楊峰,李瑩瑩,王守偉,劉文婷,李石磊
(中國肉類食品綜合研究中心 北京食品科學研究院 北京 100068)
細胞培育肉也被稱作培養(yǎng)肉、人造肉、清潔肉等[1-2],是利用動物細胞體外培養(yǎng)的方式控制其快速增殖、定向分化,收集加工而成的一種新型肉類食品[3-4],是基于生物工程技術生產(chǎn)的肉類產(chǎn)品。該類肉品因可以繞開動物飼喂而可持續(xù)地為人類供應真實動物蛋白,被認為是最有可能解決未來人類肉品生產(chǎn)和消費困境的方案[5]。相對于植物蛋白素肉,培育肉以其可為人類提供真實動物蛋白而被廣泛看作是最具商業(yè)價值潛力的肉類替代物[6],在生產(chǎn)技術、發(fā)展理念和存在意義等方面具有較強的先進性。與傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式相比,細胞培育肉生產(chǎn)占用的土地面積將減少95%,水消耗量將減少75%,溫室氣體排放量將減少87%,能源消耗將減少45%,這將從技術層面助力肉類產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)“雙碳目標”[7-8],推動肉類食品產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。
目前細胞培育肉的生產(chǎn)主要包括細胞選擇和細胞庫建立、規(guī)?;鲋?、細胞分化、細胞收獲、終產(chǎn)品加工[9]。種類豐富、高活力的種子細胞是生產(chǎn)細胞培育肉的源頭,種子細胞的獲取也是生產(chǎn)細胞培育肉的關鍵環(huán)節(jié)[10]。目前開展的細胞培育肉研究,種子細胞主要通過從牛[11-13]等動物中提取、分離獲得高純度的肌肉干細胞,然而,這些細胞活化后分化為成肌細胞即失去干性,無法永久性持續(xù)增長,細胞傳代能力仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)[14-15]。另外,持續(xù)從動物機體獲取細胞也違背了動物福利[16]。細胞培育肉技術的快速發(fā)展推動了細胞培育肉的工業(yè)化進程,也面臨著大量種子細胞制備的需求,因此亟待構建高效、可持續(xù)的種子細胞的制備方法。
細胞永生化技術[17]可以使得細胞獲得持續(xù)生長的增殖能力,長期傳代,并具有無限增殖的生長特性,克服一般原代細胞有限次傳代后即發(fā)生衰老和死亡的情況。成體細胞的永生化,包括端粒酶逆轉錄酶轉染[18-19]、基因敲除類恢復性誘導[20]、四小吉奎琳氧化法以及黃曲霉素刺激法[21-22],然而,目前僅限于基礎研究,現(xiàn)存的永生化細胞系多為小鼠或人源細胞,無法直接應用于細胞培育肉體系,更不能用于食品科學的研究。本研究利用豬成肌細胞,通過端粒酶逆轉錄酶進行誘導載體的構建,核轉染到細胞后分別通過免疫熒光標記、定量PCR、染色體核型分析等方法進行細胞誘導驗證,以期實現(xiàn)豬源永生化成肌細胞的誘導,構建穩(wěn)定性強的豬成肌細胞永生化誘導載體,為細胞培育肉種子細胞制備提供更高效的技術手段,為細胞培育肉工業(yè)化生產(chǎn)種子細胞獲取打下基礎。
豬肌衛(wèi)星細胞取自新生豬胎兒大腿肌肉,通過組織貼壁法進行培養(yǎng)傳代;GatewayBP Clonase II Enzyme Mix,GatewayLR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix,Lipofectamine 2000 Reagent,Taq DNA Polymerase,100 bp DNA Ladder,dNTP Mix,GeneRuler,GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder,美國賽默飛世爾科技有限公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase,日本Takara 公司;Sanprep 柱式膠回收試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;RNA 提取試劑盒,質(zhì)粒小提試劑盒,DH5α 感受態(tài)細胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;DMEM 培養(yǎng)基,Ampicillin LB瓊脂平板,云舟生物科技(廣州)股份有限公司;限制性內(nèi)切酶,胰酶,美國NEB 公司;胎牛血清,細胞培養(yǎng)皿,美國康寧公司;Lenti-X p24 Rapid Titer Kit,美國Clontech 公司;EP 管,美國Axygen公司;Triton X-100,牛血清白蛋白,山羊血清,嘌呤霉素,北京索萊寶科技有限公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純級。
PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad 公司;水平電泳槽,北京六一生物科技有限公司;倒置熒光顯微鏡,日本奧林巴斯公司;流式細胞儀,美國貝克曼公司;NanoDrop8000,美國賽默飛世爾科技有限公司;臺式高速冷凍離心機、冰箱(-80 ℃)、CO2培養(yǎng)箱、恒溫搖床、生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;臺式冷凍離心機,美國艾本德有限公司;渦旋混合器,德國IKA 公司;恒溫水浴鍋,上海比朗儀器;震蕩培養(yǎng)箱,上海旻泉儀器有限公司;冰箱(-20 ℃),中科美菱低溫科技股份有限公司;超純水儀,美國Millipore 公司。
1.3.1 永生化誘導載體的構建 豬成肌細胞永生化誘導載體構建流程如下:
引物設計,PCR 克隆目的片段→目的片段切膠回收→BP 反應構建中間載體→中間載體測序鑒定→LR 反應,轉化及終載體陽性克隆鑒定。
1.3.1.1 BP 反應構建pDown-TERT[NM_198253.3]中間載體 根據(jù)BP 反應原理,設計引物序列:attB site+特異性引物序 列:TERT BP-F:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGC CGCGCGCTCCCCTERT;BP-R:5 -GGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGTCCAGGATG GTCTTGAAGTCTG。PCR 反應體系:5×Primer STARTM Buffer,10 μL;dNTP Mixture(10 μmol/L),4 μL;引物-F(10 μmol/L )、引物-R(10 μmol/L)、模板DNA,各1 μL;Primer STARTMHS DNA Polymerase,0.5 μL;總體積50 μL。PCR 反應程序:98 ℃,3 min;98 ℃10 s,60 ℃10 s,72 ℃60 s,循環(huán)次數(shù)均為30 次;72 ℃5 min。PCR 反應結束后,進行瓊脂糖凝膠電泳,從瓊脂糖凝膠切下含目標片段的膠塊,通過Sanprep 柱式膠回收試劑盒進行DNA 回收,將DNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
參考質(zhì)粒小提試劑盒說明書,制備該載體構建過程中使用到的各種骨架載體DNA。BP 反應體系:attB-PCR 產(chǎn)物,75 ng;pDONR 221 骨架載體,75 ng;BP ClonaseTMII Enzyme Mix,1 μL;TE Buffer,pH 8.0,加至4 μL。BP 反應條件:25 ℃孵育1 h;反應后,加1 μL 蛋白酶K,37 ℃孵育15 min 終止BP 反應。
從-80 ℃中取出感受態(tài)細胞,冰上解凍;在超凈工作臺中,取5 μL BP 反應產(chǎn)物加入100 μL感受態(tài)細胞中,輕彈混勻;冰浴30 min;42 ℃熱激90 s;冰浴2~3 min;加入250 μL LB 培養(yǎng)基;250 r/min,37 ℃,搖菌培養(yǎng)(復蘇)1 h 左右;將復蘇的菌液涂布到含有Kana 抗生素的平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。隨機挑取3~6 個單菌落,將菌體涮洗在無菌0.2 mL 的無菌EP 管中,取1 μL 做菌落PCR的模板,剩余作為接種培養(yǎng)細菌抽提質(zhì)粒DNA 的菌種。
菌落PCR 反應體系:模板1 μL,dNTP Mixture(2.1 mmol/L)0.8 μL,測序引物-F1(10 μmol/L)0.5 μL,測序引物-R(10 μmol/L)0.5 μL,10 ×Buffer 1 μL,Taq DNA Polymerase 0.5 μL。菌落PCR 反應程序:94 ℃3 min;94 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃1 min/1~2 kb,循環(huán)次數(shù)均為25 次;72 ℃5~10 min。菌落PCR 結束之后,加入6×loading buffer 后電泳,參照DNA Ladder 挑選出能擴增出目標長度的克隆,接種到LB 培養(yǎng)基中,37 ℃250 r/min 培養(yǎng)過夜,隨后抽提小提質(zhì)粒DNA 送測序,采用Sequencher 軟件比對返還的測序結果和標準序列,測序正確的入門載體可以進入下一步LR反應構建最終載體。
1.3.1.2 LR 反應構建pLV [Exp]-EGFP:T2A:Puro-CMV>TERT[NM_198253.3]最終載體 通過LR 反應將目的序列重組到最終骨架載體,獲得含有目的序列的重組表達載體。首先進行LR 反應。LR 反應體系:pUP-CMV 10 ng,pDown-TERT[NM_198253.3] 10 ng,pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro 50 ng,LR clonase 1 μL,TE buffer 加至5 μL 終體系。LR 反應條件:25 ℃孵育3 h。反應結束后加入1 μL 蛋白酶K 37 ℃孵育15 min 終止反應。之后對反應產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞,菌落PCR,瓊脂糖凝膠電泳,接種培養(yǎng)細菌并抽提質(zhì)粒DNA(方法同1.3.1.1 節(jié))。采用NEB 的限制性內(nèi)切酶對最終載體的質(zhì)粒DNA 進行酶切,酶切反應結束后,瓊脂糖凝膠電泳并參照DNA Ladder 進行分析,能且僅能切出特定長度的DNA 條帶的載體ApaLI+EcoRV:936,660,3 985,1 246,5 356,即為正確的最終載體。
1.3.1.3 慢病毒包裝 對終載體進行質(zhì)粒DNA大提(方法參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書),通過脂質(zhì)體法轉染HEK293T 細胞及收毒,即:將HEK293T 細胞培養(yǎng)至融合度為80%~90%;更換新培養(yǎng)基1 h 后加入Opti-MEMI 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);分別混合A、B 液,其中A 液為1.5 mL Opti-MEM 與4 μg DNA(分別為包裝質(zhì)粒SL3、SL4、SL5 以及目的基因質(zhì)粒),將質(zhì)粒加入Opti-MEM中,然后用槍頭吹打混勻;B 液為1.5 mL Opti-MEM 與40 μL Lipofectamine 2000,用槍頭吹打混勻,室溫靜置孵育5 min;將A 液加入B 液中,用槍頭吹打混勻,室溫靜置孵育20 min;將孵育后的轉染復合物緩慢逐滴加入培養(yǎng)細胞的100 mm培養(yǎng)皿中,水平輕微晃動使其分布均勻,37 ℃,5%CO2培養(yǎng),轉染6 h 后更換培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)37 ℃,5%CO2培養(yǎng);轉染48 h 后收集培養(yǎng)基上清存放于4 ℃,添加同體積新鮮的含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),過24 h 再收集1 次培養(yǎng)基上清;將兩次收集的培養(yǎng)基上清一起進行濃縮,4 ℃,1 000×g 離心30 min,離心所得上清用0.45 μm 濾器過濾去除細胞碎片;將濾液加入離心管中,4 ℃50 000×g 離心2 h,棄上清,每管沉淀用200 μL HBSS 緩沖液重懸慢病毒顆粒,分裝后置于-80 ℃保存,得到的病毒可用于轉導細胞。
慢病毒純化:將200 μL 病毒濃縮液加入離心管中,上層加入1.5 mL 20%蔗糖溶液,平衡后4℃50 000×g 離心2 h;離心去上清,收集沉淀病毒顆粒,每管沉淀用200 μL HBSS 緩沖液重懸,分裝后凍存于-80 ℃,然后,采用ELISA 法測定慢病毒滴度。
1.3.1.4 細胞轉導 轉導前1 d,將一定數(shù)量的靶細胞接種至新的培養(yǎng)皿中(轉導時靶細胞的融合度在30%~50%),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~20 h;轉導當天,在冰上溶解凍結的病毒液,溶解后輕柔吹打混合病毒顆粒,去適量病毒至培養(yǎng)基中,輕柔混勻,盡可能地減少培養(yǎng)基使用量(100 μL/cm2),將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng);3~4 h 后取出培養(yǎng)基,換液,洗出含有病毒的培養(yǎng)基,加入新鮮的完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng);每24 h 換液1次,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況。
將表達熒光的細胞繼續(xù)培養(yǎng),藥篩之前進行細胞致死試驗。分別在24 孔板中加入終質(zhì)量濃度為0,1,2 μg/mL 和3 μg/mL 的嘌呤霉素,每組6個平行樣本,連續(xù)培養(yǎng)3~7 d,測試細胞致死狀態(tài),制作致死曲線。選擇細胞致死時間4~5 d 的嘌呤霉素濃度,加入表達病毒載體的轉導細胞中,連續(xù)培養(yǎng)4~5 d,直到培養(yǎng)過程中沒有死細胞產(chǎn)生為止,觀察載體表達情況。
1.3.1.5 細胞核型分析 在5 mL 培養(yǎng)液中加入50 μL 10 μg/mL 秋水仙素,抑制中期分裂的細胞,在37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)3~4 h,直至細胞核中有圓形發(fā)亮的球形為止。將細胞培養(yǎng)液轉移到15 mL 離心管中,然后,用PBS(37 ℃溫浴)洗滌培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞,洗滌2 次。加入0.25%胰酶+0.02%EDTA 消化,3 min 左右,加入細胞培養(yǎng)液終止消化,用彎頭吸管輕輕吹打細胞生長面,然后,將細胞懸液轉移到上述15 mL 離心管中,1 000 r/min 離心10 min,棄上清液,留約0.5 mL。加入預熱(37 ℃)的0.075 mol/L KCl 溶液至5 mL,于37℃水浴低滲處理25 min;低滲結束后加入0.5 mL固定液(V甲醇∶V冰乙酸=3∶1,現(xiàn)用現(xiàn)配),混勻后,迅速離心(1 000 r/min,10 min),棄上清液,留少許液體。加入4 mL 固定液,室溫固定20 min,1 000 r/min 離心8 min,棄上清液,留少許液體,重復2次。將離心后的細胞懸浮開,以10~30 cm 高度滴到冰水(0~4 ℃)預冷、傾斜45°的載玻片上,并迅速將滴上的細胞吹開,在酒精燈上輕輕過2~3 遍,細胞面朝上,吸水紙吸去多余液體,室溫下晾干,約10~15 min;細胞面朝下,扣在染色玻璃板上,打入PBS(1 ∶10)稀釋的吉姆薩染色液,避免打入氣泡,染色15 min,蒸餾水沖洗,吸水紙吸去多余液體,10~15 min 后顯微鏡下觀察。
1.3.2 細胞端粒免疫熒光染色 PBST:含0.5%Triton X-100 的PBS 溶液。封閉液:含10%山羊血清的PBST 溶液。二抗稀釋液:稱取1 g 牛血清白蛋白(BSA),溶于100 mL PBS 中,即1% BSA 的PBS 溶液。取出備用細胞,棄培養(yǎng)基,PBS 洗2 次。加入4%固定液室溫固定15min。PBS 洗3 次,每次5 min。用PBST 溶液進行透化,室溫10 min。PBS 洗1 次,5 min 加入封閉液,室溫封閉30~60 min。棄封閉液,加入一抗(1 ∶200)稀釋于封閉液中,37 ℃孵育2 h,1% BSA 的PBS 洗3 次,每次5 min 加入二抗(1∶400)稀釋于二抗稀釋液中,37 ℃避光放置1 h。PBS 洗3 次,每次5 min。加入終濃度的DAPI(1 ∶10 000)/Hoechst(1 ∶5 000),室溫放置5 min。PBS 洗3 次,每次5 min。加入500 μL PBS,在熒光顯微鏡下拍照或避光保存。
1.3.3 流式細胞術鑒定陽性細胞 將單細胞懸液加入2 mL 圓底離心管中,離心,1 500 r/min,5 min,棄上清液。用1 mL 1×PBS 洗滌1 次,離心。4%PFA 1 mL,4 ℃固定30 min。用1×PBS 1 mL 洗滌1 次,離心。1% Triton-100 1 mL,室溫10 min。用1 mL 1×PBS 洗滌1 次,離心。加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200 μL,用移液器輕輕吹打混勻,置冰上孵育30~60 min。離心,棄上清液。加入1 mL 冷PBS,離心洗滌2 次,除去未結合的抗體成分。向細胞中加入500 μL 冷PBS,吹打混勻,置流式管中,4 ℃避光保存,上流式細胞儀。
1.3.4 RNA 提取及熒光定量PCR 用細胞刮刮取細胞,在4 ℃離心機中離心,棄上清,采用RNA提取試劑盒提取RNA,將RNA 洗脫后轉入-80 ℃保存,備用。以2 μg 體系逆轉錄RNA 為單鏈的cDNA。根據(jù)RNA 濃度,構建反應體系,即:RNA,2 μg;oligo DT,1 μL;dNTP,1 μL;總體系15 μL。65 ℃金屬浴加熱5 min,轉至冰上冷卻降溫。冷卻后加入以下反應體系:M-MLV,0.5 μL;RRI,0.5 μL;5×Buffer,4 μL。37 ℃金屬浴50 min,70 ℃金屬浴10 min。置于-20 ℃保存,備用。通過NCBI Gene bank 查詢基因TERT(Gene ID:492280)、Hnrnpc(Gene ID:100626496)、β-actin(Gene ID:414396)序列信息。通過NCBI Primer-BLAST 在線設計引物,所設計引物信息如下:
表1 目的基因引物序列Table 1 Target gene primer sequence
以逆轉錄后得到的cDNA 為模板,稀釋10倍,以20 μL 體系進行RT-PCR 試驗。反應體系:2 ×SYBR Green PCR Master Mix,10 μL;PCR Forward Prime,PCR Reverse Prime,各0.6 μL;cDNA,2 μL;DEPC 水,6.8 μL,總體積20 μL。每個試驗組設置3 個平行試驗。冰上操作,依次加入18 μL MIX 溶液,2 μL cDNA。程序如下:第1 階段,95 ℃10 min;第2 階段,95 ℃15 s,60 ℃30 s;第3階段,95 ℃ 5 min;65 ℃ 5 min;95 ℃ 5 min。
采用2-ΔΔCt法處理、分析試驗數(shù)據(jù)。
式中,R——基因相對表達量;Ct0(GOT)——對照組基因的Ct;Ct0(ref gene)——對照組內(nèi)參基因的Ct;Ct(GOT)——樣品組基因的Ct;Ct0(ref gene)——樣品組內(nèi)參基因的Ct。
為了探索細胞培育肉用細胞的永生化誘導,通過脫毒的慢病毒進行過表達載體的構建,將TERT 端粒酶逆轉錄酶CDs 序列進行PCR 全長克隆。結果顯示(圖1):TERT 序列CDs 區(qū)全長為4 801 bp,載體類型為哺乳動物基因表達載體,啟動子為CMV,ORG 開放閱讀框為本研究目的基因。同時設置EGFP 熒光表達載體和嘌呤霉素藥篩原件,載體抗性為氨芐。載體中設置酶切位點有HpaI、ApaLI、DraIII、ApaLI+XhoI、ApaLI+NdeI、ApaLI+HpaI、ApaLI+DraIII。構建完成的載體通過多引物PCR 驗證和測序驗證,結果良好,序列無突變發(fā)生。
圖1 永生化誘導過表達載體圖譜及突變檢測Fig.1 Immortalization-induced overexpression vector map and mutation detection
為了測定細胞轉染最佳轉導滴度,首先進行空載體轉導試驗。分別通過10,20,30 滴度對細胞進行轉導,明確20 滴度的轉導優(yōu)勢后,通過15,20 和25 3 個滴度進行轉導驗證,結果表明,轉導滴度為25 時轉導細胞效率最高,進而將病毒載體通過25 滴度的濃度轉導到豬成肌細胞中,在48 h 端粒酶逆轉錄酶載體開始表達,96 h 后表達量開始升高,轉導180 h 后,端粒酶逆轉錄酶的載體表達達到最高值(圖2)。細胞轉導效率較高,可進行后續(xù)試驗。
圖2 細胞轉導后載體表達時序分析Fig.2 Time series analysis of vector expression after cell transduction
為了去除假陽性細胞,通過嘌呤霉素進行陽性細胞的篩選。首先進行細胞培養(yǎng),當細胞貼壁24 h 時,以0,1,2 μg/mL 和3 μg/mL 的質(zhì)量濃度對普通細胞做致死試驗,繪制致死曲線。結果表明(圖3a):空白對照組中的細胞正常增殖,生長曲線呈現(xiàn)S 型,證實細胞的狀態(tài)和增殖能力處于正常水平。在添加1 μg/mL 嘌呤霉素的組別中,前3 d細胞致死趨勢較為平緩,從第3 天開始細胞致死速度加快,而相對2 μg/mL 和3 μg/mL 質(zhì)量濃度細胞致死效率仍較低,截止第6 天細胞仍未全部死亡,因此,該質(zhì)量濃度的藥篩試驗較為漫長,不適合陽性細胞的篩選。在2 μg/mL 組別中,前5 d的細胞致死率趨于一致,到第6 天細胞完全致死,致死速度較為緩和;同時,在5~6 d 細胞全部死亡,符合本研究中細胞的藥篩試驗。當添加量為3 μg/mL 時,細胞第3 天就全部死亡,說明藥篩濃度過高,不利于陽性細胞的增殖。
陽性細胞篩選完成后進行細胞連續(xù)傳代驗證,結果顯示:誘導后的第1 代細胞(圖3b)的增殖能力顯著低于常規(guī)同代次的細胞(細胞為豬細胞傳代5 代,將凍存1 年的細胞進行誘導處理),表明此時誘導的細胞尚未從細胞轉導過程中恢復過來,細胞增殖能力和細胞活力相對較差。空白組細胞進入指數(shù)期時,誘導組的細胞尚處于潛伏期,對比空白組,誘導組的細胞沒有明確的潛伏期和指數(shù)期,同時指數(shù)期極不顯著,空白組的細胞在第5 天進入平臺期后,誘導組的細胞尚未進入指數(shù)期。當傳代至20 代時(圖3c),誘導的細胞增殖能力及活力已經(jīng)顯著恢復,細胞增殖曲線與空白組細胞沒有顯著差異。當誘導組細胞傳代至180 代時(圖3d),細胞活力和增殖能力呈下降趨勢,差異不顯著,同傳代20 代的空白對照組細胞相比(常規(guī)細胞無法傳代至180 代,不能單一變量對比),細胞的增殖能力雖然比空白組差,但是差異不顯著。此時誘導組的細胞已經(jīng)突破生理極限,突破了“Hay flick”界限(細胞最大分裂次數(shù))。由此證明本研究中的細胞永生化誘導取得初步成功。
圖3 細胞凋亡及增殖曲線Fig.3 Apoptosis and proliferation curves
為了檢測陽性細胞的藥篩效率,分別在誘導細胞加入嘌呤霉素的第2,4,6 天時進行流式細胞術的細胞鑒定。由于有誘導陽性的細胞表達綠色熒光蛋白,因此通過PI 對所有細胞進行染色,通過綠色熒光通道進行細胞分群(圖4),結果顯示:第2 天時,細胞明顯產(chǎn)生分群效應,直方圖峰值有兩個。同時對細胞進行十字門分群,結果發(fā)現(xiàn),62.11%的細胞為表達綠色熒光蛋白的陽性細胞,36.23%的細胞為未被嘌呤霉素殺死的陰性細胞。當藥篩進行到第4 天,直方圖結果顯示第1 峰值顯著降低。對細胞進行圈門,十字門分群后陽性細胞比例為78.92%,顯著高于第2 天的62.11%,同時陰性細胞的比例為21.08%,較第2 天顯著降低;第6 天時,細胞直方圖顯示為單峰,陽性細胞比例為100%(存在極少數(shù)的陰性細胞在圈門外,比例接近于0),陰性細胞已通過嘌呤霉素全部篩除。通過流式細胞術鑒定細胞藥篩效率,一方面可以精準判斷陰性細胞的去除效率,減少后期陽性細胞增殖過程中的細胞混合污染問題,另一方面,在篩選過程中當陰性細胞致死后及時更換培養(yǎng)基,避免藥篩試驗對陽性細胞產(chǎn)生過多的干擾或不確定的影響。
圖4 流式細胞術鑒定陽性細胞純化程度Fig.4 Purification degree of positive cells identified by flow cytometry
為了驗證成肌細胞永生化誘導后是否產(chǎn)生染色體異變情況,對誘導后傳代50 代的細胞進行染色體核型分析(圖5)。參照國際家養(yǎng)動物分帶核型標準化會議提出的家豬染色體核型分類標準,將豬染色體分為A、B、C、D 組。按照組內(nèi)染色體相對長度排列,分別標記以1~18 的標號。A 組為第1~5號染色體,亞中著絲粒染色體(sm),其中1 號染色體最長;B 組為6,7 號染色體,亞端著絲粒染色體(st);C 組為第8~12 對染色體,中著絲粒染色體(M),X 染色體為中著絲粒染色體,屬于C 組;Y 染色體為所有染色體中最小的,同樣是中作私立染色體;D 組為第13~18 號染色體,端著絲粒染色體(T),其中13 號染色體相對長度僅次于1 號染色體。結果顯示:1 號染色體中央著絲粒和次縊痕染色深,2 號染色體短臂有4 條深帶,長臂有6~7 條深帶,分3 個區(qū);3 號染色體著絲粒染色濃,在短臂和長臂的中端各有1 條明顯寬闊的淺帶;其它染色體從形態(tài)、長度和臂比上看均為產(chǎn)生顯著的異變,揭示了本研究中永生化誘導未對染色體產(chǎn)生不可預測的異變。
圖5 細胞核型分析Fig.5 Karyotype analysis
在染色體復制過程中,細胞每進行一次染色體復制,末端DNA 都會發(fā)生丟失。端粒是短的多重復的非轉錄序列(TTAGGG)及一些結合蛋白組成特殊結構,除了提供非轉錄DNA 的緩沖物外,它還能保護染色體末端免于融合和退化,在染色體定位、復制、保護和控制細胞生長及壽命方面具有重要作用,并與細胞凋亡、細胞轉化和永生化密切相關。當細胞分裂1 次,每條染色體的端粒就會逐次變短一些。構成端粒的一部分基因約50~200個核苷酸,會因多次細胞分裂而不能達到完全復制(丟失),以至細胞終止其功能,不再分裂。嚴重縮短的端粒是細胞老化的信號。在某些需要無限復制循環(huán)的細胞中,端粒的長度在每次細胞分裂后,被能合成端粒的特殊性DNA 聚合酶-端粒酶所保留。
hnRNPA2 蛋白可與端粒DNA 和端粒酶發(fā)生作用,主動打開端粒G-四鏈體接頭,將端粒3` 短的5 個堿基暴露出來,促進其和端粒酶的RNA 模板配對,從而增強端粒酶的催化活性和進行性,可以調(diào)控端粒長度平衡,維持細胞分裂和增殖能力。本研究中細胞的永生化誘導方案即通過端粒酶逆轉錄酶過表達實現(xiàn)。為進一步驗證細胞誘導效果,對端粒酶和A2 蛋白進行免疫熒光標記,結果顯示(圖6):在永生化誘導的細胞中hnRNP A2 蛋白的表達與端粒酶活性呈正相關,兩個蛋白共定位于卡佳爾體和端粒,hnRAP A2 的表達促進了端粒的延長。此外,在成體細胞中,端粒酶是無法被檢測到的,而在本誘導細胞株中,可以檢測到端粒酶的表達,證明細胞的誘導成效顯著。另外,hn-RNP A2 蛋白的表達促進端粒DNA 的延長,進一步說明細胞端粒長度縮短機制被打破,端粒開始延長或者延緩縮短,獲得細胞永生化誘導細胞株。
圖6 hnRNPa2 及TERF2 免疫熒光染色Fig.6 hnRNPa2 and TERF2 immunofluorescence staining
端粒作為短的多重復非轉錄序列,與細胞老化和機體衰老存在最直接的關系,相較于端粒的長短,端粒變短的速度具有更重要的意義。本研究中通過定量PCR 對永生化誘導細胞株(傳代180代)和常規(guī)細胞株(傳代30 代)對比,檢測端粒長度和變短的速率,以期驗證永生化細胞誘導效率。結果表明:在正常培養(yǎng)狀態(tài)下,細胞無法傳代至180 代,而對照組中的細胞為30 代細胞,對比結果顯示:永生化誘導的細胞相對端粒酶長度顯著高于對照組(圖7a),從側面揭示細胞永生化誘導的效率高,細胞傳代能力和細胞活力顯著高于對照組。此外,hnRAPC 蛋白活化對端粒酶活性具有激活作用。本研究中對hnRAPC 基因表達量進行定量PCR(圖7b),結果顯示永生化誘導組的表達量顯著高于對照組,揭示該蛋白在端粒中的活化功能,以及誘導組細胞蛋白活性顯著高于對照組,表明永生化細胞誘導獲得成功,細胞傳代能力得到顯著提升。
圖7 端粒酶逆轉錄酶及四聚體表達量分析Fig.7 Analysis of expression of telomerase reverse transcriptase and tetramer
細胞培育肉作為一門新興科學技術,雖然研究時間相對較短,但是其作為細胞生物學、組織工程學及食品科學等多學科交叉融合的技術已經(jīng)具備深厚的研究基礎[23],尤其是細胞培育肉種子細胞的使用方面,可供細胞培育肉種子細胞使用的細胞類型主要有胚胎干細胞、誘導多能干細胞、間充質(zhì)干細胞等多能干細胞以及包括肌衛(wèi)星干細胞、脂肪前體細胞等單能干細胞[24-26]。值得注意的是多能干細胞的優(yōu)勢在于其具有干細胞特性,可以無限增殖和定向分化,而多能干細胞在增殖過程中的干性維持尚未完全闡明,在細胞定向分化過程中,存在批量性和統(tǒng)一性的問題,容易產(chǎn)生不定向分化,同時其培養(yǎng)成本相對較高,不適合于細胞培育肉的規(guī)?;圃靃27];而單能干細胞在使用過程中,一旦活化,細胞便發(fā)生不可逆的分化過程,并且隨著干性的消失,細胞傳代次數(shù)受到限制,制約著細胞的規(guī)?;鲋砙28]。因此,在細胞培育肉研發(fā)過程中,獲得相應的可以無限增殖的成體細胞,是解決其工業(yè)化過程中細胞來源的重要保障。
在基因水平層面,細胞永生化的方法目前主要有SV40 大T 抗原法[29]、端粒酶逆轉錄酶法[30]、HPV16 E6 法[31]、原癌基因以及抑癌基因[32]等方法。SV40 主要通過SV40 抗原片段整合到靶細胞的細胞核中并表達,從而構建永生化細胞系。端粒酶逆轉錄酶法則是基于端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因調(diào)控端粒酶的活性,進而誘導細胞永生化。HPV16 E6 是通過病毒編碼蛋白與宿主細胞的調(diào)節(jié)蛋白形成復合物,破壞細胞有絲分裂和DNA 修復過程,進而激活端粒酶而實現(xiàn)正常細胞的永生化。諸如c-Myc、RAS、c-fos、Bmi1 及CDK4等原癌基因可以激活端粒酶的活性,進而促進細胞向永生化過渡;相反的,p53、p21、pRb 等抑癌基因則是通過基因的干擾或者敲除,從而抑制細胞老化,反向協(xié)同端粒酶的激活,實現(xiàn)細胞的永生化。這些細胞永生化的方法各有利弊,作為食品科學研究,細胞培育肉使用的種子細胞首先需要排除人源因素,同時保證細胞的活性及各項功能,更重要的是細胞永生化的誘導不能干擾各類種子細胞的正常使用,即不能引入不確定因素。
本研究通過端粒酶逆轉錄酶載體法誘導細胞永生化,端粒酶逆轉錄酶導入細胞后隨著細胞分裂過程,同步表達逆轉錄酶的催化亞基,調(diào)節(jié)端粒酶的活性[33]。同時與hnRNPA2 蛋白發(fā)生作用,打開端粒G-四鏈體結構,暴露端粒3` 端堿基,促進其與端粒酶RNA 模板配對,從而增強端粒酶的催化活性及進行性,有效維持端粒酶的長度,其意義在于減低(負調(diào)控)端??s短的速度,使端粒維持一定的長度,從而實現(xiàn)細胞的永生化[34]。本研究中永生化細胞的特點是:除了端粒酶逆轉錄酶,不再引入新的影響基因,以保證細胞的正常表達水平和功能。細胞在傳代180 代后仍具有較高的增殖和分化效率。通過定量PCR、免疫熒光標記等手段驗證誘導細胞株結果,可以推測細胞穩(wěn)定性較高,沒有發(fā)生不可預測的突變現(xiàn)象。綜上所述,建立了一株可以穩(wěn)定表達、高效傳代的豬成肌細胞永生化細胞系。
本研究構建豬成肌細胞永生化誘導載體,探索細胞永生化誘導方案和研究材料;通過細胞核轉染、陽性細胞流式細胞儀篩選獲取陽性細胞株;通過定量PCR、免疫熒光標記、核型分析等驗證細胞的穩(wěn)定性;對陽性細胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng),驗證細胞可傳代超過200 代。本研究的實施為細胞培育肉種子細胞的開發(fā)探索了理論基礎,提供了工業(yè)化生產(chǎn)的細胞材料,為培育肉工業(yè)化生產(chǎn)提供先導條件。