一種C57BL/6小鼠的dMCAO模型建立及評估*

康 敏 ，薛 慧，張 鑫

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040; 2.包頭市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦卒中是世界上第二大死亡和致殘原因[1-2]，缺血性腦卒中約占其中的69.6 %～70.8 %[3]。大腦中動脈是缺血性腦卒中主要的責(zé)任血管[4]，一直頗受關(guān)注。據(jù)報告顯示，大腦中動脈M2段閉塞發(fā)病率為4 %，但仍具有近27 %致死率和57 %致殘率[5]。而目前有效的治療手段針對該段血管及以上的作用極為有限[6-8]，M2段血管及以上對新治療手段的需求更為迫切。尋求疾病治療方法，對其機制的研究是必要的，相關(guān)動物模型的建立必不可少。

遠端大腦中動脈閉塞(Distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型是在經(jīng)顱大腦中動脈閉塞模型的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，模型的閉塞位置相當(dāng)于大腦中動脈M2段及以上[9]，為研究M2段及以上血管閉塞機制提供更為相近動物模型。同時該模型梗死核心周圍可見清晰的半暗帶；較線栓法模型梗死面積??；動物存活時間長的優(yōu)勢[9-11]，這些都為神經(jīng)保護、神經(jīng)可塑類藥物及其他新療法提供了便利。Hermann DM等[9]認為線栓法導(dǎo)致的腦損傷程度較大，有高估了神經(jīng)保護性藥物療效的可能。Candelario-Jalil E等[12]指出老年嚙齒動物的dMCAO模型較管腔內(nèi)閉塞模型有更高存活率，有利于老年和共病動物的缺血性腦卒中研究。Zuo XL等[13]指出dMCAO模型誘導(dǎo)的缺血性腦卒中導(dǎo)致與原發(fā)性病變有突觸連接的非缺血性遠程腦區(qū)的神經(jīng)病理損害,可能為缺血性腦卒中提供新的治療思路。較線栓法模型，dMCAO模型擁有不可替代的優(yōu)勢，但線栓法模型運用卻遠大于dMCAO模型。

大腦中動脈遠端血管變異大，限制dMCAO模型的運用[9]。而相較于大鼠，小鼠制備模型時手術(shù)視野更狹小，而為了減少損傷，術(shù)中只暴露部分大腦中動脈，使得判斷大腦中動脈走形及選擇閉塞部位極為困難。Kuraoka M等[14]采用單次電凝中動脈皮層支，制備模型，但考慮到中動脈走形多變，該方案具有一定的局限性。Llovera G等[15]采用了中動脈遠端三只血管同時電凝，制備dMCAO模型，但制模法對儀器及人員要求高，操作中損傷腦組織和感染的風(fēng)險增大。本文結(jié)合上述方案及本實驗室提供小鼠血管實際走形對制模策略進行調(diào)整，并考慮到C57BL/6小鼠用途廣且對基因相關(guān)研究有所幫助的特點[16]，以C57BL/6小鼠采用雙電凝一側(cè)大腦中動脈遠端同時結(jié)扎同側(cè)頸總動脈的策略，制備dMCAO模型，并對模型進行評估。本文提供C57BL/6小鼠大腦中動脈在顳骨區(qū)實際走形的圖像，并同時指出針對該走形血管實施具體閉塞部位，方便操作者正確識別大腦中動脈，直觀指出本次實驗閉塞中動脈的具體位置，提高該模型在后續(xù)運用的可操作性，旨在完善和推廣dMCAO模型。

1 材料與方法

1.1實驗材料 解剖顯微鏡，顯微手術(shù)器械，激光微循環(huán)血流成像儀(PeriCam PSI，瑞典PERIMED AB公司)，大小鼠轉(zhuǎn)棒儀(ZX-RDM，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，大小鼠顱骨鉆，電凝筆，2 %TTC，10 %水合氯醛等。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物 8～10周齡的雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～24 g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)動物研究中心，許可證號SCXK(蒙)2016-0001。飼養(yǎng)于明暗交替室內(nèi)環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧喂養(yǎng)，進食水自由。

1.2.2實驗分組 54只8～10周齡的雄性C57BL/6小鼠，隨機數(shù)字表法分為正常組6只，假手術(shù)組6只，dMCAO模型組42只。模型組由于每日制模有限，4組分4 d完成，4組分別為13只、10只、11只、8只，組間同環(huán)境生長，組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3制備dMCAO小鼠模型 小鼠腹腔注射10 %水合氯醛(0.03～0.035 mL/10g)麻醉，翻正反射(復(fù)位反射)消失后，固定消毒小鼠，于頸部正中切口，鈍性分離出左側(cè)頸總動脈，并用6～0縫合線永久結(jié)扎，縫合。將小鼠右側(cè)臥位固定，消毒，沿耳屏與左眼外眥連線垂直方向切口，鈍性分離顳肌上部脫離骨緣，使用顱錐轉(zhuǎn)磨顳骨，暴露大腦中動脈(位置顳骨偏向顱底部)，電凝中動脈，中動脈若無復(fù)流，縫合，待小鼠完全蘇醒后，放入鼠籠。假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總動脈，并不結(jié)扎，只將顱骨鉆孔，暴露大腦中動脈，但并不燒灼此動脈，余步驟同前。正常組不做處理。造模排除標(biāo)準(zhǔn)：制模過程中出血過多或出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血；制模時間>30 min；兩次嘗試電凝后仍有大腦中動脈皮層支的復(fù)流。

1.2.4TTC染色 術(shù)后7 d小鼠麻醉取腦，連續(xù)切取6個冠狀腦片(每片1 mm)，置于2 % TTC中，避光37 ℃孵育20 min。取出腦片置于4 %多聚甲醛避光固定24 h，拍照，用Image-J軟件進行圖像分析。如果無梗死，梗死體積占比計作0 %；如果存在梗死，總梗死體積=總梗死面積×腦片的厚度，梗死體積百分比( %)={[總梗死體積-(梗死側(cè)半球體積-梗死對側(cè)半球體積)]/梗死對側(cè)半球體積}×100 %。

1.2.5激光微循環(huán)血流成像儀 造模7 d后小鼠取腦做TTC染色前，予激光微循環(huán)血流成像儀記錄腦血流。麻醉固定消毒小鼠，在頂葉中線處的縱向切口，暴露顱骨。探頭在距顱骨表面10 cm處獲取圖像。使用PimSoft 1.3計算分析兩側(cè)半球腦血流。梗死側(cè)腦血流降低百分比(%)=(梗死對側(cè)腦血流平均ROI-梗死側(cè)半球平均ROI)/梗死對側(cè)腦血流平均ROI。

1.2.6轉(zhuǎn)棒實驗 各組小鼠于造模前以25 r/min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練3 d，入組標(biāo)準(zhǔn)：在速度為4 r/min 的轉(zhuǎn)棒上，60 s不掉落可入組。各組小鼠分別于造模后3 d和7 d行轉(zhuǎn)棒實驗。將小鼠置于轉(zhuǎn)速為25 r/min的轉(zhuǎn)桿上，記錄400 s內(nèi)小鼠在棒時間，若有小鼠超出時間未掉落按照400 s計數(shù)，每只小鼠重復(fù)3次，兩次之間預(yù)休息5 min，3次求均值。

2 結(jié)果

2.1C57BL/6小鼠大腦中動脈鏡下走形及分布 圖1箭頭所指的血管即為C57BL/6小鼠大腦中動脈皮層分支經(jīng)顱骨鉆磨骨后在小鼠顱骨顳骨區(qū)可見部分。本實驗選擇的電凝位置即為箭頭所指目標(biāo)血管階段。見圖1。

圖1 顯微鏡下顱骨轉(zhuǎn)磨后中動脈實際走形和電凝位置

2.2dMCAO小鼠模型造模存活率及造模成功率 造模后3 d和7 d，正常組與假手術(shù)組3 d和7 d均無小鼠死亡，dMCAO模型組分4組制模，4組小鼠同環(huán)境生長，組間小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，同組均在一天內(nèi)完成造模，3 d和7 d存活小鼠分別為13/11/10，10/8/8，11/9/9，8/7/6。其3 d和7 d平均存活率分別為83.35 %，78.43 %，本次實驗對隨機選取(9只)造模7 d小鼠進行麻醉取腦，行TTC染色，排除3 d梗死面積過小的小鼠，不符合后續(xù)實驗關(guān)于梗死體積同質(zhì)性的要求，計算其造模成功率為66.7 %。

2.3dMCAO模型小鼠出現(xiàn)明顯的腦梗死病灶 TTC染色后，正常組腦片呈紅色且雙側(cè)對稱，梗死腦區(qū)呈白色。正常組和假手術(shù)組腦組織兩側(cè)顯色對稱，未見明顯的梗死灶，而dMCAO模型組在右側(cè)近皮質(zhì)區(qū)成白色與對側(cè)同區(qū)域相比顯色不同，為梗死區(qū)域(白色)。軟件測量腦片梗死面積，公式計算梗死體積，結(jié)果顯示正常組和假手術(shù)組梗死體積占比0 %，dMCAO模型組(n=6)梗死體積百分比為(18.22±0.89)%，95 %可信區(qū)間(17.28,19.15)%。見圖2、表1。

表1 三組小鼠梗死體積占比

圖2 三組小鼠TTC染色后腦組織情況示意圖

2.4dMCAO模型小鼠腦血流明顯下降 造模7 d行TTC染色之前，小鼠麻醉，通過激光微循環(huán)血流成像儀記錄腦血流量，紅色區(qū)表示正常腦血流成像，黃色綠色區(qū)表示缺血區(qū)域成像。正常組與假手術(shù)組探測兩側(cè)腦血流成像均成紅色，基本保持對稱，dMCAO模型組左側(cè)腦半球呈黃色及綠色，與對側(cè)血供正常區(qū)域明顯不同。梗死側(cè)腦血流較對側(cè)降低(53.85±1.22)%，95 %可信區(qū)間(52.57,55.13)%。見圖3。

圖3 三組小鼠通過激光微循環(huán)血流成像儀顯示兩側(cè)半球腦血流情況注：A代表各組的兩側(cè)腦部血流供應(yīng)示意圖；B表示各組小鼠實時監(jiān)測腦血流形成的波形圖，ROI即為腦血流量值。C為三組小鼠(6只)操作側(cè)較對側(cè)腦血流降低百分比，與正常組及假手術(shù)組比較*P<0.05

2.5dMCAO模型小鼠運動協(xié)調(diào)能力明顯降低 實驗小鼠全部符合入組標(biāo)準(zhǔn)，各組6只，分別于造模3 d和7 d后記錄在棒時間，dMCAO模型組較假手術(shù)組在3 d和7 d在棒時間均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；假手術(shù)組較正常組在造模3 d和7 d時在棒時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 三組小鼠轉(zhuǎn)棒實驗在棒時間情況

3 討論

1981年Tamura A等[17-18]首次提出大鼠開顱電凝閉塞大腦中動脈制備缺血性腦卒中模型。此后這種經(jīng)顱中動脈閉塞模型不斷完善，遠端大腦中動脈閉塞模型就是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來。

電凝法建立dMCAO模型的難點即為中動脈走形的變異大，電凝位置上選取困難。Majid A等[19]、Kuraoka M等[14]采用單電凝法制備模型，但是實際操作中只能暴露部分中動脈的情況，針對一個存在變異的血管判斷走形，嘗試閉塞住該段血管，依然有難度；Llovera G等[15]對大腦中動脈三只血管進行電凝制備模型，梗死24 h體積占比12 %左右，7 d梗死體積占比接近15 %左右，但是孔德蓮等[20]同樣的策略制備模型，得到結(jié)果梗死體積占比32 %左右，數(shù)據(jù)差異除了小鼠的血管側(cè)支循環(huán)存在及小鼠的個體差異，人為的操作因素已經(jīng)不能被忽視，事實上，小鼠腦體積小，對腦組織過多的電凝，暴露的腦部面積大，對儀器精度及人員要求高，操作的難度增加。本實驗采用大腦中動脈雙電凝同時結(jié)扎同側(cè)頸總動脈方案，梗死體積占比(18.22±0.89) %，與Llovera G等提出梗死體積占比接近，但由于減少了對腦部本身的操作，操作難度減小。人類發(fā)生缺血性腦卒中后梗死體積占比絕大多數(shù)在5 %～15 %左右[21]，該策略制備模型很接近這一范圍，而線栓法制備模型，梗死體積更偏向大面積缺血性腦卒中[15]，大面積缺血性腦卒中僅占缺血性腦卒中的7.6 %[22]。有3只梗死灶面積過小，考慮可能與小鼠側(cè)支循環(huán)建立有關(guān)。目前評估活體梗死體積，常用核磁、PET-CT及激光微循環(huán)血流成像儀等，實驗中TTC染色6只可見清晰梗死灶的小鼠激光微循環(huán)血流成像儀均可見梗死側(cè)血流明顯降低，較對側(cè)血流降低了(53.85±1.22) %。說明激光微循環(huán)血流成像儀可以用于評估該模型梗死灶，TTC染色提示梗死體積過小的3只小鼠，梗死側(cè)血流降低百分比在15 %～35 %之間。

本研究在造模過程中，發(fā)現(xiàn)如下造模注意事項：(1)鈍性分離頸總動脈時切勿損傷迷走神經(jīng)及頸靜脈。(2)造模過程可涂抹眼膏保護小鼠眼睛。(3)小鼠注射麻藥根據(jù)體質(zhì)量注意用量。(4)分離顳肌及轉(zhuǎn)磨顱骨時勿傷及顳淺靜脈。(5)盡管多數(shù)文獻提及小鼠顱骨下可見中動脈，但是實際情況可能被骨質(zhì)內(nèi)的血管干擾，需轉(zhuǎn)薄顱骨后再確定血管走形。(6)轉(zhuǎn)磨顱骨時需要滴加生理鹽水，降低顱骨表面溫度。(7)麻醉狀態(tài)的小鼠注意保溫，清醒后小鼠處于過高的溫度可能導(dǎo)致后期小鼠死亡。

dMCAO模型針對缺血性腦卒中的研究有著不可替代的優(yōu)勢，但由于中動脈走形變異大，盡管有文獻對這段血管閉塞位置進行了大致描述，但我們針對該段血管實際走形了解依然不足，具體情況仍然需要具體的策略。本次實驗根據(jù)實際血管走形對已有的閉塞策略進行調(diào)整，嘗試制備dMCAO模型，并通過評估，該方案可以制備相對穩(wěn)定可靠的dMCAO模型，為實際制備dMCAO模型選取合適閉塞血管提供參照。并對操作中的注意事項進行總結(jié)，提高dMCAO模型可操作性，對完善和推廣dMCAO模型有所幫助。