不同品種大白菜自交不親和強度與柱頭ROS含量的關(guān)系

趙歡歡,張麗麗,黃家保,段巧紅

不同品種大白菜自交不親和強度與柱頭ROS含量的關(guān)系

趙歡歡,張麗麗,黃家保,段巧紅*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室, 山東 泰安 271018

不同品種的大白菜其自交不親和強度不同。前期發(fā)現(xiàn)，大白菜等十字花科蔬菜作物的自交不親和是由柱頭活性氧（ROS）調(diào)控的。本研究以大白菜強自交不親和系′ZY15′及弱自交不親和′6683′、′848′和′R16′為試材，比較了自交不親和強度的不同與柱頭ROS含量變化的關(guān)系。結(jié)果表明，具有強自交不親和性的大白菜在自花授粉后，柱頭ROS升高更快、升高的幅度更大；用DPI克服強自交不親和的大白菜更困難。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識大白菜自交不親和的調(diào)控機理、打破大白菜自交不親和奠定基礎(chǔ)。

大白菜; 自交; ROS

植物的花粉落到柱頭上，開始吸水，萌發(fā)出花粉管，穿透花柱，最終進(jìn)入胚囊，釋放精細(xì)胞，完成雙受精[1]。以上受精步驟，只要在某一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)了障礙，就無法完成受精，都是自交不親和（Self-incompatibility，SI）的表現(xiàn)。根據(jù)花器官形態(tài)有無差異，SI可分為異形自交不親和性和同形自交不親和性。同形自交不親和性又可以分為配子體型自交不親和性和孢子體型自交不親和性[2,3]。大白菜（ssp）是十字花科蕓薹屬（Brassica）植物，具有“干”柱頭，屬于孢子體型自交不親和，花粉的行為由產(chǎn)生花粉的植株決定[2,3]。當(dāng)自花的花粉落到柱頭上，柱頭乳突細(xì)胞有效地識別自花，阻止自花花粉水合及萌發(fā)[2,3]。

活性氧（ROS）作為重要的信號分子參與植物多個生物學(xué)過程[4-8]。很多種被子植物的柱頭上積累大量ROS，特別是過氧化氫（H2O2）[9-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柱頭ROS在自花授粉后升高而在異花授粉后降低，且柱頭ROS的升高對于抑制自花花粉生長是必需的[13]。本研究選用了自交不親和強度不同的大白菜品種，發(fā)現(xiàn)自交不親和強弱與自花授粉后柱頭ROS升高的幅度成正比，而與用ROS合成抑制劑克服自交不親和的難易程度成反比。本研究進(jìn)一步解析了柱頭通過其ROS含量調(diào)控自交不親和的機理，同時也為十字花科蔬菜作物育種工作中克服自交不親和性以提高自交繁種效率提供了指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大白菜品種為自交不親和系′ZY15′、′6683′、′R16-11′，由河南農(nóng)科院提供，′848′商品種。試驗于2017年2月到2018年3月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田進(jìn)行。每隔15 d種植一批材料，每個品種每次種植15棵，先用75%酒精、2.6%次氯酸鈉殺菌消毒，時間各3 min，然后將種子放在滅過菌的2 mL離心管中，加入1.5 mL滅菌的ddH2O，45 ℃水浴2 h，期間準(zhǔn)備滅過菌的6 cm濾紙及培養(yǎng)皿，將2張濾紙放到培養(yǎng)皿中后加入滅菌ddH2O，把濾紙全都浸濕，再將經(jīng)過水浴處理的種子倒在濾紙上用鑷子分散開來，做好標(biāo)記放到23 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件放置2 d左右，此時萌動出下胚軸，再將培養(yǎng)皿放到4 ℃低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行春化，′R16-11′，′848′的春化時間為15 d，′6683′春化時間為20 d，′ZY15′春化時間為30 d；春化完成后移到滅菌土里（土的配比為營養(yǎng)土：蛭石=3:1），經(jīng)過60 d，各個大白菜開花后進(jìn)行試驗。

1.2 柱頭活性氧染色

柱頭ROS染色遵循課題組前期研究中使用的方法[13]。選擇當(dāng)天開放，并且花瓣開成正十字形的花朵，此時雄蕊低于雌蕊柱頭，且花粉尚未散開，去雄。將柱頭切下3 mm后，在MES-KCl緩沖液（10 mM MES，5 μM KCl，50 μM CaCl2，pH6.15）中浸泡30 min，再用含有50 μM,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate（H2DCFDA）的MES-KCl緩沖液避光染色1 h。用MES-KC緩沖液沖洗2遍，加入MES-KCl緩沖液浸泡15 min，再重復(fù)1次，脫去背景色。將樣品取出置于載玻片上，使用MES-KCl緩沖液制片，在Nikon DS-Ri2顯微鏡下用綠色熒光（Ex470-440, DM4951p, BA525/550）觀察。

1.3 實驗材料的處理

在檢測ROS抑制劑對柱頭ROS及對授粉的影響時，在含不同濃度DPI的柱頭培養(yǎng)基（5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 0.01% H3BO3, 1 mM MgSO4·7H2O, 10% sucrose, 0.8% agarose, pH 7.5）中體外培養(yǎng)6 h。處理完成后，授粉進(jìn)行苯胺藍(lán)染色以觀察花粉管生長，或進(jìn)行ROS染色。

1.4 花粉管的觀察

在檢測ROS抑制觀察花粉管遵循課題組前期研究中使用的方法[13]。將授粉6 h的柱頭用卡諾固定液（甲醇:乙酸=3:1）固定1 h，在10 M NaOH中于42 ℃軟化30 min，0.1%苯胺藍(lán)染色1 h后顯微鏡下用紫外熒光（Ex375-328/DM415/BA351p）觀察。

1.5 親和指數(shù)的計算

在大白菜盛花期時，選取花序進(jìn)行套袋。剛要開的花，去雄，授自花花粉，套袋隔離。待種子成熟時，統(tǒng)計結(jié)莢數(shù)、種子數(shù)量，計算親和指數(shù)（結(jié)籽數(shù)/授粉花數(shù)）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Nikon DS-Ri2熒光顯微鏡觀察，用image J進(jìn)行數(shù)據(jù)測量，Photoshop2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大白菜花期親和指數(shù)統(tǒng)計分析

首先比較不同品種大白菜花期與蕾期柱頭的自交親和性。在圖1A中所示大白菜花序的花期與蕾期柱頭進(jìn)行自花授粉或異花授粉。結(jié)果如圖1B所示，′ZY15′與′66-83′都表現(xiàn)出自花花粉管生長受抑制，異花花粉管卻可以生長的典型的自交不親和表型。在蕾期自交授粉20 d后，′ZY15′和′6683′果莢均顯著伸長（圖1 C）。而在花期自交授粉20 d后表現(xiàn)出，′ZY15′果莢基本未發(fā)育，且出現(xiàn)發(fā)黃、皺縮甚至脫落的現(xiàn)象（圖1 D）?！?683′與′ZY15′相似，表現(xiàn)果莢大部分未發(fā)育且出現(xiàn)果莢發(fā)黃、皺縮甚至掉落的現(xiàn)象，但是少數(shù)果莢表現(xiàn)出胚珠膨大（圖1 D）。

圖1 不同品種大白菜自交果莢表型

A：大白菜花序；B：自交異交授粉苯胺藍(lán)對比, 標(biāo)尺500 μm；C,D：蕾期、花期自花授粉20 d后果莢發(fā)育表型。標(biāo)尺=1 cm,**<0.01，T檢驗。

A: An image of Chinese cabbage inflorescence; B: Aniline Blue staining of pistils after self- or cross-pollination, scale bar=500 μm; C,D: Image of pods at 20 days after self-pollination at bud and flower stage. Scale bar=1 cm, **<0.01, T test.

我們進(jìn)而比較了′ZY15′、′6683′、′848′、′R16-11′的花期自交親和指數(shù)，結(jié)果如表1所示，′ZY15′的花期親和指數(shù)只有0.35，也就是1個果莢內(nèi)平均有0.35粒種子，而′6683′的親和指數(shù)為0.94，一個果莢內(nèi)平均有0.94粒種子。這說明′ZY15′是強自交不親和系，而′6683′是弱自交不親和系。另兩個白菜品種，′848′與′R16-11′的花期親和指數(shù)分別是0.42和0.55，表明這兩個品種的自交不親和強度比較接近。

表1 不同品種的大白菜花期親和指數(shù)統(tǒng)計

*每列中字母相同者表示差異未達(dá)顯著水平（>0.05），字母不同者表示差異達(dá)顯著水平（<0.05）。

The same alphabets in right side of the same list show no significance （>0.05）, on the contrary, having significant difference （<0.05）.

2.2 異花授粉和自花授粉對大白菜柱頭ROS的影響

圖2 大白菜自交與異交活性氧染色

標(biāo)尺=500 μm。**<0.01，T檢驗。Scale bar = 500 μm，**<0.01, T test.

ROS作為信號分子可以參與植物細(xì)胞多種不同的生物學(xué)過程[10-12]。在相同條件下，分別對′ZY15′柱頭進(jìn)行異花授粉和自花授粉。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)′ZY15′異花授粉3 min時，柱頭ROS顯著降低，比未授粉柱頭下降了33%；在授粉后10 min時，柱頭ROS進(jìn)一步下降，比未授粉柱頭下降了60%。當(dāng)′ZY15′自花授粉3 min時，柱頭ROS顯著升高，比未授粉柱頭升高了20%；而在授粉后10 min時，柱頭ROS進(jìn)一步升高，比未授粉柱頭升高了53%。這表明，柱頭ROS是由自花授粉及異花授粉特異性調(diào)控的。

2.3 自交不親和強度不同的大白菜自交后柱頭ROS變化的差異

為了檢測自交不親和強度的不同是否與柱頭ROS的變化有關(guān)聯(lián)，我們分別檢測了強自交不親和系′ZY15′與弱自交不親和系′6683′花期柱頭ROS在自花授粉1 min之后的變化。結(jié)果如圖3所示，未授粉時，′ZY15′柱頭ROS熒光強度為15左右，′6683′柱頭ROS相對熒光強度為18左右，二者柱頭ROS初始水平基本相同。授粉1 min后，′ZY15′柱頭ROS熒光強度為38左右，和初始水平相比有顯著性差異。而′6683′柱頭ROS相對熒光強度為21左右，和初始水平相比無顯著性差異（圖3）。結(jié)果表明，對于自交不親和大白菜來說，自交不親和性越強，柱頭ROS變化幅度越高，升高越快。

圖3 自交不親和強度不同的大白菜自花授粉1 min后柱頭ROS變化

2.4 抑制ROS產(chǎn)生的試劑，DPI，對大白菜柱頭ROS的影響

NADPH氧化酶在植物中也稱之為呼吸迸發(fā)氧化酶(respiratory burst oxidase homologs，Rboh)，NADPH氧化酶可能是應(yīng)激條件下ROS產(chǎn)生和積累的主要ROS合成酶[7,8]。Diphenyleneiodonium chloride（DPI）是一個廣泛的黃素蛋白抑制劑，可以有效的抑制NADPH氧化酶的活性，降低ROS含量[6]。大白菜′R16-11′柱頭經(jīng)DPI處理后，隨著DPI濃度的提高，大白菜柱頭ROS含量逐漸降低（圖4）。未授粉柱頭ROS熒光強度為20左右，而用100 μM DPI處理后，ROS熒光強度為5左右，相對初始水平下降60%；DPI濃度1000 μM時，ROS相對熒光強度為2.5左右，相對初始水平下降87.5%，具有極顯著性差異。這表明DPI可以有效的降低大白菜柱頭ROS的含量。

圖4 DPI處理′R16-11′花期未授粉柱頭ROS變化情況

2.5 DPI克服不同品種大白菜的自交不親和

我們進(jìn)而用1 mM DPI處理柱頭，以檢測對不同品種大白菜自交不親和性的影響。對于強自交不親和大白菜′ZY15′，花粉粒無法粘附在未處理的柱頭上；而經(jīng)過DPI處理的柱頭，花粉?？梢责じ皆谥^上，有花粉管穿透柱頭乳突細(xì)胞，兩種白菜均表現(xiàn)出一定的親和性（圖5）。但親和性的變化程度存在顯著性差異，′ZY15′柱頭經(jīng)DPI處理后，有35%的柱頭有花粉管穿過柱頭乳突細(xì)胞，其中15%柱頭有多于30根花粉管穿過。而′6683′柱頭經(jīng)DPI處理后，60%的柱頭有花粉管穿過柱頭乳突細(xì)胞，其中40%柱頭有多于30根花粉管穿過；（圖5）。這表明，DPI可以克服不同品種大白菜的自交不親和性，但是自交不親和強度不同的大白菜對DPI的敏感程度不同。自交不親和強度越高，對DPI越不敏感，越難克服。

圖5 DPI對自交不親和強度不同的大白菜的影響

Bar=500 μm, **<0.01.

為了進(jìn)一步驗證DPI克服自交不親和與大白菜本身的自交不親和強度的關(guān)系，我們檢測了DPI對′R16-11′與′848′這兩種自交不親和強度基本相同的大白菜的影響。當(dāng)′R16-11′用DPI處理后，有50%的柱頭有花粉管穿過柱頭乳突細(xì)胞，其中20%柱頭有多于30根花粉管穿過；′848′柱頭經(jīng)DPI處理后，有40%的柱頭有花粉管穿過柱頭乳突細(xì)胞，其中9%柱頭有多于30根花粉管穿過（圖6），與DPI對′R16-11′自交不親和的克服程度相似。這表明，DPI克服大白菜自交不親和，確實與大白菜柱頭本身的自交不親和強度密切相關(guān)。

圖6 DPI對自交不親和強度相似的大白菜的影響

3 討論

大白菜等十字花科蔬菜作物常利用自交不親和系育種。為了提高雜交種純度，雜交親本的自交不親和性越高越好，但是強自交不親和系往往自交繁種困難，這樣就限制了強自交不親和系作為雜交親本的使用。因此，如何調(diào)控十字花科蔬菜作物的自交不親和，一直是亟待解決的難題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柱頭ROS在自花授粉后升高而在異花授粉后降低，且柱頭ROS的升高對于抑制自花花粉生長是必需的[13]。

而本研究通過對大白菜自交不親和強弱不同與柱頭ROS差異的分析，探討了活性氧含量與自交不親和性的影響，發(fā)現(xiàn)自交不親和性越強的品種，自交授粉后，柱頭ROS含量變化幅度越高越快，克服自交不親和性就越困難。這為生產(chǎn)上合理使用ROS抑制劑或清除劑，以便更有效的克服自交不親和，提高自交不親和系親本的繁種效率提供了理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

自交不親和性強弱不同，自交引起的柱頭ROS升高程度與升高快慢也不同。強自交不親和性的大白菜柱頭比弱自交不親和性的大白菜柱頭，ROS升高更快且升高幅度更大。且使用ROS抑制劑克服自交不親和性反應(yīng)越困難。

[1] 劉敬婧.高等植物受精過程中雌-雄相互作用的分子調(diào)控機制[J].中國科學(xué):生命學(xué),2013,43(10):842-853

[2] Jany E, Nelles H, Goring DR. The molecular and cellular regulation of brassicaceae self-incompatibility and self-pollen rejection [J]. Int. Rev. Cell Mol. Biol, 2019,343:1-35

[3] Nasrallah JB. Self-incompatibility in the Brassicaceae: Regulation and mechanism of self-recognition [J]. Curr. Top. Dev. Biol., 2019,131:435-452

[4] Potocky M, Jones MA, Bezvoda R,. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase are involved in pollen tube growth [J]. New Phytol, 2007,174:742-751

[5] Foreman J, Demidchik V, Bothwell JHF,. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth [J]. Nature, 2003,422:442-446

[6] Duan Q, Kita D, Li C,. FERONIA receptor-like kinase regulates RHO GTPase signaling of root hair development [J]. Proc Natl. Acad. Sci., 2010,107:17821-17826

[7] 丁坤峰,譚曉榮.植物NADPH氧化酶研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2010(8):723-728

[8] 張夢如,楊玉梅,成蘊秀,等.植物活性氧的產(chǎn)生及其作用和危害[J].西北植物學(xué)報,2014,34(9):1916-1926

[9] McInnis SM, Desikan R, Hancock JT,. Production of reactive oxygen species and reactive nitrogen species by angiosperm stigmas and pollen: potential signalling crosstalk?[J]. New Phytol., 2006,172:221-228

[10] McInnis SM, Emery DC, Porter R,. The role of stigma peroxidases in flowering plants: insights from further characterization of a stigma-specific peroxidase (SSP) from Senecio Squalidus (Asteraceae) [J]. J. Exp. Bot., 2006,57:1835-1846.-

[11] Zafra A, Rejon JD, Hiscock SJ,. Patterns of ROS accumulation in the stigmas of angiosperms and visions into their multi-functionality in plant reproduction [J]. Front Plant Sci., 2016,7:1112

[12] Lan X, Yang J, Abhinandan K,Flavonoids and ROS play opposing roles in mediating pollination in ornamental kale (var.) [J]. Mol. Plant, 2017,10(10):1361-1364

[13] Zhang L, Huang J, Su S,. FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa [J]. Current Biology, 2021,31(14):3004-3016.e4

The Correlation between the Self-incompatibility Strength and Stigmatic ROS Changes in Different Varieties of Chinese Cabbages

ZHAO Huan-huan, ZHANG Li-li, HUANG Jia-bao, DUAN Qiao-hong*

271018,

Different varieties of Chinese cabbages show different strength of self-incompatibility (SI). Previous study showed that SI in the Brassicaceae is regulated by stigmatic ROS. In this study, we compared the strength of SI and the change of stigmatic ROS after self-pollination in strong SI lines such as ′ZY15′ and weak SI lines such as ′6683′, ′848′, and ′R16′. After self-pollination, stigmatic ROS increased faster and to a bigger extent in stronger SI Chinese cabbage. We also tested the extent of NADPH oxidase inhibitor, DPI, in reducing ROS and breaking down SI in different varieties of Chinese cabbage. Result showed that DPI is less effective to overcome SI of Chinese cabbage with strong SI. Our study laid a foundation for the breakdown of SI in different varieties of Chinese cabbage.

sspself-incompatibility; Reactive Oxygen Species

S634.1

A

1000-2324(2022)05-0777-06

2021-04-24

2021-06-18

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)啟動經(jīng)費

趙歡歡(1994-),男,碩士研究生,研究方向:蔬菜有性生殖. E-mail:mh369477980@163.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:duanqh@sdau.edu.cn