牛燦杰，葉素丹，胡玉霞，王鳳軍，凌 云

（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310012）

隨著經(jīng)濟(jì)水平的逐漸提升，人們對食品的需求逐漸從“吃得放心”轉(zhuǎn)化為“吃得營養(yǎng)”[1]。營養(yǎng)強(qiáng)化淀粉類食品作為營養(yǎng)強(qiáng)化食品，如營養(yǎng)強(qiáng)化米粉，營養(yǎng)強(qiáng)化面條等發(fā)展迅速[2]，人們越來越關(guān)注其營養(yǎng)成分，然營養(yǎng)素檢出不合格的情況較多[3]。水溶性VB1、VB2、VB3（煙酸、煙酰胺）、VB6（吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺）等作為重要的營養(yǎng)成分，對其檢測具有重要意義。目前，針對水溶性維生素的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法多為單一維生素的檢測，前處理步驟繁瑣，不易操作，檢測周期長。多種水溶性維生素同時(shí)檢測的研究方法主要為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-7]和液相色譜法[8-13]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法儀器價(jià)格昂貴、操作難度較大、維護(hù)成本高、一般實(shí)驗(yàn)室難以配備。高效液相色譜法則主要采用紫外檢測器進(jìn)行檢測，部分維生素檢出限較高，干擾嚴(yán)重。研究的樣品基質(zhì)以奶粉[14-18]和保健食品[19-24]居多，且對于VB6的測定多只檢測其中的一種[4-6]，而研究表明，淀粉類食品中含有吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺形式的VB6[25]。VB1、VB2、VB3（煙酸、煙酰胺）、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）作為強(qiáng)化類食品的重要組成部分[26]，其在營養(yǎng)強(qiáng)化淀粉類食品中同時(shí)檢測的方法并鮮見報(bào)道?；诖?，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列-熒光（high performance liquid chromatography with diode array detector and fluorescence detector，HPLC-DAD-FLD）聯(lián)用的方法檢測強(qiáng)化淀粉類食品中的7種水溶性維生素，對酶解條件、提取液、流動(dòng)相等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探究；通過不同時(shí)間段轉(zhuǎn)化熒光檢測器激發(fā)、發(fā)射波長實(shí)現(xiàn)VB2、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的同時(shí)檢測，降低基質(zhì)干擾、提高靈敏度，以期建立快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)檢測強(qiáng)化淀粉類食品中多種維生素的檢測方法，打擊無良商家的非法行為，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，為政府監(jiān)督抽查及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支撐，進(jìn)而促進(jìn)營養(yǎng)強(qiáng)化食品行業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

強(qiáng)化淀粉類食品：胡蘿卜營養(yǎng)米粉、淮山薏米營養(yǎng)米粉、南瓜玉米營養(yǎng)米粉、原味營養(yǎng)米粉、蛋黃雙歧因子營養(yǎng)米粉、牛肉番茄營養(yǎng)米粉、小米蘋果營養(yǎng)米粉、小米燕麥營養(yǎng)米粉、雞肉蔬菜營養(yǎng)米粉、魚肉DHA營養(yǎng)米粉、果蔬寶多維營養(yǎng)米粉、DHA核桃仁營養(yǎng)米粉、鐵鋅鈣營養(yǎng)米粉、營養(yǎng)強(qiáng)化小面條、均衡營養(yǎng)小面條、多彩果蔬面、多彩雜糧面、營養(yǎng)強(qiáng)化核桃面、營養(yǎng)均衡菠菜面、牛油果菠菜營養(yǎng)面條，以上樣品主要來源于市購。

VB1（鹽酸硫胺素，純度99.9%）、VB2（純度98.0%）、煙酸（純度99.8%）、煙酰胺純度（純度99.8%）、鹽酸吡哆醇（純度99.9%）、鹽酸吡哆醛（純度99.9%）、雙鹽酸吡哆醇（純度99.9%） 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；鹽酸（分析純） 杭州嘉辰化工有限公司；磷酸（色譜純，85%） 濟(jì)寧誠泰化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（離子對色譜純）、淀粉酶（α-淀粉酶，生物酶活力≥1.5 U/mg） 上海麥克林試劑公司；磷酸二氫鉀（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；實(shí)驗(yàn)所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀（配有DAD、FLD及變色龍Chromeleon7色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國Thermo Fisher公司；SK6200LHC超聲儀 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、雙鹽酸吡哆胺、鹽酸吡哆醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，VB1質(zhì)量濃度為100 mg/L，VB2質(zhì)量濃度為50 mg/L，煙酸質(zhì)量濃度為500 mg/L，煙酰胺質(zhì)量濃度為500 mg/L，鹽酸吡哆醛質(zhì)量濃度為100 mg/L，雙鹽酸吡哆胺質(zhì)量濃度為100 mg/L，鹽酸吡哆醇質(zhì)量濃度為100 mg/L，再用水逐級稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品（已經(jīng)粉碎并混合均勻）于具塞錐形瓶中，加入40 mL超純水，加入0.5 g淀粉酶，在60 ℃振蕩水浴鍋中，振蕩酶解45 min，用鹽酸溶液調(diào)pH 1.7，放置2 min后，再用氫氧化鈉水溶液調(diào)pH 4.5，充分混勻后于超聲儀中超聲提取10 min，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，過0.22 μm水膜，上機(jī)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相：A相為十二烷基硫酸鈉溶液（5 mmol/L，加入0.1%磷酸，再用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0），B相為乙腈；梯度洗脫條件：0～5.0 min，90% A，10% B；5.0～20 min，90%～38% A，10%～62% B；20.1～25.0 min，38%～90% A，62%～10% B；25.1～33.0 min，90% A，10% B。流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測器為DAD串聯(lián)FLD，DAD檢測波長為261、245 nm。FLD：0～10 min，激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm，10～28 min，激發(fā)波長293 nm，發(fā)射波長462 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀的變色龍Chromeleon7色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及Excle軟件進(jìn)行圖譜分析及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

取7種維生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，在190～800 nm波長下進(jìn)行掃描，見圖1。VB1、煙酸、煙酰胺分別在波長246、261 nm左右有最大吸收，因此選為檢測波長；VB2在波長267、445 nm處有最大吸收，吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺在波長290 nm左右有最大吸收；采用最大吸收波長作為檢測波長進(jìn)行色譜條件摸索，確定各目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間，VB2、VB6有熒光特性，采用熒光檢測代替紫外檢測，既可以提高檢測靈敏度降低檢出限，同時(shí)可以大大減少干擾峰的影響。因此，根據(jù)VB2、VB6的熒光特性，在VB2的出峰時(shí)間段采用激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm，在VB6的出峰時(shí)間段選用激發(fā)波長293 nm，發(fā)射波長462 nm，進(jìn)行檢測。

圖1 7種水溶性維生素光譜圖Fig. 1 Spectra of seven water-soluble vitamins

2.2 流動(dòng)相的選擇

目前，多種水溶性維生素同時(shí)檢測，常用流動(dòng)相主要為磷酸氫二鉀緩沖液[13,20]、離子對試劑[10,22-24,27]。在已有實(shí)驗(yàn)條件下，研究發(fā)現(xiàn)，采用磷酸氫二鉀緩沖液[13]（0.05 mol/L，pH 6.0），VB1、VB2、吡哆醇分離良好，煙酸峰出現(xiàn)肩峰，經(jīng)光譜輔助定性為同種物質(zhì)，考慮為流動(dòng)相pH值的影響，吡哆醛、吡哆胺未出峰；采用磷酸氫二鉀緩沖液[20]（0.05 mol/L，pH 3.0），煙酸峰形良好，即pH 3.0左右，有利于改善煙酸的峰形，吡哆醛、吡哆胺仍未出峰，考慮目標(biāo)物質(zhì)在色譜柱上保留較弱，宜加入離子對試劑。采用離子對試劑十二烷基硫酸鈉緩沖液時(shí)[24]（5 mmol/L，含0.05%甲酸），吡哆醛出峰，但峰形不對稱，吡哆胺未出峰，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，采用十二烷基硫酸鈉（5 mmol/L，加1 mL磷酸，后再用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0），此時(shí)7種維生素得到較好分離，峰形良好，見圖2，三乙胺的加入利于改善吡哆醛的峰形，同時(shí)吡哆胺出峰。對不同濃度的十二烷基硫酸鈉緩沖液進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)十二烷基硫酸鈉濃度為1～4 mmol/L時(shí)，煙酸、煙酰胺、VB1的峰形會(huì)出現(xiàn)不同程度的拖尾，5～20 mmol/L時(shí)，7種維生素分離較好，峰形較佳。因此，在保證良好分離及較好峰形的前提下，減少離子對試劑對色譜柱的傷害，因此最終確定十二烷基硫酸鈉（5 mmol/L，加1 mL磷酸，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0）作為流動(dòng)相。研究發(fā)現(xiàn)，乙腈作流動(dòng)相比甲醇作流動(dòng)相出峰更快、峰形更好，因此采用乙腈-十二烷基硫酸鈉緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。由于7種維生素在色譜柱上保留能力相差較大，因此采用梯度洗脫，但是采用離子對試劑進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，短時(shí)間梯度快速變化，更容易出現(xiàn)鬼峰及臺(tái)階峰，宜適當(dāng)延長改變梯度的平衡時(shí)間。

圖2 7種水溶性維生素色譜圖Fig. 2 Chromatograms of seven water-soluble vitamins

2.3 酶解溫度的選擇

強(qiáng)化淀粉類食品中淀粉含量較高，良好的酶解條件，既要利于目標(biāo)物質(zhì)的提取，又要盡可能降低目標(biāo)物質(zhì)的損失。在營養(yǎng)強(qiáng)化米粉樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按加工工藝進(jìn)行充分混勻[28]。實(shí)驗(yàn)研究酶解時(shí)間為45 min時(shí)，45、50、55、60、65、70 ℃酶解條件下，7種維生素的平均加標(biāo)回收率（n=6）如圖3所示。結(jié)果表明，酶解溫度由45 ℃升至60 ℃時(shí)，7種維生素的平均加標(biāo)回收率逐漸增加，增加速度逐漸減小，可能是隨著溫度升高，越來越接近最佳酶解溫度，酶解反應(yīng)越來越充分，維生素游離出來；60 ℃升至70 ℃時(shí)，維生素的加標(biāo)回收率有所下降，下降速度逐漸增大，煙酸、煙酰胺的回收率高于其他幾種維生素，可能是溫度升高，降低了淀粉酶的催化效率，同時(shí)，可能與維生素自身的穩(wěn)定性有關(guān)，在溫度相對較高，近中性的水溶液中煙酸、煙酰胺相對穩(wěn)定，其他維生素更易損失，綜上，選擇酶解溫度為60 ℃。

圖3 不同酶解溫度測得維生素的平均加標(biāo)回收率（n=6）Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.4 酶解時(shí)間的選擇

在營養(yǎng)強(qiáng)化米粉樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按加工工藝進(jìn)行充分混勻[28]，酶解溫度60 ℃，考察酶解時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90 min，測得7種維生素的平均加標(biāo)回收率（n=6）如圖4所示，酶解時(shí)間由15 min升至45 min時(shí)，維生素的加標(biāo)回收率逐漸增加，可能是隨著時(shí)間的延長，酶解反應(yīng)更充分，維生素釋放更充分；由45 min延長酶解時(shí)間至60 min時(shí)，幾種維生素的加標(biāo)回收率變化不大，酶解時(shí)間由60 min升至90 min時(shí)，VB1、VB2、吡哆醛、吡哆胺的加標(biāo)回收率略微下降，兼顧提高回收率、節(jié)約時(shí)間的原則，選擇酶解時(shí)間為45 min。

圖4 不同酶解時(shí)間測得維生素的平均加標(biāo)回收率（n=6）Fig. 4 Effect of hydrolysis time on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.5 提取液的選擇

結(jié)合7種維生素國標(biāo)法及已有研究[6,20,24,27]，探究酶解后2種前處理方式對檢測結(jié)果的影響：方式（1）10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液；方式（2）先用酸調(diào)pH 1.7，靜置2 min后再用堿調(diào)pH 4.5。如圖5所示，以基質(zhì)相對簡單的原味營養(yǎng)強(qiáng)化米粉作基質(zhì)時(shí)，2種前處理方式，7種水溶性維生素的測定平均值（n=6）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～5.38%，小于10%，無明顯差異；兩種處理方式的平均加標(biāo)回收率（n=6）在92%～103%之間，就準(zhǔn)確度而言可以滿足該類實(shí)際樣品檢測；但對于較為復(fù)雜的樣品基質(zhì)，如牛肉番茄米粉、果蔬寶營養(yǎng)米粉、營養(yǎng)均衡菠菜小面樣品，采用10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液時(shí)，在VB1、煙酸、煙酰胺的出峰位置會(huì)有不同程度的干擾，增加了分離難度，可能是有機(jī)溶劑的加入，提取出來部分干擾物質(zhì)，而采用方式（2）并沒有出現(xiàn)干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)采用先用酸調(diào)pH 1.7，靜置2 min后再用堿調(diào)pH 4.5。

圖5 2種提取方式測得維生素的平均加標(biāo)回收率（n=6）Fig. 5 Effect of extraction methods on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限結(jié)果

按照1.3.1節(jié)配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3 倍信噪比對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度為檢出限，以10 倍性噪比對應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度為定量限，所得7種維生素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表1。

表1 7種維生素的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 1 Linear relationships, limits of detection and limits of quantification of seven vitamins

2.7 方法回收率和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件分別向營養(yǎng)強(qiáng)化米粉樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)實(shí)際購買樣品標(biāo)簽上的標(biāo)識，選定7種維生素的加標(biāo)水平以評價(jià)方法的回收率及重復(fù)性。所得數(shù)據(jù)見表2，VB1的回收率為95.6%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%～1.25%，VB2的回收率為90.5%～97.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%～2.50%，煙酸的回收率為95.9%～99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%～1.20%，煙酰胺的回收率為92.2%～98.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%～1.49%，吡哆醛的回收率為93.5%～102.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.29%～2.93%，吡哆醇的回收率為92.0%～102.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.12%～3.45%，吡哆胺的回收率為91.1%～97.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.86%～3.07%，該方法回收率高，精密度好，可滿足強(qiáng)化類淀粉食品中7種維生素同時(shí)檢測的要求。

表2 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs for spiked samples (n = 6)

2.8 本方法與現(xiàn)有方法的比較

取營養(yǎng)強(qiáng)化米粉、營養(yǎng)強(qiáng)化面條各一批次樣品，分別依據(jù)本實(shí)驗(yàn)建立方法、國標(biāo)方法進(jìn)行檢測，重復(fù)6 次平行實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)見表3、4。就檢測值看，采用本方法所得測定值與國標(biāo)方法測定值，均高于標(biāo)簽標(biāo)識值，標(biāo)識值為人為添加的含量，而樣品基質(zhì)本身含有一定量的維生素，測定值高于標(biāo)識值合理，更接近真實(shí)值；建立的方法與國標(biāo)方法的測定值沒有明顯差異，建立的方法能夠滿足實(shí)際樣品的測定。就檢測項(xiàng)目和時(shí)間而言，需要采用4 個(gè)國標(biāo)方法完成7種維生素的檢測，前處理較為耗時(shí)，VB1、VB2水解時(shí)間均需16 h以上，不同維生素采用不同的流動(dòng)相體系，完成一批次樣品檢測需要耗時(shí)3～4 d，采用本方法0.5 d即可完成檢測，更利于大批量樣品檢測，以滿足風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)督快速抽檢的需要。

表3 本實(shí)驗(yàn)建立方法與國標(biāo)方法測定值對比（營養(yǎng)強(qiáng)化米粉）（n=6）Table 3 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified rice flour and the certified values (n = 6) μg/100 g

表4 本實(shí)驗(yàn)建立方法與國標(biāo)方法測定值對比（營養(yǎng)強(qiáng)化面條）（n=6）Table 4 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified noodles and the certified values (n = 6) μg/100 g

2.9 實(shí)際樣品檢測

結(jié)合本研究方法對20 批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)標(biāo)簽明示值及GB 28050—2011《預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》中對營養(yǎng)成分的判定，所檢樣品中維生素測得值與標(biāo)簽值均符合。所檢樣品中，有15 批次樣品VB3僅以煙酰胺形式檢出，3 批次以煙酸形式檢出，2 批次樣品同時(shí)檢出少量煙酸和煙酰胺；有17 批次樣品VB6的檢出形式為吡哆醇，3 批次檢出吡哆醛、吡哆醇，這可能與商家的添加形式、樣品基質(zhì)本底量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測的營養(yǎng)強(qiáng)化淀粉類食品，以主流強(qiáng)化米粉、面條為主，樣品類型及數(shù)量比較有限，有待進(jìn)一步擴(kuò)大強(qiáng)化淀粉類食品研究范圍。

3 結(jié) 論

采用HPLC-DAD-FLD聯(lián)用方法同時(shí)快速檢測強(qiáng)化淀粉類食品中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的方法，步驟簡單，節(jié)約時(shí)間，方法回收率高，利于大批量強(qiáng)化淀粉類食品中水溶性維生素的快速檢測，為改善現(xiàn)有研究中強(qiáng)化淀粉類食品中多種水溶性維生素同時(shí)檢測方法匱乏的現(xiàn)狀提供了基礎(chǔ)技術(shù)參考，然本研究中以營養(yǎng)強(qiáng)化淀粉類食品中的主流產(chǎn)品，強(qiáng)化米粉、面條為研究對象，針對其他產(chǎn)品的研究尚欠缺，有待進(jìn)一步深入研究，以促進(jìn)營養(yǎng)強(qiáng)化食品行業(yè)的健康發(fā)展。