張健 才恒 申振豪 劉仲浩 趙娟 張巧珍 高強(qiáng)

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；4.天津科技大學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津 300457；5.天津科技大學(xué)理學(xué)院，天津 300457）

γ-氨基丁酸（GABA）作為重要的抑制神經(jīng)訊息傳遞的物質(zhì)［1］，能夠參與人體內(nèi)多種代謝過程，具有較高的生理活性［2-3］。短乳桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致生長環(huán)境的pH值降低，從而抑制其生長［4］。為了抵抗酸脅迫，短乳桿菌形成了多種抗酸機(jī)制，常見的抗酸機(jī)制有谷氨酸脫羧酶（GAD）系統(tǒng)［5］、F0-F1-ATPase質(zhì)子泵、精氨酸脫亞胺酶途徑、生物胺產(chǎn)生系統(tǒng)［6］。GAD系統(tǒng)中，胞外的谷氨酸由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，并通過磷酸吡哆醛依賴的谷氨酸脫羧酶GadA或GadB脫羧生成GABA和二氧化碳，生成的GABA可由GadC轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。該過程消耗胞內(nèi)H+，外排偏中性的GABA，可有效提高環(huán)境的pH值，幫助微生物抵御酸脅迫［7-8］。Lv等［9］通過篩選低F0-F1-ATPase活性的短乳桿菌，來提高GABA的產(chǎn)量，依據(jù)是使H+更多的通過GAD系統(tǒng)消耗。受此啟發(fā)，我們?cè)O(shè)想抑制短乳桿菌生物胺產(chǎn)生系統(tǒng)，使H+更多的通過GAD系統(tǒng)消耗而提高GABA的產(chǎn)量。酪胺是生物胺的一種，短乳桿菌可以通過酪氨酸脫羧酶將酪氨酸脫羧生成堿性的酪胺來提高環(huán)境pH［10-11］。煙酸是酪氨酸脫羧酶的抑制劑［12］，故本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃添加煙酸來抑制短乳桿菌發(fā)酵過程中酪胺的產(chǎn)生，弱化酪胺產(chǎn)生系統(tǒng)，使短乳桿菌更多地通過GAD系統(tǒng)來抵御酸脅迫，從而提高其GABA產(chǎn)量。該思路已經(jīng)被前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，即在發(fā)酵中添加0.15%的煙酸確實(shí)能顯著提高GABA的產(chǎn)量。為了闡明煙酸促進(jìn)短乳桿菌合成GABA的作用機(jī)制，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的方法探究短乳桿菌添加和不添加煙酸發(fā)酵時(shí)的差異代謝物［13］，分析煙酸對(duì)短乳桿菌代謝通路的影響，并采用碘化丙啶（PI）單染色法［14］分析了細(xì)胞膜的完整性，旨為發(fā)酵法生產(chǎn)GABA提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 短乳桿菌（Lactobacillus brevis）CGMCC 3414［15］，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏于中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑 Agilent1200高效液相色譜儀（Angilent科技有限公司）；色譜柱：ZORBAX SBC184.6 mm×250 mm，5 μm；高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BX53正置熒光顯微鏡（日本Olympus）；320-S型 pH 計(jì)（Mettler Toledo）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；電子分析天平（Mettler Toledo）；生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）；AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；Agilent1290InfinityLC超高壓液相色譜儀（Agilent）；色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm。

乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨（Sigma）；谷氨酸鈉（99%，紅玫瑰味精）；2，4-二硝基氟苯（DNFB，分析純，Sigma公司）；乙酸鈉（分析純，生工生物工程股份有限公司）；酵母粉（分析純，北京奧博生物技術(shù)有限公司）；硫酸鎂（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；硫酸錳（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；葡萄糖（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）；吐溫-80（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）；煙酸（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）。衍生緩沖液：取碳酸鈉4.2 g用超純水定容至100 mL；衍生劑：0.1 mL DNFB用乙腈定容至50 mL；定容緩沖液：取磷酸氫二鉀3.4 g溶于145.5 mL的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，超純水定容至1 000 mL。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，乙酸鈉2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，吐溫80 1 mL/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉35 g/L，谷氨酸鈉（MSG）50 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨2 g/L，pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵過程中菌體生長、葡萄糖消耗和GABA合成 從甘油管中取100 μL菌液接于50 mL種子培養(yǎng)基中，在30℃、搖床轉(zhuǎn)速50 r/min培養(yǎng)24 h 后，以5%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于下一級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃、靜置培養(yǎng)12 h。將種子菌液以 5%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.15 %煙酸的為實(shí)驗(yàn)組，不含煙酸的為對(duì)照組，在30℃靜置培養(yǎng)72 h。在發(fā)酵過程中每6 h取1 mL菌液，稀釋10倍后用分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)為OD600，反映菌體生長情況；然后將稀釋10倍后的菌液8 000 r/min離心10 min取上清液，使用生物傳感分析儀測(cè)量葡萄糖含量。另外，在發(fā)酵24 h、36 h、48 h、60 h和72 h時(shí)，各取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min取上清，蒸餾水稀釋10倍后取10 μL于1.5 mL離心管中，依次加入衍生緩沖液100 μL、衍生劑100 μL、定容緩沖液790 μL，振蕩混勻，60℃水浴1 h。反應(yīng)后用0.22 μm醋酸纖維膜過濾，用高效液相色譜儀測(cè)定GABA的產(chǎn)量［16］。

1.2.2 代謝組學(xué)樣品的制備 取對(duì)數(shù)后期發(fā)酵液對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各6組平行，通過分光光度計(jì)調(diào)到相同的OD600值，定容后在4℃下8 000 r/min離心10 min取菌體沉淀，快速用生理鹽水在4℃下8 000 r/min離心10 min的條件下洗滌菌體兩次得到菌體樣本，加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20℃靜置10 min，4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋，4℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析［17］。

1.2.3 LC-MS中液相色譜條件 樣品采用超高效液相色譜系統(tǒng)（ultra performance liquid chromatography，UPLC）HILIC色譜柱進(jìn)行分離；柱溫25℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相組成A：水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0-0.5 min，95% B；0.5-7 min，B從95%線性變化至65%；7-8 min，B從65%線性變化至40%；8-9 min，B維持在40%；9-9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1-12 min，B維持在95%；整個(gè)分析過程中樣品置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中插入QC樣品，用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性［18］。

1.2.4 質(zhì)譜條件 分別采用電噴霧電離正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。ESI源條件如下：離子源溫度600℃，噴霧電壓（ion sapary voltage floating，ISVF）±5 500 V（正負(fù)兩種模式）；TOF MS掃描范圍（m/z）：60-1 000 Da，產(chǎn)物離子掃描范圍（m/z）：25-1 000 Da，TOF MS 掃描累積時(shí)間 0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間0.05 s/spectra；二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并且采用高靈敏模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正負(fù)兩種模式），碰撞能量Collision Energy：（35±15）eV。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫（inhouse database（Shanghai Applied Protein Technology））中代謝物的保留時(shí)間、分子質(zhì)量等信息進(jìn)行匹配，對(duì)樣本中的代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格核對(duì)。對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的代謝物結(jié)果進(jìn)行預(yù)處理后，使用SIMCA軟件（V15.0.2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）等分析，在最大程度保留原始信息的基礎(chǔ)上對(duì)采集的多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，然后進(jìn)行差異代謝物篩選、差異代謝物相關(guān)性分析、KEGG 通路分析等內(nèi)容［19］。

1.2.6 碘化丙啶單染色 細(xì)菌的細(xì)胞膜不完整時(shí)，碘化丙啶（propidium iodide，PI）能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，并且發(fā)出更亮的紅色熒光，PI不能進(jìn)入擁有完整細(xì)胞膜的胞內(nèi)，用來檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性［20］。將發(fā)酵對(duì)數(shù)生長前期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組菌液的OD600調(diào)至0.8，PBS溶液清洗菌體3次并用PBS溶液懸浮菌體，加入PI使其終濃度為5 μg/mL，輕輕搖勻菌液在黑暗下靜置15 min，最后吸取合適的菌液滴于載玻片上通過正置熒光顯微鏡觀察來判定細(xì)胞膜的通透性和完整性。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵過程中菌體生長、葡萄糖消耗和GABA合成

短乳桿菌發(fā)酵過程中的GABA產(chǎn)量如圖1-A所示，培養(yǎng)48 h后，實(shí)驗(yàn)組（experimental group，EG）的GABA產(chǎn)量開始顯著高于對(duì)照組（control group，CG），至72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的GABA產(chǎn)量提高44%。發(fā)酵過程中菌體OD值（OD600）和葡萄糖含量的變化如圖1-B所示，添加0.15%煙酸的實(shí)驗(yàn)組中菌體生長較之對(duì)照組明顯減緩，相應(yīng)的，發(fā)酵前24 h實(shí)驗(yàn)組中的葡萄糖消耗也更慢，但發(fā)酵30-42 h，實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖消耗比對(duì)照組更多，此后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的葡萄糖消耗趨于一致。

圖1 實(shí)驗(yàn)組（煙酸）和對(duì)照組在不同發(fā)酵時(shí)間下的GABA產(chǎn)量、OD值和葡萄糖的變化Fig.1 Changes in GABA yield，OD and glucose in experimental groups（nicotinic acid）and control groups at different fermentation times

2.2 多變量統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù) OPLS-DA方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，OPLS-DA是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，最大特點(diǎn)是可以去除自變量和分類變量無關(guān)的異常值，根據(jù)得分圖可以揭示數(shù)據(jù)離散程度，發(fā)現(xiàn)異常值。圖2-A和圖2-B顯示的得分圖上對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的組間分別位于兩側(cè)，則兩組間的代謝輪廓具有顯著差異或者是差異代謝物物的含量具有顯著性變化。

圖2 正（A）負(fù)（B）離子模式OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA score of positive（A）and negative（B）ion mode

2.3 差異代謝物的篩選

正離子模式下鑒定的代謝物數(shù)量為204種，負(fù)離子模式下鑒定出120種代謝物，其中主要為氨基酸、脂質(zhì)、有機(jī)酸及其衍生物，大量且豐富的代謝物數(shù)據(jù)有利于全面檢測(cè)出代謝通路的變化。基于OPLS-DA模式下VIP＞1篩選兩組間差異代謝物，篩出兩組間具有顯著性的變量（P＜0.05），通過HMDB和KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，篩選出33個(gè)顯著性差異代謝物如表1所示，其中調(diào)節(jié)趨勢(shì)是根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異代謝物含量的比值為依據(jù)（↑*：1-2；↑ **：2-5；↑ ***：＞5；↓ *：0.6-0.9；↓ **：0.3-0.6；↓***：＜0.3）。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中酪氨酸脫羧酶的產(chǎn)物酪胺含量顯著降低，有關(guān)脂質(zhì)代謝的十八碳二烯酸、二十二碳一烯酸、二十二碳二烯酸、20-羥二十烷四烯酸和棕櫚油酰磷脂酰甘油等不飽和脂肪酸的含量均顯著高于對(duì)照組，而對(duì)應(yīng)的飽和脂肪酸中單棕櫚酰甘油含量降低；氨基酸代謝中組脯氨酸、谷氨酸、組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和鳥氨酸的含量都是實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組中與能量代謝有關(guān)的AMP和2-磷酸甘油酸含量均顯著下降，證明了煙酸對(duì)菌體生長的抑制。

表1 正負(fù)離子模式下顯著性差異代謝物物Table 1 Significant difference metabolites in positive and negative ion mode

2.4 碘化丙啶（PI）單染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)數(shù)生長前期的PI染色結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)組中具有紅色熒光的短乳桿菌細(xì)胞明顯多于空白實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞，說明實(shí)驗(yàn)組中短乳桿菌細(xì)胞膜的通透性顯著高于對(duì)照組細(xì)胞。

圖3 煙酸對(duì)短乳桿菌的細(xì)胞膜通透性和完整性影響Fig.3 Effect of nicotinic acid on cell membrane permeability and integrity of L.brevis

3 討論

3.1 脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)不僅是能量代謝產(chǎn)物，還是細(xì)胞膜的重要組成成分。細(xì)胞在經(jīng)受環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)調(diào)節(jié)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，來影響細(xì)胞膜通透性，當(dāng)不飽和脂肪酸含量增多時(shí)細(xì)胞膜的通透性會(huì)加大［21-22］。代謝組學(xué)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組不飽和脂肪酸含量增加且飽和脂肪酸含量減少，暗示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜通透性增加，后續(xù)的PI染色結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。細(xì)胞膜的通透性增加，使得底物谷氨酸更容易進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行脫羧反應(yīng)，同時(shí)生成的GABA也更易排出細(xì)胞。

3.2 氨基酸代謝

由于乳酸菌缺乏必要的生物代謝途徑，不能合成生長所必需的氨基酸，乳酸菌必須從培養(yǎng)基中獲得這些生物活性物質(zhì)才能滿足其快速生長需要。乳酸菌依靠胞外蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)形成寡肽和氨基酸，這些水解產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，最后由細(xì)胞內(nèi)的各種肽酶裂解形成游離氨基酸供細(xì)胞合成代謝［23］。脯氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸均是短乳桿菌的必需氨基酸，鳥氨酸和天冬氨酸能夠通過谷氨酸代謝合成，屬于短乳桿菌的非必需氨基酸。實(shí)驗(yàn)組中上述氨基酸含量均高于對(duì)照組，證明實(shí)驗(yàn)組中肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性更強(qiáng)，或者胞內(nèi)肽酶活性更強(qiáng)，或者細(xì)胞通透性增加導(dǎo)致胞內(nèi)必需氨基酸含量增加。雖然胞內(nèi)必需氨基酸增加，但是實(shí)驗(yàn)組的菌體生長更慢，顯然是其它原因抑制了實(shí)驗(yàn)組菌體的生長。另外，實(shí)驗(yàn)組中酪胺含量的顯著下降，證明胞內(nèi)酪胺的合成受到抑制，煙酸對(duì)酪氨酸脫羧酶的抑制是有效的。

3.3 碳代謝

短乳桿菌是典型的兼性厭氧菌且進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵。1-磷酸甘露糖和6-磷酸甘露糖是核苷酸糖的主要來源，而核苷酸糖主要應(yīng)用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的合成，本研究中1-磷酸甘露糖和6-磷酸甘露糖的含量在添加煙酸后顯著降低，說明在實(shí)驗(yàn)組代謝過程中核苷酸糖類合成較少，不利于細(xì)胞生長繁殖。焦磷酸硫胺素是丙酮酸脫氫酶的輔因子，在實(shí)驗(yàn)組中含量顯著降低，可能會(huì)使丙酮酸脫氫酶的活性變低，減少乙酰CoA生成從而不利于脂肪酸的合成而影響細(xì)胞膜的形成。

3.4 其他差異代謝物

氨基己二酸是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)組中其含量上升意味著細(xì)胞膜完整性遭到破壞。肌醇半乳糖苷是典型的抗逆物質(zhì)與多種耐逆響應(yīng)有關(guān)［24］，甜菜堿是一種生物堿化學(xué)名稱為N，N，N-三甲基甘氨酸，艾杜醇作為一種糖醇類物質(zhì)，其兩者作用與脯氨酸相似都能起到維持細(xì)胞滲透壓的作用，甜菜堿和艾杜醇含量降低的原因是在生長過程中微生物會(huì)優(yōu)先從外界轉(zhuǎn)運(yùn)能夠維持滲透壓的溶質(zhì)［25］；通過代謝通路分析發(fā)現(xiàn)煙酰胺只會(huì)單向合成煙酸，煙酸含量的增加可能會(huì)抑制煙酰胺產(chǎn)物的生成，從而抑制NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）的合成，導(dǎo)致煙酸核苷酸的含量降低，抑制多種脫氫酶的活性，進(jìn)而抑制脂肪酸合成和菌體生長。植酸是一種非離子表面活性劑，當(dāng)積累在細(xì)胞膜表面可以改善通透性［26］，實(shí)驗(yàn)組中植酸含量降低可能是因?yàn)榧?xì)胞膜的完整性受到破壞。

短乳桿菌發(fā)酵中添加煙酸能顯著提高GABA的產(chǎn)量，但煙酸促進(jìn)短乳桿菌GABA合成的機(jī)制未知。利用非靶標(biāo)代謝組學(xué)可以無偏向性地分析短乳桿菌發(fā)酵后盡可能多的代謝產(chǎn)物，通過分析添加煙酸與不添加煙酸發(fā)酵后的差異代謝物，可能從全局角度理解煙酸促進(jìn)短乳桿菌GABA合成機(jī)制，將會(huì)對(duì)GABA的生物合成提供理論基礎(chǔ)和新的思路。

4 結(jié)論

本研究利用LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法分析了添加煙酸和不添加煙酸時(shí)，短乳桿菌細(xì)胞內(nèi)的差異代謝物。得到的33種具有顯著性差異的代謝物能夠看出添加煙酸后，酪胺和核苷酸糖的含量減少的同時(shí)，不飽和脂肪酸含量增加。通過PI單染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加煙酸后的短乳桿菌細(xì)胞膜的通透性顯著高于不添加煙酸的對(duì)照組。