韓 曉，楊航宇，陳為凱，王 宇，王 軍，何 非

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

香氣是影響葡萄果實(shí)和葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，近年來一直是食品風(fēng)味化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外的諸多研究已經(jīng)在葡萄果實(shí)和葡萄酒中檢測到了1 300余種香氣物質(zhì)。各類香氣物質(zhì)的含量、性質(zhì)的差異以及彼此之間的相互作用關(guān)系，共同賦予葡萄果實(shí)和葡萄酒獨(dú)特的感官風(fēng)格[1]。釀酒葡萄香氣物質(zhì)主要包括醇類、酯類、醛類、酸類、萜烯類、C13-降異戊二烯類和甲氧基吡嗪類等，這些化合物的含量差異很大，不同物質(zhì)的含量變化在ng/kg～mg/kg之間，目前仍有一些物質(zhì)低于檢測限而無法檢測[2-4]。根據(jù)香氣物質(zhì)的存在形式可將其分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式。游離態(tài)香氣物質(zhì)自身具有揮發(fā)性，通過對葡萄汁的分析就可以直接檢測到，而結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，特別是糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)本身不具有揮發(fā)性，但可以在酶解或酸解的作用下轉(zhuǎn)變成具有揮發(fā)性的、游離態(tài)的香氣物質(zhì)。因此，研究葡萄果實(shí)中糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)對其釀造的葡萄酒香氣的表現(xiàn)也極為重要，但在有些研究中卻時常被忽略[5-6]。由此可見，游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類、含量、感官閾值及其之間的相互作用共同決定了葡萄酒的風(fēng)味。

在實(shí)際生產(chǎn)中，砧木嫁接是一種廣泛應(yīng)用的釀酒葡萄栽培技術(shù)手段，最初對于砧木的利用源于對根瘤蚜等病蟲害抗性的需求，隨后的研究也發(fā)現(xiàn)砧木對葡萄樹勢、物候期、光合作用、產(chǎn)量、果實(shí)和葡萄酒品質(zhì)等指標(biāo)也有重要的影響[7-13]。近年來，大量研究聚焦于不同砧木對釀酒葡萄果實(shí)和葡萄酒香氣的影響。Koundouras等[13]研究分別嫁接在‘1103P’和‘SO4’砧木上‘赤霞珠’葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)‘1103P’砧木的葡萄果實(shí)中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的含量較高。另有研究結(jié)果表明，中等長勢的‘Salt Creek’砧木上嫁接的‘赤霞珠’葡萄所釀造的葡萄酒中大馬氏酮和癸酸異戊酯的含量較高[14]。Wang Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)砧木‘110R’、‘Riparia Gloire’和‘SO4’可以顯著降低‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中酯類物質(zhì)的含量；此外，赤霞珠/SO4砧穗組合中的萜烯類化合物，特別是γ-萜品烯和α-萜品醇減少。砧木同樣可以影響葡萄酒香氣物質(zhì)的含量。例如：有研究發(fā)現(xiàn)，砧木‘110R’可以增加‘阿爾巴里諾’葡萄酒總香氣的濃度，其主要貢獻(xiàn)的香氣物質(zhì)為2-苯乙醇、癸酸、乙酯類、乙酸酯以及C13-降異戊二烯類物質(zhì)；而砧木‘SO4’可以增加‘阿爾巴里諾’葡萄酒中的揮發(fā)性脂肪酸物質(zhì)[16]。在‘美樂’葡萄酒中，發(fā)現(xiàn)砧木‘99R’和‘140R’可以增加葡萄酒中乙酯物質(zhì)的含量，自根苗釀造的葡萄酒中戊醇、己醇、(Z)-3-己烯醇、蘋果酸二乙酯和乙酰香草酮等物質(zhì)含量最低[17]。

‘丹娜’（Vitis viniferaL. cv. ‘Tannat’）是近年來在我國逐漸推廣的優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄品種，其釀造的葡萄酒單寧含量高，酒體強(qiáng)勁，具有較高的陳釀潛力。關(guān)于‘丹娜’葡萄酒香氣已有相關(guān)報道[18-19]，但是關(guān)于不同砧木嫁接對‘丹娜’葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)影響的報道目前較少。本研究以‘丹娜’自根苗作對照，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）研究‘1103P’、‘140R’、‘101-14’、‘3309C’、‘SO4’和‘貝達(dá)’6種砧木嫁接對‘丹娜’葡萄香氣物質(zhì)的影響，以明確不同砧穗組合與自根苗‘丹娜’葡萄果實(shí)香氣化合物積累的差異，旨在為實(shí)際生產(chǎn)中‘丹娜’嫁接砧木的選擇與應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本研究地點(diǎn)位于北京市海淀區(qū)白水洼路（40.14 °N，116.19 °E）中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實(shí)驗(yàn)站，實(shí)驗(yàn)地為平地。實(shí)驗(yàn)中‘丹娜’所嫁接的砧木分別為‘1103P’、‘140R’、‘101-14’、‘3309C’、‘SO4’和‘貝達(dá)’，以‘丹娜’自根苗作為對照；各砧木定植于2012年，于2013年夏季進(jìn)行綠枝嫁接，樹齡為3 a生嫁接苗?！つ取咸迅髡杷虢M合種植均為南北行向，行距和株距分別為2.5 m和1.2 m，南北行向，籬架，樹形為傾斜式單龍干，葉幕形為改良型VSP（M-VSP，即“廠”字形）。采用短枝修剪，葉幕高度和寬度保持在約120 cm和70 cm，留梢量為12～15新梢/延長米，灌溉方式為滴灌，采用常規(guī)葡萄園管理，灌溉、施肥和病蟲害控制等均按照相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2016—2017年連續(xù)兩年的氣象資料來源于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://data.cma.cn/），觀測點(diǎn)（40.23 °N，116.52 °E）與實(shí)驗(yàn)地直線距離約30 km。以“百粒果”的方法采收每個砧穗組合成熟期的葡萄果實(shí)樣品，每種樣品設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。樣品采集后迅速用液氮速凍，液氮保護(hù)下轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于-40 ℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

二氯甲烷（分析純）、酒石酸（分析純）、葡萄糖北京化工廠；己醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、(Z)-2-己烯醇等香氣標(biāo)準(zhǔn)品 瑞士Fluka公司；正己醛、壬醛、(E)-2-己烯醛、月桂烯、檸檬烯、里那醇、α-萜品醇、β-香茅醇、檸檬醛、香葉基丙酮、香葉醇、橙花醇、茶螺烷、β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮和4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)）等香氣標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；Cleanert PEP-SPE固相萃取柱（150 mg/6 mL）美國Bonna-Agela科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Micro 17R離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；6890-5975 GC-MS聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果實(shí)香氣化合物的提取

游離態(tài)香氣的提?。喝〉蜏兀?40 ℃）冰箱保存的葡萄果實(shí)80 g，去除果柄和種子，加入0.5 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯和1 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，液氮保護(hù)下破碎至粉末狀。4 ℃靜置浸漬4 h。在低溫離心機(jī)中，4 ℃、8 000 r/min迅速離心15 min，收集上層清汁，利用頂空固相微萃取技術(shù)萃取游離態(tài)香氣物質(zhì)。頂空固相微萃取條件：加熱槽溫度40 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min，平衡時間30 min；然后將已活化的萃取頭插入到樣品中萃取30 min，萃取溫度同樣為40 ℃；萃取結(jié)束后將萃取頭插入到進(jìn)樣口熱解吸8 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)提取方法參照Lan Yibin等[20]的酸解法：用2 mL水和5 mL二氯甲烷洗脫2 mL葡萄汁中的糖酸和游離態(tài)香氣物質(zhì)，用20 mL甲醇溶液洗脫固相萃取柱的糖苷結(jié)合態(tài)香氣。而后用旋蒸儀蒸干，使用10 mL 0.2 mol/L檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液（pH 2.5）重新溶解，隨后轉(zhuǎn)移至15 mL進(jìn)樣小瓶，在99 ℃下水浴1 h，然后置于室溫。加入10 μL 1.001 8 mg/mL 4-甲基-2-戊醇溶液（內(nèi)標(biāo)），然后經(jīng)頂空固相微萃取后進(jìn)樣至GC-MS檢測。

1.3.2 葡萄果實(shí)香氣化合物的測定

每個砧穗組合或自根苗葡萄果實(shí)樣品設(shè)3 個生物學(xué)平行分別提取游離態(tài)和結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)。頂空固相微萃取條件參考胡麗等[21]的方法，GC-MS條件參考Wu Yuwen等[22]的方法。香氣化合物定性采用自動解卷積（AMDIS）技術(shù)對GC-MS全掃描數(shù)據(jù)文件進(jìn)行解卷積分析。根據(jù)不同香氣物質(zhì)的保留時間、保留指數(shù)及質(zhì)譜信息，與NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行對比定性。

1.3.3 葡萄果實(shí)香氣化合物的定量分析

參考Zhang Mingxia等[23]的方法進(jìn)行葡萄果實(shí)香氣化合物的定量。采用外標(biāo)法，利用標(biāo)準(zhǔn)樣品香氣物質(zhì)在模擬葡萄汁溶液（7 g/L酒石酸，200 g/L葡萄糖，1%乙醇溶液（V/V），用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3.4）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線對已有標(biāo)準(zhǔn)樣品的物質(zhì)定量，以乙醇溶解并混合為標(biāo)準(zhǔn)品母液。用葡萄汁模擬液將母液稀釋為多個濃度梯度，在相同的萃取條件及GC-MS條件下進(jìn)行香氣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品中的香氣物質(zhì)進(jìn)行定量分析。對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，利用具有相同的官能團(tuán)或相同相似碳原子數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對定量分析。香氣物質(zhì)單位用每千克葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的含量表示（μg/kg）（以樣品鮮質(zhì)量計）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016繪制香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用R語言（R4.05）進(jìn)行單因素方差分析（Duncan’s test）和雙因素方差分析，采用SMICA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。OPLS-DA模型變量投影重要性值（variable importance projection，VIP）表示各個變量在模型中對區(qū)分兩組樣品的貢獻(xiàn)值，篩選VIP＞1的化合物作為兩組之間的差異化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄園氣象條件分析

通過對葡萄園所在地區(qū)2016—2017年連續(xù)兩年葡萄生長季氣象數(shù)據(jù)的搜集、整理與分析（圖1），發(fā)現(xiàn)2017年總光照時數(shù)顯著高于2016年；2016年降雨量最大，總有效積溫較低，特別是2016年葡萄轉(zhuǎn)色前降雨量較大；2017年降雨集中在7月初和8月初，葡萄收獲前期，降雨量較小。

圖1 2016年和2017年葡萄生長季氣象數(shù)據(jù)Fig. 1 Meteorological data of grape growing seasons in the years of 2016 and 2017

2.2 砧木對‘丹娜’葡萄果實(shí)游離態(tài)香氣的影響

如表1所示，不同砧木對‘丹娜’葡萄香氣的影響各不相同。2016年，高級醇類物質(zhì)含量在丹娜/101-14中最低，在丹娜/貝達(dá)中最高；芳香族化合物含量在丹娜/SO4中最高，在丹娜/3309C中最低；C6/C9化合物含量在丹娜/1103P中最高，在丹娜/3309C中最低。此外，羰基化合物含量在自根苗中最高；酯類化合物含量在丹娜/140R中最高；C13-降異戊二烯化合物含量在丹娜/SO4中最高；其他類化合物含量在丹娜/1103P中最高；萜烯類化合物含量在丹娜/貝達(dá)中最高；揮發(fā)性酚類化合物含量在丹娜/貝達(dá)中最高，在丹娜/3309C中則最低。2017年，高級醇類化合物含量在丹娜/3309C中最高，在丹娜/SO4中最低；芳香族化合物含量在丹娜/貝達(dá)中最高，在丹娜/140R中最低。各砧穗組合中C6/C9化合物、羰基化合物、酯類香氣物質(zhì)含量無顯著差異。此外，C13-降異戊二烯類化合物含量在丹娜/SO4中最高，在丹娜/1103P中則最低；其他類香氣化合物含量在丹娜/1103P中最高；萜烯類化合物含量在各砧穗組合中無顯著差異。年份和砧木雙因素結(jié)果表明，砧木對絕大多數(shù)游離香氣物質(zhì)有顯著影響。因此，砧木對接穗香氣物質(zhì)的影響并沒有表現(xiàn)出很好的一致性?？傆坞x態(tài)化合物含量在丹娜/1103P中與自根苗相比無顯著差異；與其他砧穗組合相比，丹娜/1103P中總游離態(tài)類化合物含量在2016年最高?！?103P’在2016年可以提高果實(shí)中C6/C9化合物含量，但在2017年，‘1103P’降低了果實(shí)中C6/C9化合物含量；‘貝達(dá)’在2016年可以提高果實(shí)中游離態(tài)高級醇化合物和揮發(fā)酚類化合物含量；‘140R’在2016年可以提高游離態(tài)酯類化合物含量，但在2017年‘140R’降低了游離態(tài)酯類化合物含量；‘SO4’在2016年提高了果實(shí)中游離態(tài)芳香族化合物，但在2017年‘SO4’降低了游離態(tài)芳香族化合物含量。在兩個年份中，‘SO4’均提高了C13-降異戊二烯類化合物的含量。郭文嬌等[24]在對‘赤霞珠’的研究中發(fā)現(xiàn)，砧木‘SO4’有利于‘赤霞珠’中醛類和醇類化合物的積累。金仲鑫[25]發(fā)現(xiàn)‘SO4’可以顯著增加‘金手指’果實(shí)中游離態(tài)香氣總量，但卻降低了醇類、酮類和酯類化合物總量；對于‘夏黑’葡萄，‘SO4’顯著降低了酯類化合物的含量，但同時提高了醇類、酮類和萜類化合物的含量；在‘藤稔’葡萄中，‘SO4’顯著降低了大部分酯類和醇類化合物的含量，最終導(dǎo)致香氣總量的下降。因此，同一種砧木接嫁在不同的接穗品種上，香氣差異表現(xiàn)也各不相同。此外，年份對大多數(shù)游離態(tài)香氣化合物有顯著影響，且年份和砧木之間有交互作用。2017年高級醇類、C6/C9類、C13-降異戊二烯類、其他類化合物含量都高于2016年。結(jié)合氣候數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：2017年光照充足、降雨少、轉(zhuǎn)色期溫度較高、光照強(qiáng)，這種氣候條件更利于果實(shí)中高級醇類、C13-降異戊二烯類等香氣物質(zhì)的積累。同時，發(fā)現(xiàn)砧木對接穗游離香氣化合物的影響在2016年差異更為顯著，這可能是由于光照不足和降雨較少的環(huán)境脅迫更有利于砧木遺傳特性的表達(dá)。

2.3 砧木對‘丹娜’葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣的影響

葡萄果實(shí)糖苷鍵結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)作為風(fēng)味前體，與糖或無味的糖苷結(jié)合在一起，經(jīng)水解釋放后才能為人體感知[26]，通過酶解和水解方式，結(jié)合態(tài)香氣成分會釋放，引起香氣的改變[27]。如表2所示，2016年，高級醇類物質(zhì)含量在丹娜/3309C中最高，而在丹娜/1103P中最低；芳香族化合物含量在丹娜/101-14中最高；C6/C9類化合物含量在丹娜/SO4中最高，在自根苗中最低；羰基化合物和酯類化合物含量在不同砧穗組合間無顯著差異；C13-降異戊二烯含量在丹娜/SO4中最高，而在丹娜/140R中最低。2017年，高級醇類物質(zhì)含量在不同砧穗組合間無顯著差異；芳香族化合物含量在丹娜/3309C中最高，而在丹娜/101-14中最低；C6/C9類化合物含量在丹娜/貝達(dá)中最高，在丹娜/SO4中最低；羰基化合物含量在丹娜/1103P中最高；酯類和C13-降異戊二烯類物質(zhì)含量在丹娜/貝達(dá)、丹娜/SO4和丹娜/3309C中相對較高；萜烯類物質(zhì)含量在丹娜/3309C中最高，而在丹娜/1103P中最低。年份和砧木雙因素方差分析結(jié)果表明，砧木對絕大多數(shù)結(jié)合態(tài)香氣有顯著影響，‘3309C’可以提高果實(shí)中結(jié)合態(tài)萜烯類化合物的含量；在2016年，‘101-14’可以提高結(jié)合態(tài)萜烯類化合物的含量；在2017年，‘140R’和‘1103P’有利于結(jié)合態(tài)羰基化合物的積累；‘貝達(dá)’可以提高結(jié)合態(tài)酯類化合物含量；‘SO4’可以提高結(jié)合態(tài)C13-降異戊二烯化合物的含量。有研究表明[18]，‘1103P’嫁接的‘赤霞珠’羰基化合物及結(jié)合態(tài)香氣總含量比‘SO4’嫁接的‘赤霞珠’含量更高，羰基化合物積累趨勢與本研究結(jié)果一致，而結(jié)合態(tài)總香氣含量僅在2017年表現(xiàn)出丹娜/1103P高于丹娜/SO4，這說明總結(jié)合態(tài)香氣含量在年際間的可塑性較強(qiáng)。年份同樣對大多數(shù)香氣物質(zhì)有顯著影響，砧木和年份之間有交互作用，其中2017年C13-降異戊二烯類化合物遠(yuǎn)高于2016年。有研究表明[28]，強(qiáng)光能刺激類胡蘿卜素的合成并猝滅在光保護(hù)機(jī)制中產(chǎn)生的高還原性中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物；而C13-降異戊二烯的前體物質(zhì)為類胡蘿卜素，在強(qiáng)光條件下，由于類胡蘿卜素合成增加，C13-降異戊二烯類化合物濃度也會提高。本研究中，2017年的葡萄果實(shí)中的C13-降異戊二烯類物質(zhì)含量高于2016年，可歸因于2016年的光照強(qiáng)度弱于2017年；對于游離態(tài)C13-降異戊二烯類化合物，也有類似的規(guī)律。

表1 連續(xù)兩年不同砧穗組合‘丹娜’葡萄果實(shí)游離態(tài)香氣物質(zhì)的組成和含量Table 1 Composition and content of free aromatic compounds in grape fruit from ‘Tannat’ grafted onto different rootstocks in the two consecutive vintages μg/kg

2.4 砧木對‘丹娜’葡萄果實(shí)總香氣的影響

在連續(xù)兩年的研究中，6種砧穗組合及自根苗‘丹娜’葡萄果實(shí)中共檢測到55種香氣物質(zhì)，分別以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在，包括C6/C9類10種、C13-降異戊二烯類10種、萜烯類9種、芳香族化合物6種、羰基化合物類6種、高級醇類6種、酯類4種、揮發(fā)性酚類化合物1種以及其他類2種。由圖2可知，‘1103P’、‘SO4’嫁接的‘丹娜’和‘丹娜’自根苗香氣總含量較高，而‘101-14’和‘3309C’嫁接的‘丹娜’在2016年顯著降低了香氣物質(zhì)的總含量。Cheng Jing等[29]利用‘101-14’、‘1103P’、‘貝達(dá)’、‘5BB’和‘SO4’嫁接‘霞多麗’，發(fā)現(xiàn)‘1103P’可以顯著提升‘霞多麗’各類香氣物質(zhì)的含量。Koundouras等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)‘1103P’可以提高‘赤霞珠’香氣物質(zhì)的總含量。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)‘1103P’在特定年份（2016年）可以提高‘丹娜’葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的含量，且顯著高于丹娜/101-14、丹娜/3309C和丹娜/140R組合，以游離態(tài)的C6/C9類物質(zhì)為主。砧木‘1103P’由沙地葡萄（Vitis rupestris）和冬葡萄（Vitis berlandieri）雜交而來，樹勢旺盛，根系發(fā)達(dá)，水分養(yǎng)分運(yùn)輸能力強(qiáng)，這在一定程度上增強(qiáng)了接穗果實(shí)香氣物質(zhì)的積累。C6/C9類香氣物質(zhì)是‘丹娜’葡萄中含量最豐富的化合物，約占總含量的90%，該類香氣物質(zhì)中主要包括正己醛、己烯醛和己烯醇等物質(zhì)，能夠提供青草香，對葡萄酒的香氣非常重要。由表3可知，‘1103P’在雨水多光照少的年份（2016年）可以提高‘丹娜’葡萄中C6/C9類物質(zhì)的含量，因此在很大程度上決定了香氣物質(zhì)的總含量。C13-降異戊二烯類物質(zhì)具有復(fù)雜的花香、熱帶水果的香氣，對葡萄酒香氣有著獨(dú)特的貢獻(xiàn)，其中大馬士酮在C13-降異戊二烯類物質(zhì)含量中占比最高。萜烯類化合物具有濃郁的香味，其感官閾值較低，是麝香型葡萄及其葡萄酒的典型香氣，主要包含里那醇、香葉醇、橙花醇、香茅醇和α-萜品醇等物質(zhì)。由表3可知，‘SO4’和‘貝達(dá)’均有提高‘丹娜’葡萄萜烯類物質(zhì)含量的趨勢，且‘SO4’可以顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)C13-降異戊二烯的含量。酯類物質(zhì)同樣是一類可以給果實(shí)帶來正面影響的物質(zhì)，它們通常可以帶來令人愉悅的香氣，但是也有部分具有脂肪味與奶酪香?！?40R’有利于‘丹娜’酯類物質(zhì)的合成（表3）。Wang Yu等[15]發(fā)現(xiàn)‘SO4’顯著降低‘赤霞珠’葡萄果實(shí)中酯類物質(zhì)的含量，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在2016年‘SO4’嫁接的‘丹娜’與自根苗并無顯著差異，在2017年‘SO4’可以顯著提高酯類物質(zhì)含量（表3），這可能由接穗品種不同造成，說明同一砧木對于不同接穗酯類香氣物質(zhì)含量的影響可能不同。在多雨少光的生長季，不同砧木的使用均降低了‘丹娜’葡萄果實(shí)中羰基化合物的含量（表3）。

表2 連續(xù)兩年不同砧穗組合‘丹娜’葡萄果實(shí)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的組成和含量Table 2 Composition and content of bound aromatic compounds in grape fruit from ‘Tannat’ grated onto different rootstocks in the two consecutive vintages μg/kg

同時，由表1、2可知，‘丹娜’葡萄果實(shí)中游離香氣物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，在‘赤霞珠’、‘霞多麗’中也有類似的發(fā)現(xiàn)[17,28]。年份也在一定程度上影響‘丹娜’葡萄各砧穗組合中香氣的含量。其中，游離態(tài)C6/C9類化合物、高級醇類物質(zhì)、羰基化合物、C13-降異戊二烯化合物和揮發(fā)性酚類化合物的可塑性較強(qiáng)，年際間變化大，而游離態(tài)芳香族化合物、萜烯類和結(jié)合態(tài)羰基化合物、芳香族化合物、酯類、高級醇類物質(zhì)受到的年份影響相對較小。此外，由圖2可知，2017年6種砧穗組合中各類香氣物質(zhì)總含量都高于2016年，但2017年不同砧穗組合之間香氣含量卻無顯著差異。2016年香氣含量在各個砧穗組合之間表現(xiàn)出一定差異，這種差異主要由氣候條件造成（圖1）：2017年總光照時數(shù)顯著高于2016年，且2016年降雨量最大，總有效積溫較低，特別是2016年葡萄轉(zhuǎn)色前降雨量較大。這種氣候條件不利于葡萄香氣的積累，因此香氣總含量相對較低。2017年降雨集中在7月初和8月初，轉(zhuǎn)色前期和葡萄轉(zhuǎn)色期，降雨量較小，有利于香氣物質(zhì)的積累。因此，2017年的環(huán)境對于葡萄生長來說，更為適宜，2016年的氣候環(huán)境相對較差，而不同砧穗組合之間的香氣含量在2016年差異更大，2017年差異較小。可以推斷，在多雨和光照不足的脅迫環(huán)境中，砧木對接穗果實(shí)的香氣含量影響更大，脅迫的環(huán)境更有利于展現(xiàn)砧木的特性，而在相對適宜的氣候環(huán)境下，不同砧木對葡萄果實(shí)的香氣影響較小，這也進(jìn)一步說明在脅迫氣候環(huán)境中使用砧木的必要性。

圖2 不同砧穗組合香氣物質(zhì)總含量Fig. 2 Total aroma content of different rootstock combinations

2.5 砧木對‘丹娜’葡萄差異香氣化合物的篩選

表3 連續(xù)兩年不同砧穗組合‘丹娜’葡萄果實(shí)總香氣物質(zhì)的組成和含量Table 3 Total contents of aromatic compounds in grape fruit from ‘Tannat’ grafted onto different rootstocks in the two consecutive vintages μg/kg

為了進(jìn)一步明確不同砧穗組合之間的相似性和差異性，對不同砧穗組合進(jìn)行PCA。如圖3所示，2016和2017兩年的數(shù)據(jù)有很明顯的區(qū)分，且2016年各砧穗組合差異更大，而2017年砧穗組合分布更為集中。2016年標(biāo)志性化合物主要以酯類、醛酮類、芳香族化合物、結(jié)合態(tài)高級醇類和揮發(fā)性酚類化合物為主，而2017年主要以C6/C9類、C13-降異戊二烯類、游離態(tài)高級醇類和結(jié)合態(tài)酯類化合物為主。Garde-cerdán等[30]發(fā)現(xiàn)C13-降異戊二烯類化合物濃度和高溫呈正相關(guān)，2017年葡萄生長季溫度比2016年更高，有利于C13-降異戊二烯物質(zhì)的積累。

圖3 不同砧穗組合PCA分布圖（A）和PCA載荷圖（B）Fig. 3 PCA score plot (A) and loading plot (B) of aromatic compounds in grape fruit from different rootstock-scion combinations

盡管PCA對年際間的差異有很好的區(qū)分度，但是仍無法將各個砧穗組合區(qū)分開，其差異性化合物也不能明確。由此可見，年份對香氣物質(zhì)含量起著至關(guān)重要的作用，但在同一氣候條件下，砧木仍然對接穗品種香氣含量產(chǎn)生重要影響。因此，為了進(jìn)一步明確不同砧木對‘丹娜’葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的影響，淡化年份對香氣物質(zhì)的干涉，采用OPLS-DA對6 組砧穗組合進(jìn)行差異分析。如圖4所示，OPLS-DA也可以很好地將兩個年份的結(jié)果區(qū)分開，并且不同砧穗組合與自根苗也能很好區(qū)分。

圖4 自根苗與不同砧穗組合‘丹娜’葡萄香氣物質(zhì)的OPLS-DA得分圖Fig. 4 OPLS-DA score plots of aromatic compounds in self-rooted and grafted ‘Tannat’ grapes

篩選VIP＞1的化合物作為自根苗與不同砧穗組合的差異化合物，結(jié)果表明：丹娜/SO4與自根苗的差異化合物最多，丹娜/3309C和丹娜/140R與自根苗的差異物質(zhì)最少，差異化合物均為游離態(tài)香氣物質(zhì)。丹娜/SO4與自根苗的主要差異化合物有苯乙醛、(Z)-3-己烯醇、苯甲醛、(E)-β-大馬士酮、(Z)-β-大馬士酮、(E)-2-己烯醛、壬醛、正己醛、(E)-2-癸烯醛、苯酚、(E,E)-2,4-山梨醛、苯甲醇等物質(zhì)；丹娜/101-14與自根苗的主要差異化合物有(E)-2-己烯醛、正己醛、苯乙醛、己醇、壬醛；丹娜/140R與自根苗的主要差異物有(E)-2-己烯醛、壬醛、苯乙醛；丹娜/3309C與自根苗的主要差異物有(E)-2-己烯醛、正己醛、(E)-3-己烯醇；丹娜/貝達(dá)與自根苗的主要差異化合物有己烯醛、(E)-2-己烯醛、己醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-β-大馬士酮、2-戊基呋喃、壬醛、苯甲醛、(Z)-2-戊烯醇；丹娜/1103P與自根苗的主要差異化合物有(E)-2-己烯醛、正己醛、己醇、2-戊基呋喃、苯乙醛、(Z)-3-己烯醇、(Z)-β-大馬士酮、苯甲醛、(Z)-2-戊烯醇。整體來看，(E)-2-己烯醛、正己醛、己醇等C6/C9化合物是區(qū)分嫁接苗和自根苗的共性差異化合物，而苯甲醛、(E)-β-大馬士酮、(Z)-β-大馬士酮、苯酚、(E,E)-2,4-山梨醛則是不同砧穗組合和自根苗的特有化合物。于昕等[31]也發(fā)現(xiàn)C6/C9類化合物可以作為嫁接苗和自根苗的差異化合物，如‘SA15’顯著提高了‘美樂’葡萄中(E)-2-己烯醛和正己醛含量，‘SA17’顯著提高‘美樂’葡萄的正己醛、壬醛、乙醇和1-己醇含量，顯著降低(E)-2-己烯醛含量。孫磊等[32]用5種砧木嫁接‘瑞都香玉’葡萄，發(fā)現(xiàn)與自根苗相比，2-己烯醛、里那醇、正己醛、萜品油烯和β-月桂烯是瑞都香玉/1103P的特征化合物。在本研究中也發(fā)現(xiàn)正己醛是丹娜/1103P與自根苗的差異化合物；同樣，(Z)-3-己烯醇和(E,E)-2,4-山梨醛是丹娜/SO4組合與自根苗的特征性差異化合物，與Wang Yu等[15]在‘赤霞珠’葡萄中的發(fā)現(xiàn)類似。由此可見，盡管接穗品種不同，但相同的砧木對接穗香氣的影響仍然存在一定的共性[16]。

不同砧木對‘丹娜’葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)的影響主要由遺傳因素和其生長特性決定，不同的遺傳特性使砧木對水分養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同[33]，這種差異可以從樹體生長勢直接體現(xiàn)?！愡_(dá)’為美洲種葡萄（Vitis labrusca），與自根苗相比，抗寒性強(qiáng)，具有明顯的“小腳”現(xiàn)象，其根部生物量較小，嫁接‘貝達(dá)’砧木提高了高級醇和芳香族化合物的含量，降低了羰基化合物的含量?！?103P’根系發(fā)達(dá)，其嫁接苗生物量大，抗旱性強(qiáng)，C6/C9類物質(zhì)含量高，如游離態(tài)己醇、游離態(tài)(Z)-3-己烯醇、游離態(tài)(E)-2-己烯醛和正己醛是其特征性的C6/C9化合物。‘140R’與‘1103P’具有相同的親本，生長勢類似，其嫁接的‘丹娜’果實(shí)中特征性C6/C9類化合物為游離態(tài)(E)-2-己烯醛?！甋O4’由冬葡萄和河岸葡萄（Vitis riparis）雜交而來，根系淺，主根和側(cè)根之間開角大，樹勢中等，可顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)C13-降異戊二烯類物質(zhì)，其特征性C13-降異戊二烯類化合物為游離態(tài)(E)-β-大馬士酮和(Z)-β-大馬士酮?！?01-14’和‘3309C’由河岸葡萄和沙地葡萄雜交而來，樹勢中等，根部生物量較小，其嫁接的‘丹娜’果實(shí)中相似的特征性化合物同樣以C6/C9類化合物為主，如游離態(tài)(E)-2-己烯醛和正己醛。此外，有研究發(fā)現(xiàn)砧木中的遺傳物質(zhì)如微小核糖核酸（miRNA）可以在砧木和接穗中移動[34]，這種遺傳物質(zhì)的交流也可能改變了調(diào)控香氣物質(zhì)積累的關(guān)鍵基因，但目前尚不清楚其中的調(diào)控機(jī)理，仍需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

不同砧木嫁接對‘丹娜’果實(shí)香氣物質(zhì)的積累可以產(chǎn)生極大的影響，且年份與砧木之間存在交互作用。在多雨少光的年份，不同砧木的使用均降低了‘丹娜’葡萄果實(shí)羰基化合物的總含量；‘1103P’可以顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)中C6/C9類香氣物質(zhì)的總含量；‘140R’有利于‘丹娜’葡萄果實(shí)酯類物質(zhì)的合成；而‘3309C’則降低了酯類、C6/C9類和揮發(fā)性酚類香氣物質(zhì)的積累。此外，‘貝達(dá)’和‘SO4’在連續(xù)兩個年份中均提高了‘丹娜’葡萄果實(shí)萜烯類物質(zhì)的積累；‘SO4’還可以顯著提高‘丹娜’葡萄果實(shí)中C13-降異戊二烯類香氣物質(zhì)的含量。