金文剛，趙 萍，劉俊霞，蘭阿峰，陳德經(jīng)，裴金金,*，高瑞昌,2,4,*

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建培育國家重點實驗室，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學(xué) 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001；4.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

大鯢（Andrias davidianus）是我國人工繁育與養(yǎng)殖技術(shù)較為成熟的特種水生野生動物之一，具有極高的食用和藥用價值[1-2]。目前，大鯢已在我國10多個省市實現(xiàn)了規(guī)?；B(yǎng)殖，但大鯢深加工與開發(fā)利用仍是養(yǎng)殖業(yè)提質(zhì)增效的瓶頸[3-4]。當(dāng)前，大多數(shù)研究集中在大鯢營養(yǎng)組成[2,5]、蛋白質(zhì)特性[6-8]、功能活性物質(zhì)[8-10]、貯藏保鮮[11-12]、熱加工方便食品[5,13-14]等方面。一些養(yǎng)殖龍頭企業(yè)也順勢推出了大鯢分割肉、大鯢蛋白肽、大鯢油以及日化用品（面膜、化妝品等），極大促進了大鯢產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和轉(zhuǎn)型發(fā)展。

冷鮮肉是指畜禽宰殺后的胴體經(jīng)過冷卻維持在0～4 ℃，并在此溫度范圍內(nèi)加工、貯運、銷售的肉類，一般都經(jīng)歷了較充分的解僵成熟過程，其肌肉代謝與食用品質(zhì)的關(guān)系已得到較多闡釋[15-16]。隨著大鯢分割加工的產(chǎn)業(yè)化，大鯢分割鮮肉已成為最重要的初加工產(chǎn)品之一[17]。大鯢外形丑陋，分割鮮肉的上市消除了消費者宰殺大鯢的恐懼心理，但還需要在脫腥、品質(zhì)提升和延長貨架期等方面持續(xù)深入研究。辛茜等[17]利用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析了大鯢皮、肉和爪3 個部位的腥味成分。金文剛等[18]采用氣相離子遷移色譜技術(shù)鑒定了大鯢不同可食部位（頭、背、尾、腹、爪和肝臟）的揮發(fā)性氣味成分及其差異。Hu等[12]研究了大鯢分割鮮肉通過不同比例氣調(diào)包裝冷藏過程中理化和食用品質(zhì)的變化，探討延長大鯢冷鮮肉的貨架期。然而，大鯢宰后冷藏過程中肌肉代謝與肉品新鮮度、質(zhì)構(gòu)、色澤、保水性、感官品質(zhì)的相關(guān)性亟需進一步研究。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后，系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它是以高通量檢測技術(shù)和多元數(shù)據(jù)處理為手段，通過研究小分子代謝物（分子質(zhì)量＜1 500 Da）的變化，進而探究其代謝機制的新興科學(xué)[19]。代謝組學(xué)技術(shù)包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)、GC-MS和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)等[20]。GC-MS具有較高的分辨率、重現(xiàn)性和檢測靈敏度，可實現(xiàn)多組學(xué)混合物中未知組分的定性分析，是目前代謝組學(xué)研究中最成熟的分析技術(shù)[21]。Argyri等[22]把頂空固相微萃取-GC-MS作為評估不同包裝和溫度條件下貯存的碎牛肉變質(zhì)動態(tài)研究的工具，該研究通過化學(xué)計量學(xué)分析揮發(fā)性化合物的變化評估肉類變質(zhì)。Mallouchos等[23]利用GC-MS對海鯛冷藏過程中的代謝物進行研究，發(fā)現(xiàn)一些差異代謝物可作為海鯛新鮮度流失和腐敗變質(zhì)的潛在生物標(biāo)志物。

課題組前期探究了大鯢肉冷藏過程中揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、菌落總數(shù)等理化特性的變化，并明確了冷藏期間主要致腐微生物菌屬為假單胞菌屬、氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium和沙雷氏菌屬[24-25]。然而采用代謝組學(xué)技術(shù)研究大鯢肉冷藏過程中肌肉代謝產(chǎn)物的變化還鮮見報道。為此，本研究采用GC-MS技術(shù)分析大鯢肉在不同冷藏時間代謝物的變化，并結(jié)合多元統(tǒng)計方法篩選差異代謝物，分析相關(guān)代謝通路并探究理化指標(biāo)與差異代謝物的相關(guān)性，以期為豐富大鯢肉冷藏過程中肌肉代謝信息以及冷鮮肉品質(zhì)控制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活健康子二代大鯢3 尾（（2.5±0.36）kg）漢中市龍頭山大鯢養(yǎng)殖基地；妙潔保鮮膜（材質(zhì)為聚乙烯，溫度范圍：－60～100 ℃） 市購。

甲醇（色譜級）、正己烷（色譜級）、吡啶、O-甲基羥胺鹽酸鹽（純度為97%）、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）（含1%三甲基氯硅烷） 德國CNW公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司；辛酸甲酯C8:0、壬酸甲酯C9:0、癸酸甲酯C10:0瑞典Larodan公司；月桂酸甲酯C12:0、肉豆蔻酸甲酯C14:0、棕櫚酸甲酯C16:0、硬脂酸甲酯C18:0美國Nu-chek公司；花生酸甲酯C20:0、山崳酸甲酯C22:0、木蠟酸甲酯C24:0德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-649WE冰箱 山東青島海爾股份有限公司；T-A3204B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；F-060SD超聲波清洗機 深圳福洋科技集團有限公司；TYXH-1渦旋振蕩器 上海汗諾儀器有限公司；JXFSTPRP-24/32樣品研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器 江蘇省太倉市華美生化儀器廠；TGL-16MS高速冷凍離心機 上海盧湘儀儀器有限公司；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；DZF-6021真空干燥箱上海慧泰儀器制造有限公司；Trace 1310/TSQ 9000 GC-MS儀美國賽默飛世爾科技公司；DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

鮮活大鯢經(jīng)放血、熱燙（95 ℃處理約1 min）、刮黏液、去內(nèi)臟，清洗后用聚乙烯袋20 min內(nèi)運回實驗室，去頭、皮、四肢、尾，取背肌并切成約5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的肉塊，放入黑色托盤中并用保鮮膜密封，置于4 ℃冰箱中冷藏0～8 d?；谇捌谘芯恐写篥F肉冷藏期間TVB-N、菌落總數(shù)、微生物多樣性等信息[24-25]，分別于第0（新鮮）、2（新鮮與貨架期之間）、4（貨架期）、8天（腐敗）取樣，分別記為D0、D2、D4、D8，每個時間點取6 個平行。定時將樣品取出，置于超凈工作臺上，去除保鮮膜，用事先滅菌好的剪刀將肉樣剪碎，混勻，用鑷子裝在15 mL離心管中，置于－80 ℃冰箱貯藏待用。

1.3.2 樣品前處理

參考Li Gang[26]和Li Xiaoou[27]等的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取30 mg組織樣品到1.5 mL離心管中，依次加入20 μL內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/mLL-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液）和600 μL甲醇-水（4∶1，V/V）溶液。加入兩個小鋼珠，在－80 ℃冰箱中放置2 min，放入研磨機中60 Hz下研磨2 min，加入120 μL氯仿，渦旋2 min，然后置于冰水浴超聲，40 kHz下提取10 min。－20 ℃靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液裝入玻璃衍生瓶中。質(zhì)控（quality control，QC）樣品由所有樣品的提取液等體積混合制備而成，QC體積與樣品相同。用離心濃縮干燥器揮干樣品，向玻璃衍生小瓶中加入80 μL 15 mg/mL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，渦旋振蕩2 min，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中90 min，進行肟化反應(yīng)。將樣品取出，再加入50 μL BSTFA（含1%三甲基氯硅烷）衍生試劑和20 μL正己烷，分別加入10種內(nèi)標(biāo)（10種脂肪酸甲酯，均為氯仿配制）各10 μL，渦旋振蕩2 min，于70 ℃反應(yīng)60 min。取出樣本，室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學(xué)分析。

1.3.3 GC-MS條件

色譜條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度≥99.99%），流速1.2 mL/min；進樣口溫度300 ℃；進樣量1 μL，不分流進樣；溶劑延遲5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持0.5 min；以8 ℃/min升溫至125 ℃，保持5 min；5 ℃/min升溫至210 ℃，保持5 min；10 ℃/min升溫至270 ℃，保持5 min；20 ℃/min升溫至305 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，溫度330 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將GC-MS得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Analysis Base File Converter軟件轉(zhuǎn)換為abf格式文件，之后導(dǎo)入MS-DIAL軟件（下載途徑：http://prime.psc.riken.jp/）進行峰檢測、峰識別、MS2Dec反卷積、定性、峰對齊、濾波、缺失值插值等一系列處理。通過保留時間，精確分子質(zhì)量，與LUG數(shù)據(jù)庫（鹿明生物自主研發(fā)的數(shù)據(jù)庫）匹配相似度對化合物定性[28]，最終導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)矩陣，用于后續(xù)分析。使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；使用SPSS 25軟件進行顯著性分析，采用Duncan法進行多重比較（P＜0.05，差異顯著）；使用SIMCA 14.1軟件進行質(zhì)控、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）；使用Origin 2021軟件進行繪圖；結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pathway數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）進行代謝通路富集相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢肉不同冷藏期樣品數(shù)據(jù)采集質(zhì)控分析

將QC樣品的總離子流圖進行譜圖重疊比較，如圖1所示，QC樣品的基線穩(wěn)定，各色譜峰的保留時間基本一致，說明儀器數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性較好[29]，在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小。

圖1 大鯢肉冷藏過程中QC樣品的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of QC samples of giant salamander meat during cold storage

PCA作為一種非監(jiān)督數(shù)據(jù)分析方法，借助于一個正交變換，將其分量相關(guān)的原隨機向量轉(zhuǎn)化成其分量不相關(guān)的新隨機向量，使它們盡可能多地反映原有的變量信息，達到降維目的，同時對系統(tǒng)穩(wěn)定性進行評價[30]。理論上QC樣品都相同，但是物質(zhì)提取、檢測分析過程中的系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致QC樣品間有微小差異，差異越小說明整個方法穩(wěn)定性越好數(shù)據(jù)質(zhì)量越高，表現(xiàn)為在PCA得分圖上QC樣品聚集在一起。所有樣品經(jīng)7 次交叉循環(huán)驗證的PCA得分圖，如圖2所示，大鯢肉QC樣品相對聚集，QC樣品間差異較小，實驗過程中儀器檢測穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)可靠。

圖2 大鯢肉QC組和不同冷藏時期樣品PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot of QC sample and experimental samples with different storage time

2.2 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的多元統(tǒng)計分析

2.2.1 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的PCA

對代謝物進行PCA，可總體反映樣本組間和組內(nèi)差異，觀察樣本間的總體分布趨勢，判斷可能存在的變異點。如圖3所示，說明擬合性較好，Q2=0.566，與相差較小，說明擬合方程的穩(wěn)定性較好。此外，4 個冷藏期大鯢肉樣品中除冷藏8 d的兩個樣品外，其余樣品都在95%置信區(qū)間內(nèi)，冷藏0、2、4 d的樣品在置信區(qū)間內(nèi)相對聚集在第2、3象限內(nèi)，可能是由于樣品的代謝物具有相似性[30]。

圖3 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的PCA得分圖Fig. 3 PCA score plot of metabolites in giant salamander meat with different storage time

2.2.2 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的PLS-DA

圖4 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的PLS-DA得分圖（A）和響應(yīng)排序檢驗（B）Fig. 4 PLS-DA score plot (A) and response permutation test (B) of metabolites in giant salamander meat with different storage time

雖然PCA能夠直觀顯示樣本間的分組、變化趨勢和相似性關(guān)系，但差異變量會分布在PC上，無法在后面的分析中將其剔除進行更準(zhǔn)確的分析，同時對相關(guān)性較小的變量不敏感。PLS-DA作為一種有監(jiān)督的判別統(tǒng)計方法，加入了分組變量可彌補PCA方法的不足。PLS-DA模型中分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，越接近于1表示模型擬合度越好。如圖4A所示，與圖3相比，各冷藏期樣品間聚集相對集中。Q2值分別為0.793、0.978、0.890，均大于0.5且接近1，說明建立的模型符合樣品數(shù)據(jù)的真實情況并且能很好地解釋樣本之間的差異。為防止模型過擬合，采用200 次響應(yīng)的置換檢驗對模型進行驗證，其中R2、Q2為回歸線與Y軸的截距值，R2表示模型能夠解釋的方差總和，Q2表示模型的預(yù)測能力，使用響應(yīng)排序置換檢驗時，一般要求Q2小于0。由圖4B可知，R2=0.675，Q2=－0.38，回歸線呈線性關(guān)系，Q2小于0，沒有出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，表明模型可靠，可用于后續(xù)分析。此外，由圖4A可知，冷藏8 d與冷藏0、2、4 d相比差異較大[26]，這可能是微生物在大鯢肉表面分布不均，大鯢肉的品質(zhì)發(fā)生明顯的變化所致[25]。

2.3 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物的篩選與鑒定

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法篩選組間差異代謝物。根據(jù)PLS-DA模型分析結(jié)果，篩選PC1的VIP值不低于1、t檢驗P值小于0.05的差異代謝物進行匯總，如表1所示。同時繪制所有差異代謝物的層次聚類熱圖，如圖5所示。

表1 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物篩選結(jié)果Table 1 Results of screening of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

續(xù)表1

圖5 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物層次聚類熱圖Fig. 5 Hierarchical clustering heatmap of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

由表1可知，大鯢肉在冷藏過程中的差異代謝物共計69種，包括有機酸類及其衍生物（21種）、氨基酸類及其衍生物（14種）、糖類及其衍生物（7種）、核苷酸類及其衍生物（10種）、胺類及其衍生物（6種）和其他類（11種）。由圖5可知，層次聚類熱圖可將不同冷藏期大鯢肉樣品分為3 類，即冷藏前期（0～2 d）、冷藏中期（4 d）、冷藏后期（8 d），冷藏8 d與冷藏0、2、4 d具有明顯差異。

圖6 不同冷藏時間大鯢肉中各類化合物累積相對豐度變化趨勢圖Fig. 6 Trend of cumulative relative abundance of various compounds in giant salamander meat during storage

有機酸類及其衍生物是大鯢肉冷藏過程中代謝物的重要組成部分，此類物質(zhì)一部分來源于原料，另一部分來源于冷藏過程中肌肉的生化反應(yīng)及微生物代謝[31]，由圖6可知，有機酸類及其衍生物的累積相對豐度在冷藏0～4 d增加幅度較平緩，而在冷藏4～8 d急劇增加。由表1可知，有機酸類及其衍生物中葡萄糖酸、二甲基尿酸和異己糖酸的VIP值較大，分別為3.35、3.34和3.06，其余有機酸類代謝物的VIP值均小于2。丙酮酸是冷藏初期0 d樣品中有機酸類化合物中相對豐度最高的代謝物，包括丙酮酸以及其余有機酸類及其衍生物相對豐度在整個冷藏過程中呈現(xiàn)波動，主要原因可能是在冷藏8 d微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，優(yōu)勢菌屬發(fā)生了演替，優(yōu)勢菌經(jīng)過三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝等代謝途徑，與其相關(guān)的差異代謝物相對豐度出現(xiàn)變化[32]。丙酮酸是氨基酸代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點化合物，能通過各種支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用形成醛、酮、醇，并參與微生物代謝[33]。富馬酸、蘋果酸在冷藏過程中相對豐度呈現(xiàn)一定波動，可能與細菌菌相構(gòu)成變化有關(guān)[25]。同時，前期研究結(jié)果也表明，在冷藏8 d大鯢肉中的主要優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬[25]，有機酸或氨基酸是假單胞菌屬的首選碳源[34]。

氨基酸類及其衍生物主要來自冷藏過程中細菌的蛋白酶對原料中蛋白質(zhì)的酶促降解以及一些其他微生物的自溶作用[31]，由圖6可知，氨基酸類及其衍生物的累積相對豐度在冷藏0～4 d呈先增后降趨勢，而在冷藏4～8 d急劇增加。由表1可知，氨基酸類及其衍生物中L-高絲氨酸、L-焦谷氨酸和甘氨酸在第0天相對豐度較高，而且除了甘氨酸在冷藏0～8 d內(nèi)相對豐度顯著增加外（P＜0.05），其余氨基酸類代謝物在冷藏期間呈現(xiàn)一定波動規(guī)律。氨基酸類代謝物絕大部分是蛋白質(zhì)代謝、降解和生物合成的中間產(chǎn)物，能為微生物的生長提供氮源。L-高絲氨酸的VIP值為2.77（表1），是氨基酸類及其衍生物中相對豐度最高且波動幅度較大的代謝物，對此類代謝物整體變化的趨勢和幅度具有主導(dǎo)作用。L-高絲氨酸是蘇氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚生物合成的中間產(chǎn)物，也存在于細菌的肽聚糖中，特別是冷藏2 d大鯢肉樣品中L-高絲氨酸相對豐度顯著高于冷藏0 d樣品（P＜0.05），可能是由于蘇氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚的生物合成受阻進而導(dǎo)致L-高絲氨酸的積累；而在冷藏4 d和8 d樣品中L-高絲氨酸相對豐度呈先降后升的波動變化，主要由細菌的生長、繁殖所致[24-25,34]。甘氨酸、L-絲氨酸主要貢獻甜味，L-蛋氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸主要貢獻苦味[35]。L-蛋氨酸、甘氨酸、L-異亮氨酸等酸性氨基酸相對豐度在冷藏期的動態(tài)變化是樣品自溶和細菌腐敗協(xié)同的結(jié)果；L-賴氨酸、L-絲氨酸相對豐度在冷藏2～8 d降低可能表明他們從肌肉蛋白質(zhì)中溶解速度比轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物速度更慢[23]。L-蛋氨酸經(jīng)分解代謝會形成甲硫醇、二甲基硫化物，這些物質(zhì)與冷藏后期異味的形成密切相關(guān)[36]。

糖類及其衍生物是碳源的來源之一，在糖酵解過程被消耗，通過碳水化合物代謝途徑為微生物提供必需的能量[37]，由圖6可知，大鯢肉樣品冷藏過程中糖類及其衍生物累積相對豐度變化較小。由表1可知，除了半乳糖、麥芽三糖的VIP值相對較高，分別為1.88、1.62，其余代謝物VIP值均低于1.5。糖類在冷藏初期主要發(fā)生有氧氧化，生成CO2和H2O，同時產(chǎn)生三磷酸腺苷；隨著冷藏時間的延長，糖的無氧酵解逐漸發(fā)揮主導(dǎo)作用，代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷和丙酮酸，引起糖類在冷藏過程中逐漸減少，丙酮酸積累。大鯢肌肉中糖或糖磷酸鹽濃度的變化會導(dǎo)致鮮魚氣味逐漸流失，同時碳水化合物的減少會導(dǎo)致有機酸（如琥珀酸）和醇類（如乙醇）的增加[35]。

核苷酸類及其衍生物中嘌呤類化合物是細胞中最為豐富的代謝物，對提供細胞能量和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)起著重要作用，由圖6可知，大鯢肉樣品冷藏過程中核苷酸類及其衍生物累積相對豐度在整個冷藏期間呈緩慢下降的趨勢。由表1可知，黃嘌呤、鳥嘌呤的VIP值相對較高，分別為1.97、1.66，其余核苷酸類化合物的VIP值均低于1.6。肌苷、腺苷、次黃嘌呤的相對豐度在冷藏0 d時相對較高。嘌呤代謝的中間產(chǎn)物中，黃嘌呤、黃嘌呤核苷在冷藏后期相對豐度顯著增加（P＜0.05）。核苷酸類及其衍生物的變化，標(biāo)志著大鯢肉的新鮮度逐漸流失。次黃嘌呤一方面由三磷酸腺苷降解產(chǎn)生（即自溶），另一方面由細菌活動產(chǎn)生。Hong等[38]指出一些細菌如假單胞菌屬可將肌苷、肌苷酸轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤，且細菌次黃嘌呤的形成速度高于自溶。次黃嘌呤最終通過腐敗菌的生長繁殖轉(zhuǎn)化為黃嘌呤、尿酸等環(huán)狀裂解產(chǎn)物[38-39]。嘧啶代謝的中間產(chǎn)物二氫尿嘧啶，終產(chǎn)物為尿素，嘧啶核苷酸中嘧啶堿的合成原料主要來自谷氨酰胺、CO2和天冬氨酸[40]。

胺類物質(zhì)主要包括煙草胺、胍丁胺、5-羥基色胺等，由圖6可知，大鯢肉樣品冷藏過程中胺類物質(zhì)累積相對豐度變化相對較小。由表1可知，煙草胺VIP值最大，為3.10，其余胺類代謝物VIP值均小于1.9；煙酰胺的相對豐度在冷藏0 d相對較高。其中，胍丁胺主要參與精氨酸、脯氨酸代謝，5-羥基色胺、5-甲氧基色胺主要參與色氨酸代謝，煙酰胺主要參與煙酸和煙酰胺代謝。

其他類化合物主要包括尿素、表兒茶素、沒食子兒茶素、曲唑酮、水楊醛、腎上腺素等11種物質(zhì)（表1），這類物質(zhì)累積相對豐度在冷藏期間呈輕微增加趨勢（圖6）。尿素是最簡單的有機化合物之一，是哺乳動物和某些魚類體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝分解的主要含氮終產(chǎn)物。由表1可知，尿素VIP值（1.47）在其他類化合物中較高，冷藏0 d樣品相對豐度也較高，隨著冷藏時間延長其相對豐度呈現(xiàn)增加趨勢，在第4天達到峰值而在第8天有所降低，這是蛋白質(zhì)逐漸降解代謝積累的結(jié)果。鞘氨醇是許多鞘脂類化合物的主體，包括神經(jīng)酰胺，這些鞘脂主要參與多種細胞信號傳導(dǎo)和病理功能，特別是在細胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)過程中[41]。

2.4 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的代謝通路富集分析

KEGG是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫[42]。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行富集分析，選擇P＜0.05的代謝通路繪制氣泡圖，如圖7所示，共富集到21 條代謝通路。其中，氣泡的大小表示富集代謝物個數(shù)的多少，氣泡越大表示富集的代謝物越多；富集因子為顯著差異代謝物個數(shù)與該通路中總代謝物個數(shù)之比，富集因子越大，說明富集程度越大；顏色由綠到藍表示P值依次降低。由圖7可知，富集代謝產(chǎn)物最多、P值較小的前5條代謝通路分別為嘌呤代謝、氨酰-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)。利用KEGG等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫映射，得到具有顯著差異（P＜0.05）的代謝物33種，具有極顯著差異（P＜0.01）的代謝物32種。具有顯著差異的21 條代謝通路和33種代謝物的富集關(guān)系如圖8所示。

圖7 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物的KEGG富集圖Fig. 7 KEGG enrichment analysis of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

圖8 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物及其代謝通路的富集關(guān)系圖Fig. 8 Relationship between differential metabolites and metabolic pathway enrichment of giant salamander meat with different storage time

由圖8可知，丙酮酸、琥珀酸、富馬酸、甘氨酸、絲氨酸是參與代謝通路較多的化合物，在連接各通路和代謝物上具有重要的作用，所涉及到的代謝通路中絕大部分為氨基酸代謝通路和能量代謝通路。將所有差異代謝物按它們在冷藏過程中的變化趨勢分為3 類：A類化合物：在冷藏8 d相對豐度顯著增加（如圖8紅色方框所示）；B類化合物：在冷藏0、2 d相對豐度較高（如圖8藍色方框所示）；C類化合物：沒有明確的變化趨勢（如圖8綠色方框所示）。對3 類化合物進行累積分析，如圖9所示。

圖9 不同冷藏期大鯢肉差異代謝物累積分析Fig. 9 Change in relative abundance of differential metabolites in giant salamander meat during storage

由圖9可知，A類化合物的累積相對豐度在冷藏0、2、4 d內(nèi)輕微增加，而冷藏4～8 d上升幅度急增，以氨酰-tRNA代謝通路中差異代謝物最多。有研究將氨酰-tRNA合成酶作為抗菌類藥物的靶點[43]，該類化合物在冷藏4～8 d快速增加與冷藏后期優(yōu)勢腐敗微生物的大量繁殖及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。B類化合物累積相對豐度在0～8 d冷藏期內(nèi)呈平穩(wěn)下降趨勢，以嘌呤代謝通路中差異代謝物最多；該類化合物在整個冷藏過程中的下降趨勢與大鯢肉在冷藏過程中鮮度的流失密切相關(guān)。C類化合物中富馬酸、尿素、甘油酸、L-高絲氨酸參與的代謝途徑較多，其他化合物參與的代謝途徑較少；C類化合物累積相對豐度在冷藏過程中呈一定的波動性，可能是由能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、中間產(chǎn)物和微生物菌群演替交互作用所致[24-25,34]。

2.5 不同冷藏時間大鯢肉中代謝物的相關(guān)性分析

選取圖9中A類和B類化合物中相對豐度大于1的代謝物與課題組前期研究結(jié)果（TVB-N值、菌落總數(shù)、致腐微生物菌屬）[24-25]進行Pearson相關(guān)性分析，如圖10所示。

由圖10可知，B1類化合物與TVB-N值、菌落總數(shù)、致腐微生物呈負相關(guān)；其中L-絲氨酸與假單胞菌屬、氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；L-賴氨酸與氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。A1類化合物與TVB-N值、菌落總數(shù)、致腐微生物呈正相關(guān)；除乙酰鳥氨酸外，均與TVB-N值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），以L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸的相關(guān)性較強（P＜0.01）；甘氨酸、丙酮酸、乙酰鳥氨酸與菌落總數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），以甘氨酸相關(guān)性較強（P＜0.01）。因此，可將L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸和甘氨酸作為大鯢肉冷藏品質(zhì)變化的潛在標(biāo)記物。已有報道采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量結(jié)合HPLC-MS對乳制品氨基酸的種類及含量進行分析[44]，此外通過傳感器陣列和納米姜黃素也可實現(xiàn)生物樣本中氨基酸的定量和分化[45]。大鯢肉冷藏期間品質(zhì)變化的上述潛在標(biāo)記物與新鮮度的直接關(guān)系還需要在實際冷藏環(huán)境下建立可行的標(biāo)記方法驗證其可靠性。

圖10 不同冷藏時間大鯢肉理化指標(biāo)與差異代謝物相關(guān)性分析Fig. 10 Correlation analysis between physicochemical indexes and differential metabolites in giant salamander meat during storage

3 結(jié) 論

采用GC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對不同冷藏時間（0、2、4、8 d）大鯢肉中的代謝物進行研究。結(jié)果表明，大鯢肉在冷藏過程中的差異代謝物共計69種，包括有機酸類及其衍生物（21種）、氨基酸類及其衍生物（14種）、糖類及其衍生物（7種）、核苷酸類及其衍生物（10種）、胺類及其衍生物（6種）和其他類（11種）。層次聚類熱圖可將不同冷藏期大鯢肉樣品分為3 類，即冷藏前期（0～2 d）、冷藏中期（4 d）和冷藏后期（8 d）。KEGG富集分析表明，在大鯢肉冷藏期間較為重要的代謝通路為嘌呤代謝、氨酰-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)。代謝通路映射及Pearson相關(guān)性分析表明，L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸和甘氨酸可作為大鯢肉品質(zhì)變化的潛在標(biāo)記物。