王海杰 王成稷 郭洋 王云 陳艷娟 梁敏 王玨 龔慧 沈如凌

（上海實驗動物研究中心，上海 201203）

血友病A（hemophilia A，HA）又稱凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，Ⅷ）缺乏癥，也稱抗血友病因子（antihemophilic factor，AHF）缺乏癥，是一種X染色體連鎖的隱性遺傳出血性疾病，其特點是凝血活酶生成障礙，并導(dǎo)致凝血時間延長［1］。HA臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)的自發(fā)性關(guān)節(jié)、肌肉出血，也可以影響內(nèi)臟器官，嚴重的可因中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血死亡［2］。血友病A在男性群體中發(fā)病率為10-20/10萬，女性發(fā)病極為罕見，其中血友病A占血友病患者數(shù)總體的 80%-85%［3］。

F8基因位于X染色體長臂末端（Xq28），長度約為209.60 kb，由26 個外顯子和25 個內(nèi)含子構(gòu)成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。F8因子主要在肝臟合成，也在腎臟、內(nèi)皮細胞和淋巴組織中表達，是最大的凝血因子之一。F8基因龐大，從大量的血友病A臨床資料來看，導(dǎo)致發(fā)病的基因缺陷的形式具有多樣性，其中包括突變、內(nèi)含子倒位、插入、缺失等［4］。

作為凝血因子9的輔助因子，F(xiàn)8基因參與F9包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及其后修飾等在內(nèi)的凝血過程各環(huán)節(jié)［2］。F8基因突變幾乎完全發(fā)生在雄性生殖細胞中，使凝血因子9的蛋白質(zhì)構(gòu)成、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致凝血激活過程各環(huán)節(jié)發(fā)生異常，繼而導(dǎo)致凝血活性、抗原活性發(fā)生不同程度改變，從而表現(xiàn)為包括先天性出血障礙在內(nèi)不同嚴重程度的臨床癥狀。目前臨床HA患者治療中最常用的是替代療法，即通過給患者輸入血漿來源或者重組的F8蛋白進行控制［5-8］。但由于F8蛋白的半衰期短，藥物價格昂貴，同時5%-7%的患者會產(chǎn)生相關(guān)抑制效應(yīng)，限制了替代療法的有效性。HA單基因突變的特點使基因治療成為重點治療方向，并且已成為遺傳發(fā)病機理、基因診斷、基因治療的主要研究對象［9-10］。

目前為止，已有多家實驗室和公司制備了F8基因敲除小鼠，其中以杰克遜實驗室提供的HA小鼠（B6；129S-F8tm1Kaz/J）最為常見，其構(gòu)建策略是利用小鼠胚胎干細胞基因打靶技術(shù)通過同源重組破壞F8基因表達，從而產(chǎn)生血友病A的臨床癥狀；新的基因編輯工具，如CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)后國內(nèi)多家基因編輯公司構(gòu)建了F8基因敲除品系。由于構(gòu)建中需要用到不同背景的動物，使得HA模型在遺傳背景上比較復(fù)雜［11］。本文利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源重組（non-homologous end joining，NHEJ）基因敲除技術(shù)，在C57BL/6背景小鼠上成功構(gòu)建F8基因敲除小鼠模型，將整個F8基因的編碼區(qū)進行了敲除。該方法省去了ES細胞打靶步驟，比傳統(tǒng)基因打靶方法更為便捷，效率更高，敲除策略更為徹底，該模型的制備成功將為血友病的治療研究提供又一選擇工具［12-13］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 感受態(tài)細胞、各種限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、PCR相關(guān)試劑和T4 DNA連接酶購自 TaKaRa公司；Cas9表達載體、pX-T7-sgRNA質(zhì)粒由上海南方模式生物科技股份有限公司提供；GeneRluer 1kb DNA Ladder、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 試劑盒購自Thermofisher公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和瓊脂糖膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 試劑盒購自NEB公司；Trizol試劑購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和qPCR熒光預(yù)混液由Transgen公司提供 ；Mouse Factor Ⅷ ELISA Kit（Colorimetric）購自Novus公司；纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)IB）測定試劑盒、活化部分凝血酶時間測定試劑盒（APTT試劑盒）購自北京美創(chuàng)公司；人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ）試劑盒購自山東泰邦生物制品有限公司。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6背景F8基因敲除小鼠（F8-/-小鼠）及野生型小鼠（WT小鼠）均由上海南方模式生物科技股份有限公司繁育提供［SCXK（滬）2019-0002］。本實驗所涉及小鼠均按照SPF級動物要求，飼養(yǎng)于上海實驗動物研究中心SPF級實驗動物房［SYXK（滬）2019-0003］。所有實驗操作均經(jīng)上海南方模式生物科技股份有限公司實驗動物管理和使用委員會（IACUC）審批通過（IACUC號2017-0003）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNAs設(shè)計和表達載體構(gòu)建 小鼠F8基因定位于小鼠X染色體的 X A7.3區(qū)段（Chromosome X：74 216 321-74 425 922，ENSMUST00000033539.12），全長約209.60 kb，轉(zhuǎn)錄本F8-201，有26 個外顯子，表達蛋白全長2 319 aa。根據(jù)小鼠F8基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)，通過在線sgRNA設(shè)計軟件（http://crispr.mit.edu /），選擇敲除區(qū)域為外顯子1（exon1）編碼區(qū)到外顯子26（exon26），在exon1非編碼區(qū)和exon26下游序列中分別選擇sgRNA靶位點，sgRNA靶序列信息見表1。根據(jù)sgRNA靶位點，寡聚核苷酸序列，合成相應(yīng)的oligoDNA用于構(gòu)建sgRNA表達載體，序列信息見表2。

表1 sgRNA序列信息Table 1 sgRNA sequence information

表2 寡核苷酸鏈序列信息Table 2 Oligonucleotide chain sequence information

將每對寡核苷酸單鏈以程序降溫的方式退火成雙鏈。pX-T7-sgRNA質(zhì)粒經(jīng)BbsI 酶切后使其線性化，回收后分別與2對寡核苷酸雙鏈進行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；挑選帶有抗性的單克隆大腸桿菌感受態(tài)菌落提取質(zhì)粒DNA，進行測序鑒定，保存正確的陽性克隆。

1.2.2 sgRNA和Cas9表達載體的體外轉(zhuǎn)錄 sgRNA的表達載體pX-T7-sgRNA 經(jīng)酶切線性化后，按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit 試劑盒說明書進行體外轉(zhuǎn)錄；Cas9表達載體經(jīng)XbaI酶切線性化后，按照mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit 試劑盒說明書進行體外轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 陽性小鼠品系獲得及鑒定 將Cas9 mRNA和sgRNA混合物通過顯微注射到C57BL/6野生型小鼠（WT小鼠）的受精卵中，并將注射后受精卵移植到假孕雌鼠子宮中，獲得F0代小鼠，PCR方法鑒定F0代小鼠的基因型。F8基因敲除F1代雜合子小鼠（F8-/+）由F0代陽性小鼠與C57BL/6小鼠交配獲得，鑒定引物對P1/P2序列信息見表3，PCR條件為 ：94℃/3 min ；35 個循環(huán)的 98℃/15 s，60℃/15 s，68℃/1 min；68℃/5 min。F2代F8基因敲除純合子小鼠F8-/-由F1代雜合子小鼠自交獲得，基因型鑒定策略同F(xiàn)1代小鼠。

表3 引物序列信息Table 3 Primer sequence information

1.2.4 F8-/-小鼠表型檢測

1.2.4.1 實驗動物處理 隨機選擇5 只8周齡F8-/-雄鼠及其同窩野生型（WT）雄鼠，異氟烷麻醉后心臟采血，用3.8%檸檬酸鈉作為抗凝劑，按9 份血和1 份抗凝劑的比例立即充分混勻，離心取血漿用于后續(xù)APTT、FIB及ELISA實驗，然后分別取心、肝、脾、肺和腎用于后續(xù)實驗。

1.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 按照Trizol試劑說明書，分離組織心、肝、脾、肺、腎并抽提總RNA，按照2 μg總量進行定量，隨后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，以β-Actin作為內(nèi)參，采用RT-PCR對F8基因在F8-/-小鼠及WT小鼠中各組織的mRNA表達情況進行測定。反應(yīng)條件為：95℃/5 min；32個循環(huán)的 95℃/30 s，60℃/35 s，72℃/30 s；72℃/5 min。引物信息見表4

表4 逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列Table 4 Reverse transcription PCR primer sequences

1.2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 按照 Mouse Factor Ⅷ ELISAKit說明書進行酶聯(lián)免疫吸附測定，檢測小鼠血漿中F8的含量。簡述如下：ELISA檢測板室溫平衡；用樣品稀釋液梯度稀釋標準品及血清樣品；隨后每個孔依次加入等體積標準品及血清樣品，37℃孵育90 min；不清洗，每個孔立即加入生物素標記抗體檢測工作液，37℃孵育60 min；洗滌液清洗后每個孔加入辣根過氧化物酶（horseadish peroxidase，HRP）偶聯(lián)工作液，37℃孵育30 min；洗滌液清洗后每個孔加入底物測試液后至加樣孔變?yōu)樗{色，加入終止液終止，30 min內(nèi)于450 nm波長下讀取吸光值，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.2.4.4 小鼠凝血功能檢測 對F8-/-小鼠與WT小鼠進行眼內(nèi)靜脈竇采血取血漿，24 h后按照人凝血因子Ⅷ說明書所需因子Ⅷ（IU）=0.5×小鼠體重（kg）×60%（所需提升的因子Ⅷ活性水平的百分比，按正常值的%計）計算給藥劑量，對小鼠進行靜脈注射，30 min后采血取血漿，按照1.2.4.5-1.2.4.7方法進行后續(xù)凝血功能檢測。

1.2.4.5 活化部分凝血活酶時間檢測（activated partial thromboplastin time，APTT） 按照活化部分凝血酶時間測定試劑盒說明書檢測小鼠血漿中的APTT。簡述如下：APTT試劑和0.025 mol/L氯化鈣，分別預(yù)溫37℃并充分混勻；在37℃預(yù)熱待測血漿2 min，加入等體積APTT試劑到血漿中，開始計時；37℃預(yù)熱5 min；加入等體積0.025 mol/L氯化鈣，記錄凝固形成時間（s）并分析。

1.2.4.6 纖維蛋白原含量檢測（fibrinogen，F(xiàn)IB） 按照纖維蛋白原測定試劑盒說明書檢測小鼠血漿中的FIB含量。簡述如下：梯度標準品稀釋后預(yù)溫2 min，加入室溫下的凝血酶試劑到37℃預(yù)溫的樣本中并記錄測定的凝固時間，繪制雙對數(shù)定標標準曲線；用咪唑鹽緩沖液（imidazole buffer solution，IBS）按1/10 倍稀釋小鼠血漿，加入凝血酶試劑記錄凝固時間，從上述標準曲線中找到相應(yīng)纖維蛋白原的含量。

1.2.4.7 滴血實驗 將小鼠尾巴固定，剪下尾巴末端處2 mm，血液滴于濾紙上，記錄60 s內(nèi)形成的血斑大小，采用Image J軟件分析血斑灰度值。

1.2.4.8 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均以Mean ± SEM表示。數(shù)據(jù)分析和繪圖使用Graphpad8.0軟件，數(shù)據(jù)組間比較采用t值檢驗，當P＜0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 F8 -/-小鼠的制備

圖1所示為F8-/-小鼠構(gòu)建策略。將體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得Cas9 mRNA和sgRNA通過顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，共注射了150 枚受精卵。將注射后的受精卵移植到5只假孕母鼠中，出生20只小鼠（出生率為13.3%），即為F0代小鼠。F0代小鼠基因型鑒定策略圖如圖2-a所示。經(jīng)PCR鑒定及PCR產(chǎn)物測序確認，共獲得16只F0代陽性小鼠（陽性率為80%），其中雄鼠6只，雌鼠10只。F0代陽性小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配獲得F1代敲除雜合子小鼠；F1代敲除雜合子小鼠自交獲得F2代敲除小鼠，經(jīng)PCR鑒定加產(chǎn)物測序確定獲得純合子小鼠（F8-/-小鼠）。經(jīng)測序確認，獲得的F8基因敲除小鼠缺失207 293個堿基對。敲除后的具體序列信息如表5所示。基因型鑒定代表圖如圖2-b和2-c所示。

表5 WT小鼠和F8-/-敲除小鼠的序列信息Table 5 Sequence information of wild type and F8-/-mice genotype

圖1 F8 -/-小鼠基因敲除策略Fig.1 Knockout strategy of F8 -/- mice

圖2 F8-/-基因敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果Fig.2 Genotype results of F8-/- gene knockout mice

2.2 F8 -/-小鼠mRNA水平驗證

RT-PCR實驗在RNA水平上檢測F8-/-小鼠各個主要組織中F8基因的敲除效果。RT-PCR結(jié)果如圖3所示：WT小鼠F8在心、肝、脾、肺、腎中均有不同水平表達（圖3-a）；F8-/-小鼠的心、肝、脾、肺和腎組織中均未能檢測到F8 mRNA 的信號，F(xiàn)8基因在F8-/-小鼠中表達水平顯著低于WT小鼠（****P＜0.000 1）（圖3-b）；對肝組織RT-PCR結(jié)果進核酸電泳鑒定分析，與WT小鼠相比，F(xiàn)8-/-小鼠在核酸電泳中無明顯電泳條帶（圖3-c）。

圖3 F8 -/-小鼠F8 mRNA 相對表達水平Fig.3 Analysis of relative mRNA expression in F8-/- mice

2.3 F8 -/-小鼠蛋白水平驗證

ELISA實驗檢測小鼠血漿中的F8蛋白表達情況，結(jié)果如圖4所示：5 只WT小鼠血漿中F8蛋白平均表達量為（3.10±1.62）ng/mL，5 只F8-/-小鼠中有4 只已檢測不到F8蛋白表達值，另外1 只F8-/-小鼠F8蛋白表達值為0.072 2 ng/mL，F(xiàn)8-/-小鼠F8蛋白表達均值顯著低于WT小鼠（**P＜0.01）。

圖4 F8-/-小鼠F8蛋白相對表達水平Fig.4 Relative expression of F8 protein in F8-/- mice

2.4 F8 -/-小鼠凝血功能測定

FIB實驗測定小鼠血漿中纖維蛋白原的濃度。F8-/-小鼠的FIB結(jié)果如圖5-B所示：F8-/-小鼠FIB均值為（126±23）mg/dL，WT小鼠FIB均 值為（220±80）mg/dL，F(xiàn)8-/-小鼠的FIB濃度比WT小鼠顯著降低（*P ＜0.05）。

APTT實驗測定小鼠血漿的凝固時間。如圖5-A所示，按照F8恢復(fù)到正常值的60%人凝血因子FⅧ計算給藥劑量并對小鼠進行尾靜脈注射，30 min后眼內(nèi)靜脈竇采血進行凝血檢測。F8-/-小鼠的APTT結(jié)果如圖5-C所示：尾靜脈注射給予人凝血因子Ⅷ治療前，F(xiàn)8-/-小鼠APTT均值為（63.0±8.5）s，WT小鼠APTT均值為（25.3±2.5）s，F(xiàn)8-/-小鼠血漿凝固時間比WT小鼠顯著延長（****P＜0.000 1），說明F8-/-小鼠的凝血功能存在嚴重障礙；給予人凝血因子Ⅷ治療后，F(xiàn)8-/-小鼠的APTT值恢復(fù)到WT小鼠水平。

圖5 F8 -/-小鼠的APTTFig.5 APTT results of F8-/- mice

滴血實驗測定小鼠注射凝血因子Ⅷ后的出血情況。血斑圖結(jié)果見圖6，統(tǒng)計結(jié)果如圖7所示：F8-/-小鼠注射生理鹽水灰度均值為26 309±1 333，注射凝血因子Ⅷ后均值為40 713±9 005，F(xiàn)8-/-小鼠注射凝血因子Ⅷ后出血量顯著降低（**P＜0.01）。

圖6 F8-/-小鼠滴血實驗Fig.6 F8 -/- mice blood drop test

圖7 F8 -/-小鼠的血斑灰度值Fig.7 Gray value of blood spot of F8-/- mice

3 討論

1992年Martin Hooper等［12］通過小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）基因打靶技術(shù)，成功獲得了血友病A小鼠模型；1997年研究人員采用基因敲除方法將小鼠F9（coagulation factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ）基因敲除，成功建立了血友病B小鼠模型［13］。血友病小鼠模型的成功構(gòu)建在對于血友病的研究和藥物研發(fā)發(fā)揮了重要作用。

以往構(gòu)建基因缺陷小鼠模型的方法是在小鼠的受精卵中顯微注射F8大片段敲除的質(zhì)粒，通過同源重組的方式來獲得基因敲除小鼠，從而獲得血友病模型［14-16］。但該方法耗時周期長，敲除效率不高。本文采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源重組（nonhomologous end joining，NHEJ）基因敲除技術(shù)［17-18］，其效率比傳統(tǒng)同源重組系統(tǒng)高4-6倍以上［19］，能夠高效的將特異性靶位點的DNA雙鏈打斷，通過NHEJ修復(fù)方式，在斷裂處隨機引入堿基的缺失或插入，基因產(chǎn)生移碼突變［20］。

我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將F8基因1-26號外顯子（exon1-26）區(qū)域進行有效敲除，使該編碼區(qū)域207 293 bp的基因序列缺失，造成F8基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失，成功構(gòu)建了F8基因全身性敲除小鼠模型，并省略了傳統(tǒng)基因敲除方法中胚胎干細胞打靶的步驟［15］，同時該品系后續(xù)繁育保種過程中具有遺傳穩(wěn)定性的特點，證明我們的設(shè)計方案是一個高效快速獲得 F8基因敲除小鼠的方法。

對小鼠進行F8基因表達水平檢測，其結(jié)果表明：RT-PCR檢測證實F8-/-小鼠心、肝、脾、肺和腎中幾乎檢測不到F8 mRNA表達，證明F8基因在mRNA 水平實現(xiàn)了敲除；ELISA實驗檢測證實，F(xiàn)8-/-小鼠血漿中僅能檢測到試劑本底水平F8蛋白的表達，證實F8基因在蛋白水平實現(xiàn)敲除；對小鼠F8基因進行表型驗證，APTT實驗中F8-/-小鼠血漿凝固時間顯著高于WT小鼠，給予人凝血因子Ⅷ后，F(xiàn)8-/-小鼠血漿凝固時間可恢復(fù)到正常水平，斷尾后形成的血斑灰度均值顯著低于給藥前，同時F8-/-小鼠血漿中FIB的含量顯著低于WT小鼠，F(xiàn)8-/-小鼠出現(xiàn)明顯凝血功能障礙表型。這些數(shù)據(jù)表明我們已成功構(gòu)建F8基因敲除小鼠品系。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了F8基因敲除小鼠品系，在mRNA和蛋白水平以及凝血功能表型檢測方面對該基因的敲除效果進行了驗證，為F8基因功能研究提供了新的研究模型，也為血友病A的治療提供了新型藥物測試疾病動物模型。

4 結(jié)論

本研究基于CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了F8基因敲除小鼠模型，并進行了初步的表型研究，為血友病A的研究提供了新的小鼠模型。