡明VILI生物傷的發(fā)生機制。

1 炎性反應

1.1 NF-κB信號通路 核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)家族是由RelA,RelB,RelC,NF-κB1,和NF-κB2等五名蛋白質(zhì)成員組成。NF-κB在各種細胞類型中廣泛激活,其在炎性反應過程中占據(jù)中心地位，可觸發(fā)細胞因子、促炎酶、粘附蛋白、金屬蛋白酶類、環(huán)氧合酶-2和誘導型一氧化氮合酶等調(diào)節(jié)炎性反應的因子的轉(zhuǎn)錄，參與炎性反應過程[4]。NF-κB信號通路的激活在高潮氣量機械通氣誘發(fā)的VILI疾病中扮演著重要角色。Ko等[5]研究發(fā)現(xiàn)機械通氣可顯著增加小鼠支氣管肺泡灌洗液中的總細胞數(shù)(包括中性粒細胞)，細胞因子及總蛋白濃度，而對于敲除髓系細胞IкB激酶基因的小鼠，由于抑制了下游NF-κB信號通路，上述肺損傷指標顯著下降，小鼠肺損傷減輕。Hayes等[6]通過4 h損傷性機械通氣建立了大鼠VILI動物模型，并氣管內(nèi)滴注能夠編碼IκBα蛋白的腺病毒，過表達IκBα蛋白，抑制肺部下游NF-κB的激活 ，降低了肺泡-動脈氧梯度，減少了肺泡中性粒細胞浸潤及炎癥細胞因子的產(chǎn)生，緩解了肺損傷。另有研究表明，消退素D1，α1-抗胰蛋白酶，拓撲替康等藥物可通過抑制NF-κB信號通路，減輕炎性反應，抑制高潮氣量機械通氣導致VILI[7-9]。上述研究提示NF-κB信號通路的激活可能是VILI疾病中炎性反應發(fā)生發(fā)展的關鍵原因之一。

1.2 Toll樣受體 NF-κB信號通路上游Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是啟動固有免疫應答的模式識別受體，能夠識別多種配體，例如TLR4不僅能夠識別脂多糖(LPS)等病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，也能夠識別胞質(zhì)熱休克蛋白(HSP60和70)，核蛋白高遷移率族蛋白1 (HMGB1)等損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。DAMPs介導的TLRs激活產(chǎn)生無菌炎性反應，可能是VILI重要發(fā)病機制之一[10]。Huang等[11]從高潮氣量(40 ml/kg)機械通氣4 h的大鼠支氣管肺泡灌洗液中分離得到肺泡巨噬細胞，與對照組相比，通氣組的大鼠肺泡巨噬細胞的TLR4,TLR9,Myd88和NF-κB等通路標記物的mRNA和蛋白表達水平顯著上調(diào)，而使用抗TLR4的單克隆抗體預處理，可以明顯減輕肺部炎性反應，降低細胞因子的產(chǎn)生，提示TLR4/Myd88/NFκB信號通路是VILI發(fā)生發(fā)展的重要分子機制。TLR4基因敲除小鼠也可顯著減輕高潮氣量機械通氣誘導的肺部炎癥細胞因子的釋放，減輕肺損傷[12]。Camp等[13]研究發(fā)現(xiàn)，作為一種獨特的內(nèi)源性固有免疫分子，ARDS的候選基因，尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶/前B細胞克隆增強因子(NAMPT/PBEF)能夠在缺乏細菌感染(如LPS)和輔助因子的情況下直接結(jié)合并激活TLR4，誘導NF-κB的轉(zhuǎn)錄活動和肺部炎癥損傷。利用髓樣細胞觸發(fā)受體1(TREM-1)的激動劑和拮抗劑，Wang等[14]證實TREM-1加劇小鼠VILI依賴于TLR4-MyD88-NF-κB信號通路。研究表明，LPS/VILI二次打擊可誘發(fā)小鼠中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的形成[15]。利用TLR4敲除型和野生型小鼠，Li等[16]證實NETs的形成部分依賴于TLR4。以上結(jié)果表明了TLR4在 VILI的發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用和重要樞紐地位。

1.3 NLRP3炎癥小體 Nod樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體在VILI的炎性反應中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)典NLRP3炎癥小體的活化分2步，首先，是依賴于NF-κB信號通路的NLRP3和 pro-IL-1β蛋白表達增加，再者鉀離子的外流，ROS的產(chǎn)生等第二信號可直接激活NLRP3，活化的NLRP3通過凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的caspase募集域(caspase recruitment domain,CARD)募集Pro-caspase-1形成炎癥小體，激活的caspase-1可剪切pro-IL-1β、pro-IL-18，形成IL-1β和IL-18，參與炎性反應[17]。Kuipers等[18]分析了機械通氣患者的肺泡上皮細胞和巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)機械通氣可上調(diào)NLRP3和ASC mRNA的表達。高潮氣量通氣情況下，與野生型小鼠相比， NLRP3炎癥小體缺陷型小鼠VILI得到改善。Liu等[19]通過敲低NLRP3，在體內(nèi)外實驗中證實抑制NLRP3炎癥小體，可以減輕細胞連接蛋白(p120-連環(huán)蛋白等)的降解，降低IL-1β的分泌，有效緩解VILI。NLRP3炎癥小體的激活介導了VILI的炎性損傷。抑制NLRP3炎癥小體的激活，可對VILI提供保護作用。

1.4 Wnt信號通路 生物信息學分析顯示，經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路激活參與了VILI發(fā)生發(fā)展過程。根據(jù)研究WNT/β-catenin信號通路激活參與了炎性反應過程中上皮細胞的損傷和增生，Villar等[20]通過對盲腸結(jié)扎誘導了膿毒癥的SD大鼠，分別進行低潮氣量(6 ml/kg)+10 cmH2O PEEP 或者高潮氣量(20 ml/kg)+0 cmH2O PEEP機械通氣4 h,證實了與對照組相比，高潮氣量組WNT5A，β-catenin和MMP7蛋白表達水平升高，而低潮氣量組WNT5A、β-catenin和MMP7蛋白表達水平顯著降低。提示W(wǎng)NT/β-catenin信號通路激活參與了早期VILI炎性反應過程。Ding等[21]研究證實，在盲腸結(jié)扎和高潮氣量機械通氣二次打擊小鼠肺損傷模型中，WNT1誘導分泌蛋白(WNT1 inducible secreted protein,WISP1或CCN4)和整合素β5蛋白表達水平升高，而使用抗WISP1和整合素β5的抗體預處理，可以部分減輕二次打擊小鼠的炎性反應和肺部滲透性改變。利用離體腹腔巨噬細胞的試驗表明，TLR4-MyD88-NF-κB通路激活介導了整合素β5的蛋白表達增加。重組WISP1蛋白增加了脂多糖誘導的腹腔巨噬細胞的細胞因子釋放，而沉默TLR4或整合素β5基因可抑制上述現(xiàn)象。表明WISP1-TLR4-整合素β5通路參與了小鼠二次打擊肺損傷炎性反應[21]。Xia等[22]使用12 ml/kg潮氣量對敏感A/J小鼠進行機械通氣，發(fā)現(xiàn)WISP1，ROCK1和JNK等非經(jīng)典Wnt信號通路相關蛋白表達水平增加，而ROCK1和JNK抑制劑可減輕機械通氣誘導的肺損傷，并降低非經(jīng)典Wnt信號通路相關蛋白的表達，包括WISP1。非經(jīng)典Wnt信號通路通過上調(diào)WISP1蛋白的表達參與了VILI的炎性反應過程。

2 血氣屏障功能障礙

2.1 細胞間連接 細胞間連接結(jié)構(gòu)包括緊密連接、黏附連接等。在脊椎動物中，上皮細胞層具有跨細胞屏障和細胞旁屏障特性，前者依賴于細胞頂端和基底側(cè)的細胞膜，后者依賴于細胞間的緊密連接[23]。緊密連接是控制水、離子和大分子跨細胞旁轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[24]。緊密連接復合體包括3個組成部分：跨膜蛋白(如occludin,claudins)、胞漿蛋白(如zonula occludens,ZO蛋白)、肌動蛋白細胞骨架[25]。研究表明高潮氣量機械通氣可導致大鼠緊密連接蛋白occludin表達降低，滲透性增加[26,27]。肺泡上皮細胞通過錨定在肌動蛋白上的細胞間緊密連接維持血氣屏障的完整性，機械牽拉可引起細胞骨架重構(gòu)和緊密連接結(jié)構(gòu)受損，導致上皮細胞旁屏障滲透性增加，來源于血漿的物質(zhì)外滲至肺間質(zhì)和肺泡腔，形成肺水腫。

E-鈣粘蛋白·連環(huán)蛋白(E-cadherin·catenin)復合體是胞間黏附連接的主要成分[28]。鈣粘蛋白是黏附連接的核心組分。鈣粘蛋白通過胞質(zhì)內(nèi)的連環(huán)蛋白(p120-連環(huán)蛋白(p120-catenin),β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和 α-連環(huán)蛋白(α-catenin)與微管或纖維狀肌動蛋白(F-actin)間接連接。Gu等[29]通過C57BL/6小鼠高潮氣量機械通氣實驗，證實了p120-連環(huán)蛋白在預防鈣粘蛋白的內(nèi)吞和降解，維持胞間黏附連接完整性方面具有一定作用。而周期性牽拉小鼠肺上皮細胞(MLE-12)和高潮氣量機械通氣小鼠可導致p120-連環(huán)蛋白降解。PKCα抑制劑可阻止c-Src激酶激活和p120-連環(huán)蛋白降解，c-Src激酶的抑制劑阻止了p120-連環(huán)蛋白降解，但對PKCα激活無影響。提示在VILI過程中PKCα激活c-Src激酶,進一步降解p120-連環(huán)蛋白,p120-連環(huán)蛋白的丟失可減弱細胞間黏附連接結(jié)構(gòu)，引起屏障功能障礙，滲透性增加[30]。p120-連環(huán)蛋白在周期性牽拉引起的肺泡毛細血管屏障功能障礙中具有重要的保護作用。

2.2 VEGF-VEGFR2信號通路 在LPS和高潮氣量機械通氣二次打擊小鼠肺損傷模型中，肺部浸潤的 Ly6C+high單核細胞產(chǎn)生大量血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，致使血管的通透性增加[31]。Tian等[32]證實過度周期性拉伸血管內(nèi)皮細胞可導致血管內(nèi)皮生長因子受體2·VE-鈣粘蛋白(VEGFR2·VE-cadherin)結(jié)構(gòu)在細胞連接處解偶聯(lián)，繼而VEGFR2激活，VE-cadherin磷酸化，可從以下兩個方面增加內(nèi)皮細胞的通透性：一方面，VEGF-VEGFR2通路可激活Rho依賴信號通路；另一方面，VE-cadherin蛋白磷酸化和內(nèi)吞，可減弱黏附連接結(jié)構(gòu)。其次，抑制VEGFR2可減輕周期性拉伸誘導的內(nèi)皮細胞屏障破壞。盡管VEGF被認為是一種促生存和血管生成因子，但高潮氣量機械通氣過度激活VEGFR2信號可能加重呼吸機誘導的肺部炎癥和血氣屏障功能障礙[33]。由此可推測，VEGF-VEGFR2信號通路激活同樣是VILI血氣屏障功能障礙的重要原因之一。

2.3 SIP信號通路 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一種天然存在的具有生物活性的鞘脂類，通過其5種G蛋白偶聯(lián)受體(sphingosine-1-phosphate receptors,S1PR1-5)發(fā)揮胞外作用，同時作用于細胞內(nèi)的多種靶點。在臨床前急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，S1P是一種強有力的血管生成因子，可增強肺內(nèi)皮細胞完整性，并抑制血管通透性和肺水腫[34]。S1P在細胞中的水平，依賴于鞘氨醇激酶 (sphingosine kinase,SphK) 1和2催化的合成反應與S1P磷酸酶和1-磷酸鞘氨醇裂解酶(sphingosine-1-phosphate lyase,S1PL)介導的分解代謝之間的平衡。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4 h機械通氣(30 ml/kg,0 cm H2O PEEP),小鼠肺組織中S1PL的表達增加，神經(jīng)酰胺水平上升，而 S1P水平下降，導致肺部炎癥、損傷和細胞凋亡。敲低S1PL基因的小鼠VILI減輕，敲低SphK基因的小鼠VILI加重。抑制S1PL的表達，增加細胞S1P水平，可能提供對VILI的保護作用[35]。然而，另一項小鼠二次打擊VILI研究中，機械通氣可使肺組織SphK蛋白表達水平上調(diào)和S1P水平升高，并與嚴重肺損傷有關[36]。進一步探究SIP信號通路在VILI滲透性增加中的作用，有助于闡明VILI的發(fā)病機制。

3 肺表面活性物質(zhì)功能障礙

肺表面活性物質(zhì)是一種主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞合成和分泌的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的混合物，其中脂質(zhì)成分約占90%，脂質(zhì)成分中>60%是二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)，表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白(SP)約占10%。肺表面活性物質(zhì)的主要功能是降低肺泡表面張力，減少肺泡回縮力。肺表面活性物質(zhì)在肺泡內(nèi)液-氣界面的密度可隨肺泡半徑的變小而變大，半徑增大而減小。呼氣時肺泡縮小，表面活性物質(zhì)密度變大，降低表面張力的能力增強，此時肺泡表面張力減小，從而防止呼氣時肺泡發(fā)生萎陷；吸氣時肺泡擴大，表面活性物質(zhì)的密度變小，此時肺泡表面張力增大，從而防止吸氣時肺泡過度膨脹。因此，肺表面活性物質(zhì)可以維持肺泡的穩(wěn)定性。VILI發(fā)生時，血氣屏障破壞，滲透性增加，這使來源于血漿的物質(zhì)滲漏到肺間質(zhì)和肺泡腔中，其中的血漿蛋白可滅活肺表面活性物質(zhì)，增加肺泡表面張力，導致肺泡和小氣道塌陷。肺泡喪失了原有穩(wěn)定性，可導致體積縮小肺泡體積越來越小，體積擴大肺泡體積越來越大，共同增加機械通氣引起的組織壓力，進一步損害上皮和內(nèi)皮屏障[37]。

其次，機械通氣可能導致內(nèi)源性表面活性物質(zhì)系統(tǒng)的損傷，這是機械通氣導致急性肺損傷進展的機制之一。從高潮氣量通氣VILI大鼠模型中分離出板層小體，發(fā)現(xiàn)板層小體數(shù)量及其內(nèi)表面活性物質(zhì)降低表面張力能力受損。其原因可能是分泌增加導致板層小體的耗竭，而這種耗竭不能通過已受損的肺組織重新合成表面活性物質(zhì)得到補償，導致了表面活性物質(zhì)系統(tǒng)受損[38]。肺表面活性物質(zhì)功能障礙參與了VILI的病理過程。維護肺表面活性物質(zhì)的正常功能，可為VILI的預防和治療提供新思路。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成工廠。應激狀態(tài)下，機體蛋白合成需求增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊或未折疊蛋白積累，這種機制稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)，旨在恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。然而，UPR的長時間激活會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[39]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過調(diào)節(jié)炎性反應與多種疾病相關。研究表明持續(xù)性拉伸上皮細胞和損傷性機械通氣大鼠，可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整合應激反應(integrated stress response,ISR)，導致肺泡通透性增加，炎癥應答和細胞死亡。而應用ISR上游關鍵分子蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的化學抑制劑，可顯著減少損傷信號，改善血氣屏障功能[40]。后續(xù)研究證明拉伸誘導的上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+是PERK的激活劑，PERK是上皮細胞拉伸信號的傳遞者，PERK介導的ISR是VILI/ARDS的重要病理機制[41]。另一項研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可通過IRE1α-TRAF2-NF-κB通路參與小鼠VILI的發(fā)生[42]。Xiaoli Ge等證實硫化氫可以通過PERK/eIF2α/ATF4/GADD34信號通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，緩解VILI[43]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是VILI發(fā)生發(fā)展的分子機制之一，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，可提供肺保護作用。

5 氧化應激與抗氧化

機械通氣可導致機體活性氧(ROS)失控，水平升高[44]，可損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并激活線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)，導致線粒體功能障礙，最終造成細胞死亡[45]。核因子E2相關因子(nuclear factor-erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是輔助超過200個抗氧化基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，介導了機體的抗氧化功能?；钚匝?ROS)大量產(chǎn)生與抗氧化功能失調(diào)是VILI發(fā)生發(fā)展的重要原因。An等[46]發(fā)現(xiàn)氧化應激通過激活NLRP3炎癥小體，促進VILI的發(fā)生發(fā)展。研究表明吸入麻醉藥七氟烷可以抑制機械通氣引起的活性氧(ROS)的大量產(chǎn)生，緩解肺損傷[44]。另有研究表明激活轉(zhuǎn)錄因子3 (activating transcription factor 3,ATF3)缺陷可導致ALI/VILI的易感性，這與Keap-1蛋白表達增加和DJ-1蛋白表達下調(diào)，介導的Nrf2蛋白降解增加，抗氧化能力下降有關[47]。Tao等[1]通過腹腔注射Nrf2誘導物紅木素(bixin)，減少了機械通氣造成的小鼠肺組織充血，出血，炎癥細胞浸潤和肺泡間隔增厚等組織學改變，炎癥應答及DNA氧化損傷。并且，在Nrf2基因缺陷型小鼠中未觀察到紅木素的保護作用，證實了紅木素可通過誘導Nrf2發(fā)揮肺保護作用。研究人員證明應用Nrf2-抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)通路的激活劑叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)，可增加機械通氣小鼠Nrf2依賴的抗氧化基因的表達，降低了高潮氣量機械通氣引起的支氣管肺泡灌洗液中總蛋白濃度和細胞因子濃度的升高，減輕了肺部炎性反應和肺水腫[48]。由此可知，維持氧化還原反應平衡的關鍵機制是上調(diào)Nrf2依賴的抗氧化基因的表達。減少ROS的產(chǎn)生，增加機體抗氧化能力，可為VILI的防治提供新思路。

6 呼吸機相關性肺損傷RNA測序

遺傳因素已成為VILI易感性和嚴重性主要研究熱點[3]。為了研究清楚機械通氣致肺損傷和肺纖維化的潛在機制，研究人員對經(jīng)歷了高潮氣量機械通氣的C57BL/6 小鼠肺組織進行了RNA測序。基因本體論(GO)分析認為刺激反應和免疫反應分別是影響炎癥和纖維化的重要因素，京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析發(fā)現(xiàn)，mTOR,JAK/STAT,cAMP信號轉(zhuǎn)導與早期炎癥有關;而TGF-β,HIF-1,TLR,NF-κB信號通路明顯參與急性肺損傷后續(xù)的肺纖維化過程。在細胞調(diào)控過程中，鑒定并富集了332種可能通過Wnt、HIF-1和TLR等信號通路調(diào)控纖維化的差異表達長鏈非編碼RNA(lncRNA)[49]。Xu等[50]也進行了類似的研究。以上研究均為進一步探索VILI的分子機制提供了新方向。

綜上所述，本文從炎性反應，血氣屏障功能障礙，肺表面活性物質(zhì)功能障礙，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，氧化應激等方面闡述了生物傷發(fā)生的部分機制。隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA的加入，將在后續(xù)研究中進一步闡明生物傷的形成過程。同時，LPS和高潮氣量機械通氣二次打擊肺損傷動物模型，可能是更接近于臨床ARDS的疾病模型，將幫助我們更好的探究VILI/ARDS的發(fā)病機制，以期為臨床上肺損傷疾病的防治提供新思路。