趙洋 孫慧明 林浩澎 羅娉婷 朱雅婷 陳瓊?cè)A 舒琥

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006）

中國是世界上主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展的同時(shí)也帶來了大量的水污染。水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水屬污染成分簡單的低濃度有機(jī)污水，主要污染物有氨氮、亞硝酸鹽、有機(jī)污染物等。根據(jù)2020年生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《第二次全國污染源普查公報(bào)》表明我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)每年排放的養(yǎng)殖廢水中含有氨氮 22 300 t，總氮 99 100 t，總磷 16 100 t［1］。如何安全，高效的處理這些養(yǎng)殖廢水成為目前一大難題。

生物脫氮因其具有安全、經(jīng)濟(jì)、高效等優(yōu)點(diǎn)被視為目前最有發(fā)展前景的技術(shù)之一［2］。生物脫氮的反應(yīng)類型主要有兩種，分別為硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)。傳統(tǒng)的生物脫氮如SHARON 工藝（短程硝化反硝化工藝），ANAMMOX 工藝（厭氧氨氧化工藝）等都將好氧硝化和厭氧反硝化分為相對(duì)獨(dú)立的兩步，硝化反應(yīng)速度慢，同時(shí)還要嚴(yán)格控制溫度、pH以及氮素含量的影響，增加了成本和管理難度。近年來，好氧反硝化菌因其同時(shí)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力開始受到廣泛的關(guān)注。國內(nèi)外研究者在海水沉積物，含水層介質(zhì)，土壤，水庫沉積物，養(yǎng)殖廢水等樣品中都發(fā)現(xiàn)和篩選出來多種好氧反硝化菌［3-8］。其中李文甫等［6］在養(yǎng)殖廢水分離出的假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）亞硝態(tài)氮去除率為99.10%，氨氮去除率為93.92%，朱曉明等［5］在含水層介質(zhì)分離出來的假單胞菌屬惡臭假單胞菌（Pseudomonas Putida）硝酸鹽去除率為95.3%，氨氮去除率為98.5%，證明這類菌株具有高效的脫氮作用。

目前的研究大多集中在分離鑒定和初步的脫氮性能方面，卻忽略菌株的安全性。陳軍昌等［9］發(fā)現(xiàn)僅注射1.0×106CFU/mL腐敗假單胞菌懸液5 μL便可使稚蟹3 h內(nèi)死亡。假單胞菌屬中常見的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的革蘭氏陰性條件致病菌，可引發(fā)人體呼吸道、泌尿道、皮膚軟組織及手術(shù)創(chuàng)面等多部位的急性或慢性感染［10］。菌株的生物安全性評(píng)估是把一個(gè)微生物菌株引入到另外一個(gè)環(huán)境中的非常重要環(huán)節(jié)［11］。病原微生物的引入不僅有可能破壞自然環(huán)境中原有菌群的平衡而且對(duì)人類的健康生存存在重大的安全隱患，所以對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行生物毒性和生物安全性探究至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)從養(yǎng)殖廢水和底泥中篩選出來的好氧反硝化菌進(jìn)行研究，對(duì)該菌開展形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析，通過藥敏性實(shí)驗(yàn)和生物安全性分析，探究不同反應(yīng)條件對(duì)其脫氮性能的影響，以期獲得更有利于實(shí)際應(yīng)用養(yǎng)殖尾水處理的安全高效菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 中山市民眾鎮(zhèn)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)底泥及污水中篩選出來的菌株。用甘油冷凍法保存在實(shí)驗(yàn)室，使用前富集培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，KNO31 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，pH 7.2-7.4；DM發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，檸檬酸鈉5.66 g，微量元素溶液 2 mL，NH4Cl 0.026 75 g（或NaNO30.04 g或 NaNO20.345 g），pH 7.2。微量元素溶液（g/L）：EDTA 50.0 g，ZnSO4·7H2O 2.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，F(xiàn)eSO45.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.60 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 將菌株DZ11于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。通過掃描電鏡觀察分離菌株的個(gè)體形態(tài)。生理生化特性依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》 進(jìn)行鑒定。

1.2.2 16 S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 使用上海生工有限公司購買的DNA提取試劑盒提取DZ11的DNA并以其為模板，采用細(xì)菌通用性正向引物（27F）和反向引物（1492R）進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序。獲得的序列在NCBI的 GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源性對(duì)比，并使用 MEGA 7.0 軟件采用 N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的藥敏試驗(yàn) 取在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)了18 h的菌液200 mL，均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂表面。平板放置15-20 min后，用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，并輕壓紙片，設(shè)置2個(gè)平行，置于28℃培養(yǎng)18 h。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，并做好記錄。結(jié)果判斷參照SN/T 1944-2016 《動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定—紙片擴(kuò)散法》［12-13］。

1.2.4 生物安全性檢測(cè) 選取健康并且活力好的斑馬魚（體長4±1 cm）在水中馴養(yǎng)7 d，待穩(wěn)定后將斑馬魚隨機(jī)分配到裝有15 L淡水的玻璃缸中，每個(gè)缸10尾斑馬魚，每組3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組加入菌株DZ11 并控制菌量在1×106CFU/mL。對(duì)照組僅加入淡水。將菌株DZ11在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出3 000 r/min離心5 min，用生理鹽水洗滌2次，去除培養(yǎng)基成分，用無菌淡水懸浮，通過測(cè)定的OD600根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到懸濁液的濃度，通過調(diào)節(jié)加入水中的懸濁液的量控制養(yǎng)殖水體中假單胞菌的濃度，使水體中菌量約為1×106CFU/mL。試驗(yàn)期間，斑馬魚正常飼養(yǎng)并且每3 d對(duì)缸內(nèi)水體進(jìn)行更換，換水后按上述方法重新加入菌株，持續(xù)12 d并記錄斑馬魚存活數(shù)量［11］。

1.2.5 環(huán)境因素對(duì)DZ11菌株生長和脫氮性能的影響 分別研究不同C/N，pH，溫度及碳源條件下DZ11菌株對(duì)氨氮，亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化情況。C/N比分別為10、20、30、40（控制氮濃度不變，氨氮濃度為26.75 mg/L、亞硝態(tài)氮濃度為34.5 mg/L、硝態(tài)氮濃度為 40 mg/L）；pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；溫度分別為15.0℃、20.0℃、25.0℃、30.0℃；碳源的種類分別為檸檬酸鈉，草酸鈉，丁二酸鈉和乙酸鈉，反應(yīng)過程中控制單一變量，其他反應(yīng)條件均不變，分別為C/N=10、pH=7、溫度30℃、碳源為檸檬酸鈉，轉(zhuǎn)速為200 r/min。將已經(jīng)培養(yǎng)了18-24 h的菌液按1%的接種量接種到裝有100 mL已經(jīng)高溫滅菌過的300 mL的錐形瓶中，培養(yǎng)48 h，每隔8 h取一次樣，檢測(cè)OD600后，以3 000 r/min，5 min離心處理，取上清液檢測(cè)氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量。

1.2.6 氮素檢測(cè)方法及轉(zhuǎn)化率計(jì)算 硝態(tài)氮采用紫外分光光度法（GBHJ/T346-200）檢測(cè)，亞硝態(tài)氮采用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）測(cè)定，氨氮使用N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（GB 7493-87）檢測(cè)。去除率的計(jì)算公式如下：

C0表示 0 h 相應(yīng)氮源濃度（mg/L），C1表示發(fā)酵培養(yǎng)后某時(shí)間相應(yīng)氮源濃度（mg/L）。采用 Excel 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的形態(tài)及生理生化

DZ11在營養(yǎng)瓊脂上形成偏米黃色菌落，透明，形狀不規(guī)則，表面光滑濕潤（圖1）。如圖2所示，菌株DZ11是長約1.4 μm，寬約0.4 μm左右的桿菌，革蘭氏陰性菌，生理生化結(jié)果見表1。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，菌株DZ11的形態(tài)特征和生理生化結(jié)果和假單胞菌屬較符合。

表1 菌株DZ11生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification of strain DZ11

圖1 DZ11菌落形態(tài)圖Fig.1 Colony morphology of DZ11

圖2 菌株DZ11掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of strain DZ11

2.2 16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

提取DZ11的基因組DNA并對(duì)其核糖體的16S rDNA保守型序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠成像系統(tǒng)觀察，產(chǎn)物切膠回收，測(cè)序。獲得的序列提交至GenBank獲得的登錄號(hào)為 MW578872.1，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中近緣種進(jìn)行同源性分析，經(jīng)過Blast對(duì)比構(gòu)建繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。菌株DZ11與假單胞菌屬施氏假單胞菌比對(duì)有超過98%的同源性，再結(jié)合生理生化結(jié)果和形態(tài)學(xué)可判斷菌株DZ11是施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）并將該菌命名為Pseudomonas stutzeri DZ11。

2.3 菌株的藥敏試驗(yàn)

菌株的藥敏試驗(yàn)如表2所示，菌株DZ11對(duì)諾氟沙星、氯霉素、硫酸慶大霉素等常見藥品都表現(xiàn)為敏感，因此可判斷菌株DZ11無明顯的耐藥性。

表2 菌株DZ11對(duì)不同藥品的耐藥性結(jié)果表Table 2 Resistance results of strain DZ11 to different drugs

2.4 生物安全性檢測(cè)

在菌株DZ11的生物安全性實(shí)驗(yàn)中，正常飼養(yǎng)條件下，第12天時(shí)，菌株DZ11實(shí)驗(yàn)組斑馬魚存活率為100%，空白對(duì)照組存活率為100%（圖4）。本實(shí)驗(yàn)菌株的加入量約為1×106CFU/mL，高于病原微生物的致病劑量（1×104CFU/mL），因此可以初步判斷菌株DZ11具有較高的生物安全性。

圖4 菌株DZ11浸泡處理后斑馬魚存活率Fig.4 Survival rate of zebrafish soaked with strain DZ11

2.5 環(huán)境因素對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響

2.5.1 C/N對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響C/N對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖5所示，隨著C/N的增加菌株的生長情況開始逐步下降，當(dāng)硝態(tài)氮為唯一氮源時(shí)，這種下降趨勢(shì)最為明顯，且硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率也隨之降低，但C/N的改變對(duì)氨氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率影響較小，氨氮的轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在80%左右，亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在85%以上。當(dāng)C/N為10時(shí)，菌株的生長情況和脫氮性能最好。48 h后，菌株在C/N為10的培養(yǎng)基中對(duì)氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率分別為82.05%，79.07%和94.30%。

圖5 C/N比對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.5 Effects of C/N ratio on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.2 pH對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 pH對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖6所示，pH對(duì)菌株DZ11的生長量影響顯著，酸性或堿性條件都有明顯的抑制作用。當(dāng)pH為7時(shí)，菌株DZ11在以氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮為唯一氮源的培養(yǎng)基中的OD600分別為0.254 8，0.201 4，0.162 5，菌株生長最好。對(duì)氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率趨勢(shì)和生長趨勢(shì)大致相同。在pH為5時(shí)菌株的脫氮性能處于較低的水平，隨著pH的升高，脫氮效率逐漸上升，當(dāng)pH到7時(shí)降解效率達(dá)到最高，氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率分別84.00%，79.93%和95.23%。隨著pH的繼續(xù)升高，生長情況和轉(zhuǎn)化率開始降低，所以菌株DZ11在pH為7時(shí)的生長和脫氮性能最優(yōu)。

圖6 pH對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.6 Effects of pH on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.3 溫度對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 溫度對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖7所示，當(dāng)溫度為15℃，菌株幾乎不生長，并且脫氮性能很低，說明低溫對(duì)菌株DZ11的生長和脫氮性能有著明顯的抑制作用。隨著溫度的逐漸升高，菌株的生長量也逐漸增加。當(dāng)溫度上升到25℃時(shí)，菌株的生長量趨于穩(wěn)定。菌株的脫氮性能隨著溫度的上升一直在逐漸的增加，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，菌株的脫氮性能最優(yōu)，對(duì)氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率分別84.39%，79.93%和94.30%。

圖7 溫度對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.7 Effect of temperature on the growth and denitrification performance of strain DZ11

2.5.4 碳源對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響 碳源對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響如圖8所示，菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長量的變化趨勢(shì)和脫氮情況變化趨勢(shì)較為一致且從高到底依次是檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、醋酸鈉和草酸鈉。當(dāng)以檸檬酸鈉為唯一碳源時(shí)的氨氮，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率分別75.56%，99.00%和97.65%。

圖8 C源對(duì)菌株DZ11生長和脫氮性能的影響Fig.8 Effects of source C on the growth and denitrification performance of strain DZ11

3 討論

在進(jìn)行細(xì)菌鑒定時(shí)，單一的方法準(zhǔn)確性較差，多種方法相結(jié)合可以使鑒定方法更加科學(xué)。不同的細(xì)菌具有不同的代謝類型，從而與各種試劑表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，為此利用生物化學(xué)的方法測(cè)定細(xì)菌在新陳代謝過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌的種類。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和16S rDNA 基因測(cè)序分析確定了菌株DZ11為假單胞菌屬施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）并命名為Pseudomonas stutzeri DZ11。

用于生態(tài)環(huán)境保護(hù)和污染防治為目的而使用的微生物菌劑需要先進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià)［13］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和生物安全性試驗(yàn)，菌株DZ11對(duì)于常見藥品無明顯耐藥性，并在斑馬魚的生物安全性試驗(yàn)中斑馬魚的存活率為100%，可以初步判斷出菌株DZ11有較高的生物安全性，為菌株在使用環(huán)節(jié)中的防范和應(yīng)急措施提供指導(dǎo)。

好氧反硝化細(xì)菌的脫氮性能受環(huán)境因素的影響較大，并且降解不同種類的氮源最佳的因素也不相同［14-20］。碳源不僅是菌體生長必須的營養(yǎng)源，而且也是反硝化過程中重要的能量來源和電子受體，對(duì)細(xì)菌的生長和脫氮效率具有重要影響。好氧反硝化細(xì)菌的碳源種類有很多，包括檸檬酸鈉、葡萄糖、草酸鈉、琥珀酸鈉等。菌株DZ11在檸檬酸鈉為碳源時(shí)，有最高生長量且綜合脫氮性能最佳，這與Achromobacter sp.L16［21］和 Zobellella sp.［17］結(jié)果一致。在其他實(shí)驗(yàn)中也有發(fā)現(xiàn)以葡萄糖［22］、乙酸鈉［23］和琥珀酸鈉［8］為唯一碳源時(shí)脫氮效率最高。不同的碳源具有不同的分子量和化學(xué)結(jié)構(gòu)式，會(huì)影響到菌株體內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)，檸檬酸鈉是一種小分子碳源，可以作為三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，能直接被細(xì)菌所利用，被廣泛的用做反硝化細(xì)菌的碳源［21］。

雖然有很多研究探究脫氮過程中的最佳C/N比，但是因?yàn)榫攴N類不同探究的方向不同，得出的結(jié)果也各不相同。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株DZ11在C/N為10-20之間綜合脫氮性能最優(yōu)，隨著C/N的增加，硝態(tài)氮的降解效率直線下降，當(dāng)C/N為40時(shí)，硝態(tài)氮的降解效率僅為 12.05%。這和 SQ2［8］和 L16［21］結(jié)果較為一致。Huang等［24］對(duì)菌株C.diversus進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得出好氧反硝化的最優(yōu)C/N為4-5，Yang等［25］發(fā)現(xiàn)在一定范圍C/N比越高，好氧反硝化過程中亞硝態(tài)氮的積累量越少，當(dāng)C/N比為30時(shí)亞硝態(tài)氮的積累量最少為2.70±0.15。Zheng等［26］發(fā)現(xiàn)體系中C/N較低時(shí)，會(huì)有大量的亞硝態(tài)氮積累并且導(dǎo)致細(xì)菌生長緩慢甚至不生長。當(dāng)有機(jī)碳濃度增加時(shí)，積累的亞硝態(tài)氮濃度逐漸減少，細(xì)菌生長也得以恢復(fù)。他們從總氮去除率著手，得到最佳的C/N比為15。李靜等［27］對(duì)菌株HAD-2的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C/N比為25時(shí)，異養(yǎng)硝化效率最高。因此，不同菌株的最佳C/N是不一樣的，具有明顯的種屬差異性和個(gè)體區(qū)別。

溫度是影響菌株活性的重要環(huán)境因素之一，溫度變化直接影響微生物的酶活，生長速度，因此只有在最佳的溫度條件下，好氧反硝化細(xì)菌才能擁有最佳的脫氮性能［18］。菌株DZ11在30.0-35.0℃時(shí)的綜合脫氮效率最高，在大部分的好氧反硝化菌的最佳溫度范圍內(nèi)［28-30］，該溫度適合在廣東沿海地區(qū)的養(yǎng)殖尾水的脫氮工程中使用。何騰霞等［31］發(fā)現(xiàn)的耐冷型菌株Y-9的最佳溫度為15℃，李譽(yù)琦等［32］發(fā)現(xiàn)的耐熱菌株Y7在50℃高溫不影響其降解亞硝酸鹽的效率。這些菌株的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大在極端環(huán)境下菌株的可選擇范圍。pH值可以影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，而且還會(huì)影響溶液中營養(yǎng)物質(zhì)或抑制物質(zhì)的濃度，從而直接或間接影響好氧反硝化菌株的活性［33］，菌株DZ11在pH為7時(shí)脫氮性能最優(yōu)，這與目前大部分好氧反硝化細(xì)菌的研究結(jié)果相似。

養(yǎng)殖廢水中的無機(jī)氮主要為氨氮，亞硝酸鹽，硝酸鹽這三類。本研究發(fā)現(xiàn)菌株DZ11可以同時(shí)對(duì)這三類氮素都有很高的轉(zhuǎn)化率，并且具有較高的生物安全性，為后續(xù)實(shí)際應(yīng)用到養(yǎng)殖尾水脫氮工藝提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié)論

從廣東中山市民眾鎮(zhèn)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)底泥及污水中分離篩選出來的菌株DZ11，鑒定為假單胞菌屬施氏假單胞菌并命名為Pseudomonas stutzeri DZ11；通過生物安全性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株DZ11無明顯耐藥性并且具有較高的生物安全性；菌株DZ11的最佳脫氮環(huán)境因素分別為：最優(yōu)的C源為檸檬酸鈉，最佳C/N比為10，最適溫度為35.0℃，最適pH為7.0；菌株DZ11在以NH4-N為唯一底物時(shí)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)84.39%；在以NO3-N為唯一底物時(shí)轉(zhuǎn)化率可高達(dá)99.0%；在以NO2-N為唯一底物時(shí)，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)97.65%。