張澤穎 范清鋒 鄧云峰 韋廷舟 周正富 周建 王勁江世杰

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.西南科技大學(xué)生物質(zhì)材料教育部工程研究中心，綿陽(yáng) 621010）

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3，即甘油三酯水解酶）是催化長(zhǎng)鏈甘油三酯水解為脂肪酸、二酰甘油、單酰甘油的酶類［1］。除水解活性外，脂肪酶還具有酯交換、酯化、氨解和醇解活性，被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［2-6］。研究發(fā)現(xiàn)，自然界大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶，至少包括細(xì)菌的28個(gè)屬，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬等［7］。產(chǎn)脂肪酶菌株分離篩選、脂肪酶活力測(cè)定及脂肪酶基因挖掘一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，黃陽(yáng)天等［8］利用橄欖油作為唯一碳源從海泥中篩選獲得兩株具有產(chǎn)脂肪酶能力的海洋細(xì)菌，即假單胞菌S11和芽孢桿菌S22，同時(shí)這兩株產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌還表現(xiàn)出產(chǎn)電性能；Haq等［9］從石油污染的土壤中分離出產(chǎn)脂肪酶短桿菌SB11 MH715025和假單胞菌SB15 MH715026，所產(chǎn)生的脂肪酶可有效制備生物柴油，產(chǎn)率高達(dá)97%。

許多微生物受環(huán)境因子驅(qū)動(dòng)進(jìn)化出一系列適應(yīng)新環(huán)境的特異基因（簇），為進(jìn)一步從獲得的微生物中挖掘特殊功能基因和比較種間/內(nèi)基因的差異，隨著測(cè)序技術(shù)成本的降低，基于全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing，WGS）的組學(xué)技術(shù)已然成為快速、精確、有效的策略［10］。許多研究者采用WGS技術(shù)獲得物種全基因組序列進(jìn)而揭示其發(fā)揮特殊功能的機(jī)制，呂瑞瑞采用PacBio SMRT三代測(cè)序技術(shù)對(duì)Lactobacillus paracasei PC-01進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)比較基因組學(xué)方法揭示39株L.paracasei菌株之間的差異［11］。Lim等［12］對(duì)紅樹(shù)林土壤中分離的Bacillus solimangrovi GH 2-4T菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，明確了與修復(fù)基團(tuán)和色素形成、蛋白質(zhì)及碳水化合物代謝有關(guān)的基因；Patel報(bào)道了一株脂肪酶活性較高的印度不動(dòng)桿菌UBT1菌株，并通過(guò)基因組序列探明了菌株所產(chǎn)脂肪酶活性較高的原因是由于三酰甘油脂肪酶、磷脂酶等的特異酶的存在［13］。因此利用全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)于產(chǎn)脂肪酶微生物的功能解析、挖掘特異脂肪酶基因具有重要意義。

不動(dòng)桿菌是微生物脂肪酶的重要菌株來(lái)源，不動(dòng)桿菌屬來(lái)源脂肪酶具有良好的溫度適應(yīng)性和底物廣譜性，是脂肪酶研究的一個(gè)重要方向。本研究將前期篩選獲得的一株不動(dòng)桿菌屬高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9進(jìn)行全基因組測(cè)序與分析，對(duì)深入了解脂肪酶產(chǎn)生菌WCO-9的產(chǎn)酶機(jī)制及新型脂肪酶特異基因挖掘具有重要意義，為后期高產(chǎn)脂肪酶工程菌的創(chuàng)制及工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9為本實(shí)驗(yàn)室從餐廚廢油污染的土壤中分離篩選獲得，16S rRNA基因序列鑒定該菌為Acinetobacter junii，并于廣東省微生物菌種保藏中心保藏（編號(hào)為GDMCC No：61851）。對(duì)照菌株Acinetobacter junii ATCC 17908購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃、1.304×105Pa滅菌30 min。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將WCO-9菌株于LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)16 h。取50 mL菌液4 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清收集菌體，用無(wú)菌水重懸洗菌2次，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)菌總DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及濃度和純度測(cè)定。提取的樣品總DNA干冰保存寄送并委托北京百邁客生物科技有限公司完成測(cè)序工作。

1.2.2 菌株WCO-9比較基因組學(xué)分析 將WCO-9菌株16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST比對(duì)，選取NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性較高的10個(gè)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。使用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-joining 法和1 000次重復(fù)的Bootstrap值構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。使用Mauve軟件Mauvealigner算法將WCO-9菌株基因全基因組序列與參考近源菌株ATCC 17908全基因組序列進(jìn)行共線性分析。設(shè)置局部共線區(qū)的最小權(quán)重值（locally collinear block weight，LCB weight）為 325。

1.2.3 菌株WCO-9的脂肪酶活性測(cè)定 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的WCO-9與ATCC 17908菌液各5 μL點(diǎn)至羅丹明-油脂同化平板圓孔內(nèi)，于30℃培養(yǎng)4 d后觀察透明圈情況，初步判斷菌株產(chǎn)脂肪酶的能力。分別以不同鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酯ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18為底物，采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)量WCO-9菌株和對(duì)照菌株ATCC 17908粗酶液的脂肪酶活力。1個(gè)酶活單位（1U）定義為每分鐘釋放1 μmoL的對(duì)硝基苯酚需要的酶量。分別取菌株WCO-9與ATCC 17908發(fā)酵上清液作為粗酶液，參考國(guó)標(biāo)GB/T 23535-2009 《脂肪酶制劑》方法，測(cè)定脂肪酶對(duì)橄欖油的水解活性。

1.2.4 菌株WCO-9基因組測(cè)序與組裝 提取的WCO-9樣品總DNA經(jīng)質(zhì)量驗(yàn)證合格，使用Canu v1.5軟件對(duì)過(guò)濾后reads進(jìn)行組裝，通過(guò)Racon v3.4.3軟件利用三代reads對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行矯正，通過(guò)Circlator v1.5.5軟件進(jìn)行環(huán)化和調(diào)整起始位點(diǎn)，采用Pilon v1.22軟件利用二代數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行糾錯(cuò)，得到準(zhǔn)確度更高的基因組后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5 基因功能注釋 使用軟件tRNAscan-SE v2.0、Infernal v1.1.3、Genewise v2.2.0、RepeatMasker v4.0.5預(yù)測(cè)基因組中的tRNA、rRNA、ncRNA、假基因及重復(fù)序列。通過(guò)Prodigal v2.6.3軟件對(duì)組裝后的基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)得到的基因序列與COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr、GO、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得基因功能注釋結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了獲得能夠降解油脂的微生物，本研究前期從餐廚廢油污染的土壤中通過(guò)選擇平板篩選獲得一批具有產(chǎn)脂肪酶能力的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，其中產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌，與ATCC 17908菌株［14］的同源性最高（99.99%），本研究命名為WCO-9。從WCO-9 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）可以看出，WCO-9菌株與ATCC 17908的親緣關(guān)系最近，因此選擇該菌株作為對(duì)照菌株對(duì)WCO-9的產(chǎn)脂肪酶能力進(jìn)一步比較分析。

圖1 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株WCO-9產(chǎn)脂肪酶活性比較分析

通過(guò)羅丹明B-油脂同化平板和國(guó)標(biāo)法測(cè)定脂肪酶水解活性，分析WCO-9菌株與ATCC 17908對(duì)照菌株對(duì)底物油脂的降解能力，初步比較其產(chǎn)脂肪酶活力。結(jié)果顯示，與對(duì)照菌株相比，WCO-9菌株能夠產(chǎn)生明顯較大的降解圈，且其水解底物橄欖油的酶活力為2 833 U/L，是對(duì)照菌株ATCC 17908的116倍（表1）。同時(shí)，測(cè)定WCO-9菌株與對(duì)照菌株ATCC 17908對(duì)含有不同鏈長(zhǎng)脂肪酸的對(duì)硝基苯酯 ρ-NPC10、ρ-NPC14和 ρ-NPC18的水解能力。結(jié)果顯示，WCO-9菌株所產(chǎn)脂肪酶活性遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株ATCC 17908，WCO-9菌株對(duì)底物 ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18的降解能力分別為對(duì)照菌株的2 000倍、10倍和4倍，且對(duì)ρ-NPC10的水解能力最強(qiáng)，達(dá)到2 400 U/mL，隨著脂肪酸鏈的延長(zhǎng)酶活性降低（圖2-B）?？傮w而言，相比于親緣性較高的ATCC 17908對(duì)照菌株，WCO-9菌株對(duì)底物油脂具有較強(qiáng)的降解能力。

圖2 WCO-9菌株產(chǎn)脂肪酶活性分析Fig.2 Lipase activity analysis of WCO-9 strain

表1 菌株WCO-9所產(chǎn)脂肪酶對(duì)底物橄欖油的水解能力分析Table 1 Analysis of the hydrolysis ability of lipase from WCO-9 strain on the substrate olive oil by GB/T 23535-2009 method

2.3 菌株WCO-9基因組組裝與全基因組概況

基于WCO-9菌株高產(chǎn)脂肪酶的特異性，為深入挖掘脂肪酶特異編碼基因，本研究對(duì)WCO-9菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序。基因組序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為CP090890。測(cè)序結(jié)果表明WCO-9基因組大小為3 193 903 bp，基因組圈圖如圖3所示。通過(guò)組裝構(gòu)建，獲得1個(gè)Contig，1個(gè)Scaffold，平均GC含量為38.62%。通過(guò)Prodigal v2.6.3軟件預(yù)測(cè)，獲得組裝后WCO-9菌株的編碼基因信息，預(yù)測(cè)含有2 929個(gè)編碼基因，總長(zhǎng)度達(dá)2 796 966 bp，平均長(zhǎng)度954 bp。非編碼RNA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，包含18個(gè)rRNA，74個(gè)tRNA，48個(gè)其它的ncRNA。此外，預(yù)測(cè)獲得1個(gè)207 bp的假基因。

圖3 菌株WCO-9基因組圖譜Fig.3 Genome map of strain WCO-9

2.4 基因功能注釋

2.4.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 將預(yù)測(cè)基因與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得基因的分類注釋信息，包括細(xì)胞組分（cellar component，CC）、細(xì)胞分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）。產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，該分類中共有2 251個(gè)基因注釋，共39種功能分類。其中按照分子功能注釋，WCO-9所涉及基因在GO-CC分類的有3 010個(gè)，前3種功能分別是細(xì)胞膜、細(xì)胞膜部分和細(xì)胞。按照分子功能注釋，WCO-9所涉及基因所屬的GO-MF分類有2 714個(gè)，前3位功能分別是催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性，具有甘油三酯脂肪酶活性的基因有 GE001015、GE001718、GE001892、GE001931、GE002660。按照生物學(xué)過(guò)程分類，基因所屬的GO-BP分類有3 884個(gè)，得到注釋最多的3種途徑分別是代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程。

圖4 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因功能注釋GO功能分類Fig.4 GO function classification map of lipase-producing strain WCO-9’s gene functions

2.4.2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 將產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9的氨基酸序列與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到功能注釋結(jié)果。該菌株在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有1 602個(gè)基因分別在環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和新陳代謝3大功能50個(gè)通路上得到功能注釋，結(jié)果如圖5所示。其中983個(gè)基因在代謝通路上獲得注釋，41個(gè)代謝通路中，氨基酸生物合成相關(guān)的基因高達(dá)100個(gè)，占代謝通路注釋基因的10.17%，其中與脂肪代謝相關(guān)基因的Pathway通路信息及其Pathway ID如表2所示。134個(gè)基因在環(huán)境信息處理層面注釋，其中與膜運(yùn)輸相關(guān)的基因?yàn)?4個(gè)，與雙組分體系信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的基因有54個(gè)。

圖5 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因功能注釋KEGG代謝通路Fig.5 KEGG metabolic pathways annotated with the gene functions of lipase-producing strain WCO-9

表2 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9基因組脂肪代謝降解通路及相關(guān)基因Table 2 Fat metabolism and degradation pathways in lipase-producing strain WCO-9 genome and their related genes

2.4.3 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋 將獲得的數(shù)據(jù)與COG蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得細(xì)菌完整基因組編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類（圖6）。在不同的功能類中，基因所占比例反映對(duì)應(yīng)時(shí)期和環(huán)境下代謝或者生理偏向等內(nèi)容，可以結(jié)合研究對(duì)象在各個(gè)功能類別的分布做出科學(xué)解釋。

圖6 產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9 COG功能分類Fig.6 COG function classification chart of lipase-producing strain WCO-9

2.5 菌株WCO-9比較基因組學(xué)分析

2.5.1 Acinetobacter屬菌株基因組比較分析 為比較WCO-9菌株與不動(dòng)桿菌屬中親緣關(guān)系較近菌株的差異性，將3株菌株基因組特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表3。在這4株菌的全基因組信息中，Acinetobacter baumannii ATCC 19606可預(yù)測(cè)的編碼基因最多。4株菌的基因組大小和GC含量相似，基因組大小在3.19-3.93 Mb，GC含量在38.47%-42.48%。

表3 菌株WCO-9與3株不動(dòng)桿菌全基因組序列基本特征比較Table 3 Comparison of basic characteristics of whole genome sequences of strain WCO-9 and 3 strains of Acinetobacter

2.5.2 共線性分析 基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析選取同源關(guān)系最近的ATCC 17908菌株與目標(biāo)菌株WCO-9基因組進(jìn)行Mauve共線性比對(duì)，快速分析基因組之間有無(wú)大片段序列重排現(xiàn)象。從圖7可以看出，WCO-9與ATCC 17908之間的共線性關(guān)系較差，存在大量的插入、缺失、倒位和易位等基因重排事件，說(shuō)明WCO-9菌株在特殊油污土壤環(huán)境中可能進(jìn)化出一套適應(yīng)新環(huán)境基因組的現(xiàn)象。

圖7 菌株WCO-9與菌株ATCC 17908基因組共線性分析Fig.7 Genomic collinearity analysis of strain WCO-9 and strain ATCC 17908

2.5.3 菌株WCO-9脂肪酶相關(guān)基因序列分析 由數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析可知，WCO-9菌株全基因組序列中含有11個(gè)編碼脂肪酶的基因（表4）。通過(guò)BLAST比對(duì)分析獲得預(yù)測(cè)的脂肪酶的相似性，從表中可以看出，GE001931氨基酸序列相似度最低（90.76%），推測(cè)其為一個(gè)新型脂肪酶基因。在基因功能注釋分析中，將WCO-9菌株與Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得3個(gè)脂肪酶分子伴侶（表4）。另外，將這14個(gè)基因與ATCC 17908菌株中的基因進(jìn)行比對(duì)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)脂肪酶基因GE001931與脂肪酶分子伴侶基因GE000502在ATCC 17908菌株中沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的基因。值得注意的是在脂肪酶基因中，GE001701與GE001702與參考菌株ATCC 17908中的編碼基因差異很大，分別為42.90%和40.29%。

表4 脂肪酶基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列相似度Table 4 Sequence similarity between lipase genes and genes in NCBI database

3 討論

微生物適應(yīng)性進(jìn)化很大程度受環(huán)境因子驅(qū)動(dòng)，油污環(huán)境中更易進(jìn)化出降解油脂的脂肪酶產(chǎn)生菌［15］?；谕诰蛐滦吞禺愔久富虻哪繕?biāo)導(dǎo)向，前期從廚余廢油污染的土壤中篩選獲得一株高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9，從菌落形態(tài)、生理生化和分子水平初步鑒定該菌為瓊氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter junii）。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，不動(dòng)桿菌屬微生物具有產(chǎn)脂肪酶的能力［16-21］，其中一些不動(dòng)桿菌能夠產(chǎn)低溫脂肪酶［22-23］。本研究篩選的瓊氏不動(dòng)桿菌WCO-9發(fā)酵液中脂肪酶活力表現(xiàn)極佳，具有重要研究?jī)r(jià)值。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示不動(dòng)桿菌屬來(lái)源的脂肪酶為細(xì)菌脂肪酶第I亞家族（I.1）［24-25］，與瓊氏不動(dòng)桿菌、抗輻射不動(dòng)桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系較近。通過(guò)比較WCO-9菌株與同源性最高的A.junii ATCC 17908菌株的脂肪酶活力，發(fā)現(xiàn)WCO-9菌株的脂肪酶水解活力均顯著高于ATCC 17908菌株。然而，近年來(lái)雖有多株不動(dòng)桿菌屬脂肪酶的報(bào)道，也有研究者采用紫外誘變育種、克隆脂肪酶基因構(gòu)建工程菌等多種方法提高菌株降解油脂的能力，但仍存在菌株所產(chǎn)酶活力較低的缺點(diǎn)，如Snellman等［26］從Acinetobacter sp.RAG-1中克隆表達(dá)了胞外脂肪酶LipA，該酶對(duì)底物對(duì)硝基苯基脂肪酸酯具有普適性，對(duì)中等長(zhǎng)度?；淐6的降解能力最強(qiáng)，接近3 U/mL；Zheng等［27］從Acinetobacter sp.XMZ-26中獲得脂肪酶Lip26，其水解豆蔻酸對(duì)硝基苯酯酶活力為30 U/mL；桑鵬等［28］從云南熱泉底泥中篩選的不動(dòng)桿菌屬耐高溫脂肪酶產(chǎn)生菌Acinetobacter sp.Lip-43，采用棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（C16）作底物測(cè)定的脂肪酶活力僅為106.5 U/mL。而本研究中WCO-9菌株對(duì)ρ-NPC10底物表現(xiàn)出最高活性，接近2 500 U/mL，遠(yuǎn)高于所報(bào)道的不動(dòng)桿菌屬脂肪酶活力。表明WCO-9菌株與其同屬菌株相比，具有獨(dú)特的高效產(chǎn)脂肪酶能力。

隨著測(cè)序成本降低和測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，全基因組測(cè)序已然成為最簡(jiǎn)潔、有效、快速的挖掘特異功能基因、探明作用機(jī)制的有力工具。陳體強(qiáng)等［29］采用PacBio SMART 技術(shù)完成了對(duì)紫芝栽培品種‘武芝2號(hào)’的測(cè)序工作，發(fā)掘了漆酶同工酶基因、鯊烯合酶、羊毛甾醇合酶基因等代謝相關(guān)功能基因，為紫芝栽培品種（系）的分子鑒定系統(tǒng)建立和品種改良提供可靠信息。Singh等［30］將鮑曼不動(dòng)桿菌AB030與高抗性病原菌LAC-4進(jìn)行了基因組和表型比較，發(fā)現(xiàn)AB030中包含許多LAC-4不存在的抗生素耐藥和毒力相關(guān)基因。本研究結(jié)合二代和三代測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株WCO-9全基因組進(jìn)行精細(xì)測(cè)序、分析和功能注釋，從分子層面對(duì)該菌株的生物學(xué)特性和基因功能進(jìn)行了分析。注釋結(jié)果表明該菌株涉及脂質(zhì)分解代謝的相關(guān)基因較為豐富，這些代謝途徑及基因與菌株產(chǎn)脂肪酶密切相關(guān)，由此推測(cè)產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9擁有一套完備的高效脂肪酶合成路徑和分泌體系，解釋了WCO-9菌株對(duì)油脂具有較強(qiáng)分解能力的原因。

基因組共線性分析顯示W(wǎng)CO-9與ATCC 17908菌株基因組差異較大，表明WCO-9菌株可能為瓊氏不動(dòng)桿菌新亞種，其形成是由于長(zhǎng)期環(huán)境選擇壓力驅(qū)動(dòng)所致。在長(zhǎng)期選擇壓力下，菌株通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移或定向進(jìn)化在局部共線區(qū)域擴(kuò)充基因以增加新功能，更好地適應(yīng)復(fù)雜多變環(huán)境［31］。因此，WCO-9可能存在一套高產(chǎn)且胞外分泌的新型脂肪酶合成路徑，具有良好的研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用前景。通過(guò)比較基因組學(xué)分析挖掘出WCO-9的14個(gè)脂肪酶基因及分子伴侶基因中，GE001931為該菌所特有的脂肪酶基因，推測(cè)其可能是WCO-9菌株脂肪酶活性遠(yuǎn)高于親緣關(guān)系最近的ATCC 17908對(duì)照菌株的主要原因。3個(gè)脂肪酶分子伴侶可能參與脂肪酶的表達(dá)分泌途徑，輔助脂肪酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成，其中ATCC 17908中未發(fā)現(xiàn)分子伴侶GE000502的同源基因，且脂肪酶GE001701和GE001702在菌株ATCC 17908的同源性很低，由此推測(cè)兩株菌的較大基因組差異影響了各自甘油三酯的代謝通路，最終導(dǎo)致脂肪酶活性的差異。

4 結(jié)論

本研究報(bào)道了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株WCO-9的全基因組序列，并通過(guò)基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋與比較基因組學(xué)分析了該菌株高產(chǎn)脂肪酶活性的原因。脂肪酶產(chǎn)生菌WCO-9的基因組大小為3.19 Mb，GC含量38.62%，含有2 929個(gè)編碼基因。其中含有11個(gè)具有脂肪酶活性的基因，3個(gè)脂肪酶分子伴侶基因，1個(gè)特異性脂肪酶基因，2個(gè)與對(duì)照菌株差異較大的脂肪酶基因；因WCO-9菌株中特異脂肪酶基因的存在及部分基因?qū)Ω视腿ゴx的影響，導(dǎo)致了其酶活遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株ATCC 17908。