沈俊強 張莉萍 于瑞明 王永錄 潘麗 劉霞 劉新生

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730064）

豬嵴病毒（porcine kobuvirus，PKV）自2007年在匈牙利首次分離出經(jīng)典毒株S-1-HUN后［1］，相繼在中國［2］、日本［3］、韓國［4］、美國［5］等國家豬糞便樣品中檢測出該病毒，使得PKV逐漸在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。2013年國際病毒分類委員會的病毒分類報告中對Kobu病毒屬中的病毒進行重命名，將PKV、人愛知病毒（Aichi virus，AiV）與牛嵴病毒（bovine kobuvirus，BKV）正式確定為Kobu病毒屬中的3成員［6］。研究發(fā)現(xiàn)PKV基因組結(jié)構(gòu)與嵴病毒屬其余兩個病毒同源性較高，AiV已被證實與人類腹瀉疾病相關(guān)，PKV作為與AiV同屬的病毒，也可能是豬腹瀉疾病的誘因。近年來有研究報道無論豬是否感染PKV，其血清樣品中都可檢出PKV，且在具有豬腹瀉癥狀的豬場中PKV陽性率明顯高于無癥狀豬群，表明PKV感染可能是引起豬腹瀉的的重要因素之一［7-10］。近年來國內(nèi)PKV流行越來越廣泛，陽性率不斷升高［11-12］，但目前國內(nèi)外尚未報道適合分離培養(yǎng)PKV的細胞系，無法深入研究PKV的致病機理，不能確切證實PKV感染與仔豬腹瀉之間的關(guān)系。因此，在現(xiàn)階段建立有效的PKV檢測方法以確證其感染，同時結(jié)合相關(guān)流行病學(xué)和病理學(xué)研究，對于研究該病的致病機制十分重要。

PKV為小RNA病毒科的無囊膜單股正鏈RNA病毒，在電鏡下呈凹凸不平的球型，病毒粒子直徑約為20-30 nm，結(jié)構(gòu)為二十面體［13-16］。該病毒基因組全長約為8.5 kb，由5′端非編碼區(qū)、開放閱讀框和3′端非編碼區(qū)組成，5′端非編碼區(qū)長度一般在576-808 nt左右，末端與VPg蛋白連接，二級結(jié)構(gòu)可能與PKV病毒基因的復(fù)制相關(guān)［17］，3′端非編碼區(qū)長度由167-237 nt組成，后面連接PolyA尾序列，其功能與結(jié)構(gòu)尚未有研究報道。開放閱讀框由無剪切活性的前導(dǎo)蛋白L、結(jié)構(gòu)蛋白P1、非結(jié)構(gòu)蛋白P2和P3基因序列組成，編碼的多聚蛋白在自身蛋白酶的作用下被剪切為結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和 VP1，非結(jié)構(gòu)蛋白2A，2B，2C，3A，3B，3C 和 3D，前導(dǎo)蛋白L無剪切活性，不參與多聚蛋白的剪切，研究表明可能與病毒RNA的復(fù)制與衣殼化有關(guān)［18-19］。結(jié)構(gòu)蛋白VP0具有良好的反應(yīng)原性，且突變率相對較低，VP1蛋白作為衣殼蛋白暴露在病毒粒子的表面，含有大量的抗原表位且免疫原性最強，是PKV的優(yōu)勢免疫蛋白，也是參與中和作用的主要蛋白［15，20-22］。相比于 VP0來說，利用 VP1建立的ELISA方法敏感性可能更好，可能更適合作為間接ELISA的檢測抗原。因此，我們選擇VP0與VP1蛋白作為包被抗原分別建立間接ELISA檢測方法并比較分析兩種方法的特異性和敏感性。

目前檢測PKV方法主要包括血清學(xué)檢測、PCR技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)等［23-24］。血清學(xué)檢測為PKV最常用的診斷方法，其中ELISA檢測方法與其他血清學(xué)方法相比，具有可重復(fù)、易自動化和標準化的特點，還可用于定性和定量檢測。近年來有研究成功利用HB-BD、CH441、XD株建立PKV結(jié)構(gòu)蛋白的間接ELISA檢測方法［25-28］，但多數(shù)基于較易發(fā)生突變的VP1蛋白和免疫原性相對較差的VP3蛋白，這些ELISA方法的敏感性不穩(wěn)定。本研究首次以甘肅地區(qū)毒株AH6基因組序列為參考序列優(yōu)化密碼子后合成了穩(wěn)定性較好的VP0和抗原性較好的VP1結(jié)構(gòu)蛋白基因，構(gòu)建表達VP0與VP1蛋白的重組質(zhì)粒pET-32a-VP0和重組質(zhì)粒pET-32a-VP1，純化重組蛋白pET-32a-VP0和重組蛋白pET-32a-VP1并檢測其反應(yīng)原性，將其作為包被抗原，建立間接ELISA 檢測方法，并對兩種間接ELISA方法進行比較，探討更適合作為包被抗原的重組蛋白，為進一步建立PKV快速診斷技術(shù)及檢測試劑盒的開發(fā)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 豬嵴病毒參考毒株AH6由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)團隊基因工程實驗室提供并保存、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacorona virus，PDCoV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PRoV）、豬傳染性腸胃炎病毒（transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）、豬瘟病毒（swine fever virus，CSFV）、偽狂犬（pseudorabies virus，PRV）的陽性血清和豬嵴病毒的陰性與陽性血清，原核表達載體pET-32a、大腸桿菌DH5α、感受態(tài)細胞BL21均由本實驗室保存；優(yōu)化密碼子的VP0與VP1全長基因序列（附件1）由武漢金開瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖購自北京索萊寶技術(shù)有限公司，DNA Mark、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與XhoⅠ購自美國Cell Biolabs公司，質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司，三色預(yù)染蛋白Mark購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，山羊抗豬IgG/HRP 購自Invitrogen公司，蛋白濃度測定Bardford試劑購自賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)PKV AH6毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP0與VP1基因序列對其密碼子優(yōu)化后，由武漢金開瑞生物技術(shù)有限公司合成目的基因。對重組質(zhì)粒和pET-32a表達載體進行雙酶切。再經(jīng)連接得到重組質(zhì)粒pET-32a-VP0和pET-32a-VP1，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21，涂布于含氨芐青霉素（Amp 100 mg/mL）的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12-16 h。挑取長勢均勻的單菌落，接種于5 mL含Amp（100 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12-16 h。使用質(zhì)粒小提試劑盒進行質(zhì)粒提取，由北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與鑒定 將測序正確的重組質(zhì)粒pET-32a-VP0和pET-32a-VP1再次搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定正確后，原菌液按1∶100的濃度加入LB液體培養(yǎng)基（含100 mg/mL Amp）中，37℃、220 r/min培養(yǎng)，待菌液OD600值在0.6-0.8時優(yōu)化誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組蛋白表達，表達的重組蛋白分別命名為重組蛋白pET-32a-VP0與重組蛋白pET-32a-VP1。誘導(dǎo)后的菌液離心收集沉淀，加入PBS進行超聲破碎后，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色法染色40 min，脫色后觀察分析。

1.2.3 重組蛋白的可溶性分析和Western blotting鑒定 利用優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件分別誘導(dǎo)1.5 L已表達重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1的菌液，收集菌體，進行可溶性分析，在Ni柱中用不同濃度的尿素純化重組蛋白并進行復(fù)性處理，測定濃度，純化的蛋白質(zhì)經(jīng)Western blotting進行分析，His標簽一抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，山羊抗鼠IgG/HRP二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜后曝光觀察分析。

1.2.4 重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1間接ELISA方法的建立

1.2.4.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 采用棋盤法將純化后的重組蛋白用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋為 5 μg/mL、2.5 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL 和 0.1 μg/mL，酶標板縱向梯度每孔加100 μL，每個樣品設(shè)置兩個重復(fù)，37℃包被2 h，PBST洗滌3次；封閉液選擇5%脫脂乳，每孔加150 μL，37℃封閉2 h，PBST洗滌3次；用血清稀釋液將陰陽性血清分別稀釋至1∶100、1∶200、1∶250、1∶300、1∶400、1∶500， 酶 標板橫向梯度每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次；將山羊抗豬IgG/HRP按1∶20 000稀釋，每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次；每孔加50 μL TMB底物溶液室溫避光15 min，每孔加50 mL H2SO4（2 mol/L）終止反應(yīng)，計算OD450處P/N值；挑選陽性值2.0-2.5，P/N值接近于10的為最佳抗原包被濃度與血清稀釋度。

1.2.4.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 進一步采用棋盤法確定封閉液最佳反應(yīng)條件、血清最佳孵育條件、山羊抗豬IgG/HRP（二抗）最佳孵育條件和TMB底物最佳反應(yīng)條件，以1%BSA、3%BSA、5%脫脂乳作為封閉液，每種封閉液封閉時間選擇1 h、2 h、3 h，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)確定最佳封閉條件；利用優(yōu)化后的抗原最佳包被濃度，包被時間選擇1 h、2 h和3 h，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)確定抗原最佳包被條件；利用優(yōu)化后的陰性血清與陽性血清最佳稀釋度，孵育時間選擇30 min、60 min、90 min，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)確定血清最佳反應(yīng)時間，山羊抗豬IgG/HRP（二抗）稀釋倍數(shù)選擇 1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000，二抗孵育時間選擇30 min、60 min、90 min，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)確定二抗最佳反應(yīng)條件，TMB底物溶液反應(yīng)時間選擇5 min、10 min、15 min，每個梯度設(shè)置2個重復(fù)確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4.3 血清陰陽臨界值的判定 利用重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1為抗原采用Western blotting方法篩選出20份PKV陰性血清，利用建立的間接ELISA方法檢測篩選出的20份PKV陰性血清，測得OD450值，計算20份PKV陰性血清平均值（x-）和標準差（s）。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，血清陰陽臨界值=x-+ 3s，確定間接ELISA檢測方法的臨界值。

1.2.4.4 重復(fù)性實驗 將重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1分3批包被，選取3份PKV陰性血清與陽性血清樣品，每份血清設(shè)置3個重復(fù)，利用建立好的間接ELISA方法檢測，測得OD450值，進行統(tǒng)計學(xué)分析，計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)CV=s/x-×100%確定其重復(fù)性。

1.2.4.5 特異性實驗 采用建立的間接ELISA檢測方法同時檢測已知PKV、豬流行性腹瀉（PEDV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（PRoV）、豬傳染性腸胃炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、偽狂犬（PRV）陽性血清，每個血清設(shè)置3個重復(fù)，測得OD450值，以確定的臨界值為對照，統(tǒng)計分析其特異性。

1.2.4.6 敏感性實驗 采用建立的間接ELISA方法檢測已知PKV陽性血清，利用血清稀釋液2倍倍比稀釋（1∶100-1∶12 600），每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，以確定的臨界值為對照，判斷該方法可檢出PKV陽性血清最小稀釋比例，統(tǒng)計分析其敏感性。

1.2.4.7 臨床樣本檢測與符合率實驗 采用建立的間接ELISA檢測方法對46份采集自甘肅地區(qū)的血清樣本檢測，并以重組蛋白為抗原，46份血清為一抗，利用Western blotting試驗驗證其陰陽性。通過對比兩種方法測得的結(jié)果計算建立的間接ELISA檢測方法的符合率大小。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS19.0軟件計算OD450的平均值、標準差、變異系數(shù)等。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-VP0與pET-32a-VP1分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶內(nèi)切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-32a-VP0酶切后得到大小為1 110 bp的特異性條帶（圖1-A）；pET-32a-VP1重組質(zhì)粒酶切后得到大小為777 bp的特異性條帶（圖1-B）。

圖1 重組質(zhì)粒pET-32a-VP0與pET-32a-VP1雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion identification of recombinant plasmid pET-32a-VP0 and pET-32a-VP1

2.2 重組蛋白的表達及鑒定

構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-32a-VP0與pET-32a-VP1轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21中，挑選陽性克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白表達，誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0在24℃時誘導(dǎo)12 h后在58 kD出表達帶有His標簽的蛋白（圖2-A）；重組蛋白pET-32a-VP1在37℃時誘導(dǎo)6 h后在45 kD處表達帶有His標簽的蛋白（圖2-B）。

圖2 重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1誘導(dǎo)表達Fig.2 Induced expression of recombinant protein pET-32a-VP0 and pET-32a-VP1

2.3 重組蛋白的可溶性分析及Western blotting鑒定

大量誘導(dǎo)重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1菌液并進行可溶性分析，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0在包涵體中表達（圖3-A），重組蛋白pET-32a-VP1在上清中表達（圖4-A）。在Ni柱中用不同濃度尿素純化，以純化復(fù)性的重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1作為抗原進行Western Blotting檢測，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0在58 kD處檢測到重組蛋白（圖3-B）；重組蛋白pET-32a-VP1在45 kD處檢測到重組蛋白（圖4-B）。

圖3 重組蛋白pET-32a-VP0可溶性分析及Western blotting驗證Fig.3 Solubility analysis and Western blotting validation of recombinant protein pET-32a-VP0

圖4 重組蛋白pET-32a-VP1可溶性分析及Western blotting驗證Fig.4 Solubility analysis and Western blotting validation of recombinant protein pET-32a-VP1

2.4 重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1間接ELISA方法的建立

2.4.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定 采用棋盤法確定重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。重組蛋白濃度設(shè)置7個梯度，陰性血清與陽性血清稀釋度設(shè)置6個梯度，每個血清設(shè)置兩個重復(fù)進行檢測，讀取OD450值。結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0最佳抗原包被濃度為2 mg/mL，最佳血清稀釋度為1∶200（表1）；重組蛋白pET-32a-VP1最佳抗原包被濃度為2.5 mg/mL，最佳血清稀釋度為1∶200（表2）。

表1 棋盤法測定重組蛋白pET-32a-VP0抗原最佳包被濃度與血清稀釋度Table 1 Optimal encapsulation concentration of recombinant protein pET-32a-VP0 antigen with serum dilution determined by checkerboard method

表2 棋盤法測定重組蛋白pET-32a-VP1抗原最佳包被濃度與血清稀釋度Table 2 Optimal encapsulation concentration of recombinant protein pET-32a-VP1 antigen with serum dilution determined by checkerboard method

2.4.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用棋盤法確定封閉液最佳反應(yīng)條件、抗原最佳包被條件、PKV血清最佳孵育條件、二抗最佳孵育條件和TMB底物最佳反應(yīng)條件實驗結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1最佳封閉液均為5%脫脂乳，最佳封閉條件均為37℃、2 h；抗原最佳包被條件均為37℃、1 h；PKV血清最佳孵育條件均為37℃、1 h；最佳二抗孵育濃度分別為1：20 000，1：15 000，孵育條件均為37℃、1 h；TMB底物最佳顯色時間為10 min（表3）。

表3 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 3 Optimization results of reaction conditions

2.4.3 血清陰陽臨界值的判定 根據(jù)已經(jīng)建立的間接ELISA檢測方法檢測20份PKV陰性血清的OD450值，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0平均值（x-）為0.198，方差（s）為0.036，根據(jù)SPSS19.0軟件統(tǒng)計學(xué)分析，血清陰陽臨界值=x-+ 3s，可知當樣品OD450≥0.306時為陽性；OD450＜0.306為陰性；重組蛋白pET-32a-VP1平均值（x-）為0.184，方差（s）為0.031，可知當樣品OD450≥0.277時為陽性；OD450＜0.277 為陰性。

2.4.4 重復(fù)性實驗 利用建立好的間接ELISA方法檢測對陰陽性血清各3份進行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗，利用SPSS19.0軟件統(tǒng)計學(xué)分析，計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)CV=s/x-×100%。結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0批內(nèi)變異系數(shù)為2.6%-5.9%之間，批間變異系數(shù)為2.9%-7.0%之間（表4）；重組蛋白pET-32a-VP1批內(nèi)變異系數(shù)為3.1%-7.2%之間，批間變異系數(shù)為3.4%-8.2%之間（表5）；均小于10%。

表4 重組蛋白pET-32a-VP0重復(fù)性實驗Table 4 Reproducibility experiments of recombinant protein pET-32a-VP0

表5 重組蛋白pET-32a-VP1重復(fù)性實驗Table 5 Reproducibility experiments of recombinant protein pET-32a-VP1

2.4.5 特異性實驗 利用建立的ELISA檢測方法對PEDV、PDCoV、PRoV陽性血清和已知PKV陰陽性血清樣品進行檢測，每個血清設(shè)置3個重復(fù)，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1除PKV陽性血清檢測結(jié)果為陽性之外，PEDV、PDCoV、ProV、TGEV、CSFV、PRV陽性血清的檢測結(jié)果均為陰性（圖5）。

2.4.6 敏感性實驗 利用血清稀釋液2倍倍比稀釋（1∶100-1∶12 600）檢測兩種方法的敏感性結(jié)果顯示，重組蛋白pET-32a-VP0的敏感性實驗中，當PKV陽性血清稀釋至1∶6 400時，OD450仍大于0.306（圖6-A）；重組蛋白pET-32a-VP1的敏感性實驗中，當PKV陽性血清稀釋至1∶3 200時，OD450仍大于0.277（圖6-B）。

圖6 重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1敏感性實驗Fig.6 Sensitivity assay of recombinant protein pET-32a-VP0 and pET-32a-VP1

A：重組蛋白pET-32a-VP0；B：重組蛋白pET-32a-VP1A：Recombinant protein pET-32a-VP0.B：Recombinant protein pET-32a-VP1

2.4.7 臨床樣本檢測與符合率實驗 利用建立的間接ELISA檢測方法對46份采集自甘肅地區(qū)的血清樣本檢測，結(jié)果顯示重組蛋白pET-32a-VP0間接ELISA方法檢出12份陽性血清，34份陰性血清，Western bloting方法檢出11份陰性血清，35份陽性血清，符合率為94.4%；重組蛋白pET-32a-VP1間接ELISA方法檢出10份陰性血清，36份陰性血清，Western blottibng方法檢出11份陰性血清，35份陽性血清，符合率為94.1%。

3 討論

PKV自匈牙利首次被報道至今［1］，已有越來越多的國家相繼在腹瀉豬和健康豬體內(nèi)檢出PKV。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)有腹瀉癥狀的豬群PKV陽性率遠高于無腹瀉癥狀的豬群，提示該病毒感染與豬腹瀉相關(guān)［28］，但多國研究者對PKV進行研究尚未發(fā)現(xiàn)適用于PKV體外增殖培養(yǎng)的細胞系，所以該病毒感染與豬腹瀉的關(guān)系尚未明確。目前PKV在國內(nèi)流行較為廣泛，且陽性率高并呈上升趨勢，可能會成為其他病毒或疾病的誘發(fā)因素，所以建立該病毒的檢測方法對PKV的診斷與監(jiān)測及深入研究具有重要意義。

近年來國內(nèi)已利用不同毒株建立數(shù)種間接ELISA方法，韓磊等［25］利用毒株HB-BD的VP0蛋白、田野等［26］利用毒株XD的VP1蛋白、祝俊鵬等［27］利用毒株swKOV CH441的VP3蛋白、朱慶賀等［28］利用毒株JXDX的VP3蛋白分別建立了間接ELISA方法。眾所周知，小RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)易變異重組，且有研究對不同PKV毒株進行完整的基因測序分析后發(fā)現(xiàn)PKV ORF編碼的VP1蛋白的氨基酸序列較容易發(fā)生突變［29］，氨基酸序列的突變可導(dǎo)致所編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的改變，并在一定程度上影響蛋白的免疫原性［30］。與韓磊和田野研究不同的是，本研究以毒株AH6為參考序列建立新的間接ELISA方法，可為毒株AH6的感染提供更準確的檢測方法。同時基因序列分析表明PKV VP0蛋白不易發(fā)生突變，具有良好的免疫原性，而VP1蛋白暴露在病毒粒子表面，含有抗原表位多，是PKV的優(yōu)勢免疫抗原［15，20-22］，所以本研究分別以VP0與VP1為包被抗原建立新的PKV檢測的間接ELISA方法。

本研究利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達PKV重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1，經(jīng)Western blotting檢測顯示PKV陽性血清與純化的重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明表達的兩個重組蛋白具有良好的免疫原性，可作為間接ELISA的包被抗原。以重組蛋白pET-32a-VP0與pET-32a-VP1作為檢測抗原，用棋盤法建立間接ELISA檢測方法。與韓磊與田野等建立的方法不同的是，本研究建立的方法在抗原包被時不需要4℃過夜，提高了實驗室檢測效率。另外，本研究的ELISA方法敏感度可達到 1∶3 200，優(yōu)于前人建立的同類檢測方法。通過對兩種ELISA方法進行特異性、敏感性、重復(fù)性實驗和臨床檢測后，證明這兩種ELISA方法檢測的準確率較高且可用于PKV的實驗室與臨床檢測。同時，在建立ELISA方法的過程中發(fā)現(xiàn)在同等條件下以重組蛋白pET-32a-VP0為包被抗原建立的間接ELISA檢測方法的特異性反應(yīng)更強、靈敏度更高，可能是因為VP1是PKV突變頻率最高的結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致用其作為包被抗原檢測某些血清時特異性與敏感性降低，因此PKV AH6株結(jié)構(gòu)蛋白VP0更適合作為包被抗原建立間接ELISA檢測方法與檢測試劑盒的開發(fā)。

4 結(jié)論

本研究通過原核表達PKV AH6株結(jié)構(gòu)蛋白VP0與VP1，分別建立了基于豬嵴病毒AH6毒株VP0與VP1蛋白的ELISA抗體檢測方法。結(jié)果顯示，兩種ELISA方法檢測豬血清時以重組蛋白pET-32a-VP0為包被抗原時血清樣品OD450≥0.306時為陽性，OD450＜0.306時為陰性；重組蛋白pET-32a-VP1為包被抗原時血清樣品OD450≥0.277時為陽性；OD450＜0.277為陰性。建立的兩種間接ELISA方法通過重復(fù)性、特異性、敏感性實驗和臨床檢測證明兩種方法都可作為PKV的有效檢測手段，但以重組蛋白pET-32a-VP0為包被抗原建立的間接ELISA方法特異性反應(yīng)更強、靈敏度更高。

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