豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型與弓形蟲(chóng)混合感染的診斷與預(yù)防

吳曉曉，萬(wàn)新軍，俞進(jìn)，段真真，賈毅飛，何宗霖

（1.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆 阿克蘇 843000；2.阿克蘇地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心，新疆 阿克蘇 843000）

豬肉肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是日常生活中最為常見(jiàn)且重要的優(yōu)質(zhì)肉源。發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)不僅能有效保障肉食品的供應(yīng)，也可為農(nóng)民提供一條致富增收的途徑，從而推動(dòng)鄉(xiāng)村振興發(fā)展。目前，養(yǎng)豬業(yè)已成為了我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的一大支柱產(chǎn)業(yè)，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展不可或缺的一部分。近些年，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)由原來(lái)傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式逐漸向規(guī)?；⒓s化的現(xiàn)代養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變與發(fā)展，生豬的生產(chǎn)性能得到了快速的提高，但生豬疫病的種類及暴發(fā)頻率也逐漸增加，疫病混合感染已成為規(guī)?；i場(chǎng)疫病防控的一大難題。豬繁殖與呼吸綜合征是一種急性高接觸性傳染病，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是生豬養(yǎng)殖中最為常見(jiàn)的疾病。豬圓環(huán)病毒病是一種免疫抑制性傳染病，主要損害生豬免疫系統(tǒng)，造成其生產(chǎn)性能下降，易引發(fā)仔豬死亡，通常與豬呼吸與繁殖綜合征混合感染，兩種病原體在生豬體內(nèi)能相互促進(jìn)復(fù)制，從而降低了生豬的抗病能力，出現(xiàn)誘發(fā)繼發(fā)性感染，如感染弓形蟲(chóng)病、口蹄疫及豬流感等疫病，最終加大治愈難度和誘發(fā)更高的死亡率，給養(yǎng)豬場(chǎng)造成極大的危害。

1 流行病學(xué)

1.1 病原體

豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約為15 kb，有囊膜；病毒粒子呈圓形，直徑大小為50~60 nm；核衣殼的結(jié)構(gòu)為對(duì)稱的20面體，直徑為25~30 nm[1]。該病毒分為歐洲型和美洲型，兩種基因的同源性不超過(guò)60%，而氨基酸同源性78%~81%，在我國(guó)主要流行的是美洲型。該病毒對(duì)高溫較為敏感，56℃條件下加熱45 min便會(huì)完全失活，室溫及37℃以下均不能存活；該病毒最適生存pH值為5~7，其感染力最強(qiáng)[2]。另外，該病毒對(duì)常見(jiàn)的消毒劑敏感，低劑量的乙醚和氯仿便可將其殺死消滅。

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種是單股負(fù)鏈DNA病毒，基因組大小為1 758~2 001 bp，無(wú)囊膜；病毒粒子呈圓形，直徑為14~25 nm，核衣殼結(jié)構(gòu)為20面體，是已知的最小動(dòng)物病毒之一[3]。該病毒具有4種基因型，豬圓環(huán)病毒2型為其中致病性最強(qiáng)的類型，于19世紀(jì)90年代末在南美洲發(fā)現(xiàn)。該病毒可在豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中增殖，損害生豬的免疫系統(tǒng)，通常會(huì)引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征及繁殖障礙性疾病[3]。該病毒對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)乙醚和氯仿的敏感性較低，常見(jiàn)的消毒劑不易將其殺死。

弓形蟲(chóng)屬于球蟲(chóng)綱球蟲(chóng)目孢子蟲(chóng)科，體長(zhǎng)4~10 μm，是一種廣泛寄生在人和動(dòng)物體內(nèi)有核細(xì)胞內(nèi)的寄生性原蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)的生殖包含有性生殖和無(wú)性生殖，其生活史包括5個(gè)階段，第一階段為滋養(yǎng)體期，滋養(yǎng)體在有核細(xì)胞內(nèi)快速分裂并占據(jù)宿主的細(xì)胞漿，形成假包囊；第二階段為緩殖子期，弓形蟲(chóng)在囊壁內(nèi)緩慢增殖形成包囊；第三階段為裂殖體期，緩殖子在動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)裂體增殖，形成裂殖子；第四階段為配子體期，配子受精形成合子，發(fā)育成卵囊；第五階段為子孢子期，卵囊內(nèi)的孢子體發(fā)育繁殖，形成2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊分化成4個(gè)子孢子。處于不同的發(fā)育階段，呈現(xiàn)不同的形態(tài)，其滋養(yǎng)體和包囊均可使中間宿主和終末宿主感染發(fā)病[4]。

1.2 傳播途徑

豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒病主要通過(guò)消化道和呼吸道進(jìn)行傳播。病豬和帶毒豬為直接傳染源，其排出的糞便、尿液及唾液等分泌物中含有大量的病毒，健康豬只通過(guò)接觸污染的飼料、飲用水、飼養(yǎng)工具、墊草及空氣均會(huì)感染。同時(shí)，該病毒還可通過(guò)受精及胎盤進(jìn)行傳播。此外，該病毒還可以通過(guò)蚊蟲(chóng)、蒼蠅、蜱蟲(chóng)等進(jìn)行傳播。弓形蟲(chóng)病主要是由于生豬食入含有蟲(chóng)體的飼料或者飲用了含有生肉屑的泔水而發(fā)生感染。

1.3 流行特點(diǎn)

任何品種、任何年齡及任何性別的豬均可感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒，1月齡的仔豬及妊娠母豬感染率最高；該病呈地方流行性，往往急性發(fā)病，沒(méi)有明顯的季節(jié)性，但在蚊蠅滋生的季節(jié)發(fā)病率會(huì)更高。豬圓環(huán)病毒病各品種和各年齡的生豬均會(huì)感染，且6~12周齡的生豬最易感染；該病全年均會(huì)發(fā)生，但多發(fā)于夏季及秋季。豬弓形蟲(chóng)病任何品種和年齡的生豬均會(huì)感染，其中3~6周齡的仔豬和妊娠母豬發(fā)病率最高，而成年豬多呈隱形感染；該病主要發(fā)生在夏秋季節(jié)。通常情況下以上3種病原體均不易侵入生豬機(jī)體，但如果飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生較差、斷奶應(yīng)激或天氣驟變就會(huì)引發(fā)感染。

2 臨床癥狀

感染豬繁殖與呼吸綜合征的病豬主要表現(xiàn)為精神萎靡，食欲減退，發(fā)熱，咳嗽氣喘，呼吸困難。妊娠母豬出現(xiàn)體溫升高，食欲下降，精神不振，呼吸困難，流產(chǎn)、早產(chǎn)或產(chǎn)下死胎、弱胎，產(chǎn)后無(wú)乳，胎衣不下，以及產(chǎn)道分泌物增多，以后發(fā)情不正常，甚至出現(xiàn)繁殖障礙；產(chǎn)下的仔豬孱弱、發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉嚴(yán)重，死亡率高達(dá)80%，而耐過(guò)仔豬多數(shù)會(huì)成為僵豬；種公豬配種能力下降，精子帶毒，且其數(shù)量減少、質(zhì)量下降，甚至出現(xiàn)畸形；育肥豬出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，站立不穩(wěn)，被毛粗亂，其耳部、尾部及腹部的皮膚發(fā)紺，有的會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎。

感染豬圓環(huán)病毒2型的病豬主要表現(xiàn)為食欲不振，精神萎靡，嗜睡，吻突干燥，流涕咳嗽，持續(xù)腹瀉，機(jī)體消瘦，四肢呈暗紅色，出現(xiàn)“接地紅”現(xiàn)象。

感染弓形蟲(chóng)病的病豬主要表現(xiàn)為體溫升高至41℃以上，典型的腹式呼吸，呼吸急促，采食量下降，被毛雜亂無(wú)光澤，皮膚呈紫紅色的斑點(diǎn)或者紅色小點(diǎn)，鼻腔流出泡沫樣鼻涕，排出帶血糞便，后軀無(wú)力，臥地不起。

以上3種疫病混合感染后主要表現(xiàn)為精神不振，厭食至食欲廢絕，發(fā)熱，腹式呼吸且呼吸困難，咳嗽氣喘，嗜睡，被毛粗亂，四肢無(wú)力，站立不穩(wěn)，流產(chǎn)，早產(chǎn)或產(chǎn)死胎、弱胎，繁殖功能下降，耳部、尾部及四肢皮膚呈紫紅色發(fā)紺，腹部出現(xiàn)紅斑，混合感染會(huì)增加治療難度，死亡率可高達(dá)85%~100%。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

目前，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型病毒和弓形蟲(chóng)常采用血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法進(jìn)行確診，其中血清學(xué)診斷方法主要包括免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)的原理是通過(guò)將抗原吸附在固相載體上，加入被檢樣品形成抗原抗體的復(fù)合物，然后再加入酶標(biāo)記的抗抗體，底物參與下顯色，并通過(guò)顯微鏡判斷結(jié)果。該方法的操作步驟如下：首先在無(wú)菌條件下采集病豬的血液，分離獲得血清，保證血清透明無(wú)污染不溶血，將血清依次按四倍比例稀釋，做好對(duì)照，然后分別取稀釋血清各50 μL加入固定診斷板中，封板，37℃孵育1 h后倒去板中液體，用洗板液清洗3次，每次清洗1~3 min，之后倒置吸附紙上吸干水分；隨后每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬抗抗體50 μL，封板后37℃放置感作1 h；倒去板中液體，按上述的洗滌方法清洗3次，吸干水分；每孔再加入氨乙基咔唑50 μL，封板避光放置18~24℃條件下感作30 min，顯微鏡下觀察，若孔內(nèi)30%~50%的細(xì)胞間質(zhì)為深紅色，則說(shuō)明感染了豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該方法存在一定的主觀性，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陰性，不是特別適合大規(guī)模的檢測(cè)應(yīng)用。

間接免疫熒光試驗(yàn)的原理是通過(guò)將抗原吸附在固相上，加入被檢細(xì)胞孵育結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，再加入偶聯(lián)有熒光素分子的抗抗體，與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察。具體操作步驟如下：無(wú)菌條件下采集病豬血液，分離血清，稀釋，加入固定板中，加入配好的固定液，室溫孵育10 min，棄液，用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，再添加封閉液37℃靜置1 h；再用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，用濾紙吸取多余的水分，隨后加入熒光標(biāo)記的兔抗豬抗體溶液，使其完全覆蓋樣本，放置搪瓷盒中37℃保溫處理30 min；再用磷酸緩沖液清洗2次，每次5 min，吸去多余水分，但樣本保持一定的濕度，滴入甘油，放置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷陽(yáng)性。該方法需要專業(yè)的檢測(cè)人員，且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，但具有較好的特異性和敏感性，目前在臨床上也較為常用。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理是通過(guò)用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原的待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在即可與包被在固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為預(yù)測(cè)抗原的量。具體步驟如下：首先無(wú)菌條件下采集病豬血液，分離血清，4℃保存待檢；再用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度，每孔加入200 μL，4℃過(guò)夜；再用磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，去除包被液，拋干；隨后取病豬血清，稀釋，加至孔中，37℃孵育1 h；再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，拋干；隨后加入200 μL酶標(biāo)抗體，37℃作用1~2 h（具體時(shí)間需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定）；再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，拋干；加入200 μL底物溶液，室溫作用30 min，再加入2 mol·L-1檸檬酸50 μL以終止反應(yīng)；最后用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。該方法的靈敏性和特異性高，操作簡(jiǎn)單且快速，不要求特殊設(shè)備，成本較低，適合大范圍大批量的樣品檢測(cè)，是目前使用最為廣泛的方法之一。

分子生物學(xué)診斷方法是通過(guò)PCR手段進(jìn)行檢測(cè)，主要包括RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）。RT-PCR具體操作步驟如下：首先根據(jù)Gen-Bank中公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型病毒和弓形蟲(chóng)的開(kāi)放閱讀框基因序列設(shè)計(jì)引物，然后根據(jù)相應(yīng)的DNA提取試劑盒提取總RNA，隨后構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系，50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，再取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增目的片段，得到相應(yīng)片段說(shuō)明感染該病原體。qPCR是在RT-PCR的基礎(chǔ)上，通過(guò)增加熒光探針，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定病毒感染量的大小。具體步驟如下：首先引物的設(shè)計(jì)和總RNA的提取過(guò)程和RT-PCR是一致的；然后根據(jù)相應(yīng)試劑盒構(gòu)建qPCR反應(yīng)體系，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性10 s；95℃退火5 s，60℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)。以C值≤35并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性。與其他方法比，該方法具有檢測(cè)組織多樣化、檢測(cè)速度快、靈敏度和特異性最高等特點(diǎn)，同時(shí)還能區(qū)分高致病毒株和野生型毒株，也是目前使用最為廣泛的方法之一。

此外，弓形蟲(chóng)的診斷還可以通過(guò)姬姆薩染色法。取病死豬肺部組織或淋巴結(jié)進(jìn)行涂片，通過(guò)姬姆薩染色，可觀察滋養(yǎng)體的形狀多樣，呈半月形、梨形或梭形，其一端略鈍，一端略尖，其核處于中央或者略微偏向鈍端，且被染成深藍(lán)色，則可確定感染弓形蟲(chóng)[4]。該方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，非常適合檢測(cè)急性弓形蟲(chóng)的感染；但該方法對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)要求較高，且發(fā)病豬如果采取了藥物治療，其體內(nèi)的弓形蟲(chóng)數(shù)量會(huì)減少，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有一定的影響。

4 預(yù)防措施

第一，重視豬舍消毒及衛(wèi)生管理工作；及時(shí)清理欄舍糞污，定期對(duì)欄舍內(nèi)外和飼養(yǎng)工具進(jìn)行徹底的清洗及消毒，并做好防蟲(chóng)鼠、飛鳥(niǎo)措施，避免蟲(chóng)鼠滋生及隨意出入欄舍；同時(shí)欄舍需全封閉式管理，禁止外來(lái)人員及車輛進(jìn)出。第二，提供干燥、舒適的飼養(yǎng)環(huán)境；定期檢修水電氣設(shè)備，保障適宜的溫度、濕度，控制飼養(yǎng)密度，保證通風(fēng)效果良好。第三，均衡營(yíng)養(yǎng)，合理飼喂；做好飼料管理，合理搭配飼料，定時(shí)定點(diǎn)飼喂，提供干凈、充足的飲水。第四，強(qiáng)化檢疫工作，及時(shí)進(jìn)行疫苗免疫；養(yǎng)殖過(guò)程中需實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬群健康動(dòng)態(tài)并做好記錄，根據(jù)當(dāng)?shù)匾卟×餍刑攸c(diǎn)及時(shí)制定并實(shí)施疫苗免疫，另外，對(duì)病豬及時(shí)隔離處理，必要時(shí)撲殺并無(wú)害化處理。