張金磊,邢麗杰,羅瑞峰,張 飛,陳永發(fā),鞏婧婷,賀玉鳳
(新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心,新疆石河子 832000)
隨著人們生活水平的提高,雞蛋作為日常膳食中蛋白質(zhì)主要來(lái)源,越來(lái)越有著不可替代的作用[1]。甲硝唑是人工合成硝基咪唑類藥物,對(duì)家禽的滴蟲(chóng)病感染、腸道的厭氧菌感染、生殖系統(tǒng)疾病等有著很好的療效[2-3]。因而常作為驅(qū)蟲(chóng)藥添加在飼料中,并且可用于改善飼料轉(zhuǎn)化率。如果養(yǎng)殖過(guò)程中用藥不規(guī)范,沒(méi)有遵守休藥期,甲硝唑加入飼料中,容易造成動(dòng)物源性食品中甲硝唑的殘留[4]。然而甲硝唑?qū)θ梭w有多種毒副作用,尤其具有潛在致癌性和致遺傳變異作用[5-6],且甲硝唑進(jìn)入人體后能快速分布于全身,因此對(duì)雞蛋中甲硝唑的殘留檢驗(yàn)非常必要。
歐盟在1998 年規(guī)定甲硝唑在食品動(dòng)物體中不得檢出,在2019 年,我國(guó)發(fā)布的GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定,甲硝唑藥物允許作為治療動(dòng)物疾病使用,并且在動(dòng)物源性食品中不得檢出[7]。目前,甲硝唑殘留檢測(cè)的方法主要包括液相色譜法[8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]等。但是針對(duì)動(dòng)物肌肉組織中的甲硝唑殘留檢測(cè)方法研究較多,雞蛋液體基質(zhì)比肌肉固體組織復(fù)雜?,F(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法對(duì)雞蛋中甲硝唑殘留檢測(cè)分析較少[12];同時(shí),前處理方法復(fù)雜繁瑣,不利于大批量檢測(cè)。因此,通過(guò)對(duì)雞蛋中甲硝唑的提取、凈化及流動(dòng)相組成等因素的優(yōu)化,建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)雞蛋中甲硝唑的方法,該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、快速、高效,適用于雞蛋中甲硝唑殘留的篩查和測(cè)定。
甲醇、乙腈、甲酸(HPLC 級(jí)),德國(guó)CNW 公司提供;甲硝唑(純度大于99.0%),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司提供;超純水;雞蛋,購(gòu)自當(dāng)?shù)夭煌?、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和生產(chǎn)基地,去殼,經(jīng)勻漿(10 000 r/min)后,置于-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
Agilent 1200+6460 型高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品;MS3 basic 型漩渦混合器,德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品;Sigma 3-30k 型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;KQ-600DE 型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品;IQ7000 型超純水儀,美國(guó)Milli-Q 公司產(chǎn)品。
色譜條件:ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus(3.0 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱,色譜柱溫度30 ℃,流動(dòng)相組成:水-甲醇(梯度),進(jìn)樣量5 μL,流速0.6 mL/min,梯度洗脫。
以水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
表1 以水-甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫程序
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓4 000 V,干燥氣溫度325 ℃,干燥氣流速10 L/min,鞘氣溫度350 ℃,鞘氣流速12 L/min。
甲硝唑的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
表2 甲硝唑的質(zhì)譜參數(shù)
稱取經(jīng)勻漿后的雞蛋2.00 g(精確至0.01 g)于50 mL 離心管中,加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL,渦旋振蕩混勻1 min,30 ℃下恒溫超聲提取30 min;以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心5 min,取上清液5 mL 直接加入到PRiME HLB 固相萃取小柱上,無(wú)需活化,控制流速在3~4 mL/min,收集全部流出液。于40 ℃下氮吹至近干,用0.1%甲酸水+甲醇(90+10)溶液定容至2 mL,渦旋混勻后過(guò)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜,供HPLC-MS/MS 法測(cè)定。
準(zhǔn)確稱取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品25 mg,用甲醇溶于25 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,置于-20 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取0.025 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL 容量瓶中,用甲醇定容,配置成1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,用基質(zhì)空白溶液將中間液逐級(jí)稀釋,配制成2,4,10,20,30,40 ng/mL的甲硝唑系列工作溶液,用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,供高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。
2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下,對(duì)100 ng/mL甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液多次注射進(jìn)樣,通過(guò)對(duì)鞘氣溫度、鞘氣流速,毛細(xì)管電壓、碰撞電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、豐度高和干擾小的2 個(gè)碎片離子作為甲硝唑定量離子和定性離子,并以豐度最強(qiáng)、響應(yīng)值最高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。
甲硝唑的MRM 離子對(duì)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 甲硝唑的MRM 離子對(duì)質(zhì)譜圖
2.1.2 色譜條件的優(yōu)化
通過(guò)比較水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4 種流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑響應(yīng)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)流動(dòng)相為水-甲醇體系,甲硝唑的響應(yīng)較高。因此,選用水-甲醇體系作為檢測(cè)雞蛋中甲硝唑的流動(dòng)相。
不同流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑提取效率的影響見(jiàn)圖2。
圖2 不同流動(dòng)相體系對(duì)甲硝唑提取效率的影響
甲硝唑?qū)儆谙趸溥蝾愃幬?,微溶于乙醇和水,在乙酸乙酯和乙腈中有較好的溶解性。雞蛋中有蛋白質(zhì)、脂肪、水、磷脂等物質(zhì),由于乙酸乙酯和乙腈都可以較好地提取雞蛋中的甲硝唑,但是乙酸乙酯提取的雜質(zhì)較多,且對(duì)儀器干擾較大。而乙腈作為提取溶劑,可以起到沉淀蛋白質(zhì)的作用,可通過(guò)離心去除。但是大量的脂肪和磷脂類會(huì)和目標(biāo)物一起提取出來(lái),這些物質(zhì)會(huì)干擾LC-MS 分析,污染液相系統(tǒng)。所以,試驗(yàn)選擇用PRiME HLB 小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化,PRiME HLB 小柱可有效去除提取液中大部分脂肪和磷脂類物質(zhì),從而達(dá)到凈化除雜的目的。
取6 份空白樣品,樣品經(jīng)過(guò)前處理得到空白基質(zhì),取一定量的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)中間液,用空白基質(zhì)稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?,配制成?biāo)準(zhǔn)系列工作曲線。在優(yōu)化后的前處理和儀器條件下,對(duì)一系列空白基質(zhì)中添加的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定,以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明,甲硝唑在2~40 ng/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。信噪比S/N 為3 時(shí),計(jì)算甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg,信噪比S/N為10 時(shí),計(jì)算甲硝唑的定量限為1 μg/kg。該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。
甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。
表3 甲硝唑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)
選取空白雞蛋樣品,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行3 個(gè)質(zhì)量濃度水平添加回收率試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次。
甲硝唑的回收率和精密度見(jiàn)表4。
表4 甲硝唑的回收率和精密度
雞蛋中甲硝唑的平均回收率為83.2%~104.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%~1.2%。說(shuō)明該方法回收率和精密度良好。
雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)見(jiàn)圖3,雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖見(jiàn)圖4,雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖見(jiàn)圖5。
圖3 雞蛋空白樣品添加質(zhì)量濃度為5 ng/mL 的基質(zhì)標(biāo)
圖4 雞蛋空白樣品LC-MS/MS 譜圖
圖5 雞蛋樣品中添加量為4 μg/kg 的LC-MS/MS 譜圖
在SN/T 2624—2010《動(dòng)物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法中樣品提取凈化方法繁瑣、復(fù)雜,且步驟繁多。需要用到的試劑很多,并且提取試劑用量較大,凈化過(guò)程繁雜,需要多次轉(zhuǎn)移提取液,試驗(yàn)的可操作性差、重現(xiàn)性較低、試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng),不適用于大批量檢測(cè)。試驗(yàn)試劑用量較少,固相萃取柱無(wú)需活化,大大提高了前處理速度,提高了檢測(cè)效率,適用于大批量的篩查和測(cè)定。
采用ZORBAX SB-Aq 型色譜柱分離,優(yōu)化了液相、質(zhì)譜、提取及凈化等條件,提高了雞蛋中甲硝唑的提取和凈化效率,方法學(xué)驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果良好。表明該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好,且高效、快速操作簡(jiǎn)單,適于雞蛋中甲硝唑的快速篩查和測(cè)定。