簡(jiǎn) 何，簡(jiǎn) 江，周 娜

（1.四川省釀酒研究所，四川成都 610000；2.宜賓市酒類行業(yè)協(xié)會(huì)，四川宜賓 644000；3.四川中釀檢測(cè)有限公司，四川成都 610000）

我國傳統(tǒng)的白酒釀造技術(shù)包括固態(tài)發(fā)酵[1]、液態(tài)發(fā)酵[2]以及半固態(tài)發(fā)酵[3]。我國白酒釀造是典型自然發(fā)酵過程，主要以糧食谷物為原料，在糖化發(fā)酵劑的作用下，經(jīng)過傳統(tǒng)的糊化、糖化、發(fā)酵、蒸餾等工藝得到傳統(tǒng)白酒[4]。酶類物質(zhì)作為白酒發(fā)酵的關(guān)鍵物質(zhì)，相關(guān)酶的種類、濃度、混合比例及各組分的締結(jié)差異使得白酒呈現(xiàn)出不同風(fēng)味[5]。因此，系統(tǒng)地探討向白酒發(fā)酵體系中添加纖維素酶、半纖維素酶、酯化酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶等不同的酶類物質(zhì)，對(duì)提高出酒率、改善白酒品質(zhì)的影響，對(duì)傳統(tǒng)白酒的液態(tài)發(fā)酵工藝具有指導(dǎo)意義。

1 白酒釀造用酶的種類來源及釀造機(jī)制

1.1 釀造用酶主要種類及其性質(zhì)

白酒釀造用酶的種類、來源及其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 主要釀造用酶的種類、來源及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)

1.2 白酒釀造用酶的作用機(jī)制

我國白酒發(fā)酵屬于典型的自然發(fā)酵過程，是以糧食谷物等作物作為主要原料，在糖化發(fā)酵劑（大曲、小曲及麩曲等）的作用下，經(jīng)糊化、糖化、發(fā)酵、蒸餾、后熟、勾兌而得到的多組分體系[6]。白酒發(fā)酵過程的主要特點(diǎn)為酒醅水分較少，糖化與發(fā)酵兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行，取固態(tài)蒸餾后的酒醅，再次進(jìn)行加曲、糖化、發(fā)酵，最終得到風(fēng)味各異的白酒。對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過程而言，表面看似平靜，但內(nèi)部每種物質(zhì)的變化、分解、合成，均處于不斷的“運(yùn)動(dòng)”[7]中。具體的“運(yùn)動(dòng)”過程是指：糧食谷物等原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)，在酒醅中微生物所分泌的纖維素酶、酯化酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶系的共同作用下，將大分子物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為寡糖、氨基酸、脂肪酸等小分子有機(jī)物質(zhì)[8]，這些小分子物質(zhì)一部分被微生物代謝利用，另一部分作為形成白酒風(fēng)味成分的重要前體物質(zhì)[9]，對(duì)白酒的生成和風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用。

2 酶在白酒釀造中的應(yīng)用方式及應(yīng)用特征

2.1 纖維素酶和半纖維素酶在白酒釀造的應(yīng)用

纖維素酶是由內(nèi)切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等3 種酶類物質(zhì)組成的多酶系[10]。在液態(tài)白酒發(fā)酵過程中，纖維素酶能破壞糧食谷物等原料中纖維素的細(xì)胞壁，使其包裹的淀粉充分散落，并將其轉(zhuǎn)化成白酒液態(tài)發(fā)酵所需的糖類物質(zhì)，再由酵母發(fā)酵為酒精，從而提高出酒率[11]。半纖維素酶的主要成分為木聚糖，是一類常見的多糖物質(zhì)，在白酒生成過程更易被微生物所利用[12]，從而提高糧食谷物的利用率和出酒率，還可提升酒體的澄清度[13]。

李旭暉等[14]在四個(gè)不同固態(tài)發(fā)酵的酒醅中添加不同含量的纖維素酶，添加纖維素酶量最高的酒醅所產(chǎn)白酒品質(zhì)最好，醛類物質(zhì)含量最低，各酯類物質(zhì)含量較高；劉麗[15]和尚維等[16]的研究均表明，纖維素酶能不同程度地提高酒醅出酒率，分別將成品出酒率提高8%和13%，并提高其中酯類物質(zhì)含量；楊帆[17]和秦廣利等[18]通過利用纖維素酶對(duì)酒糟進(jìn)行預(yù)處理，加速對(duì)發(fā)酵底物的降解速度，較大程度地提升自然發(fā)酵過程中酒醅利用率。半纖維素酶對(duì)白酒液態(tài)發(fā)酵具有較大益處。徐曼等[19]通過向具有較高含量的阿拉伯木聚糖的玉米發(fā)酵培養(yǎng)基[20]中添加170 U/g 的木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)其生成白酒的酒精度可提高至未加木聚糖酶組的1.3倍。

2.2 酯化酶在白酒釀造的應(yīng)用

在白酒生產(chǎn)過程中，酯化酶是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶和磷酸酯酶的總稱[21]。酯化酶可以將酒醅中游離的有機(jī)酸和乙醇轉(zhuǎn)化成脂肪酸酯，直接生成酒體中的主要風(fēng)味物質(zhì)[22]。除了少量由糧食原料和蒸餾操作帶入酒體的酯類物質(zhì)外，酒體中的大量酯類物質(zhì)均是在酒醅發(fā)酵過程中所產(chǎn)生，主要是由酯化酶分解糧食原料經(jīng)過酶促酯化反應(yīng)所生成[23-24]。在各酯化酶中，脂肪酶因具有較好的酯化能力，對(duì)白酒中酯類物質(zhì)的合成具有至關(guān)重要的意義[9]。

現(xiàn)有研究表明，目前多種微生物均是生成酯化酶的重要來源，如紅曲霉、根霉等較多種類的菌株擁有高產(chǎn)酯化酶的能力。王曉丹等[25]從濃香型大曲中篩選得到一株高產(chǎn)酯酶的紅曲霉，其產(chǎn)的脂肪酶粗酶液應(yīng)用于原酒生產(chǎn)中，提高了成品酒中的己酸乙酯含量，并且提升了成品酒的產(chǎn)量與品質(zhì)；賴登燡等[26]利用根霉CS825 作為產(chǎn)酯化酶的菌株，采用固定化的方式在無溶劑相系統(tǒng)中酯化30 d，其酯化率可達(dá)到70%以上，更適宜白酒生產(chǎn)；孫海龍等[27]利用南極假絲酵母脂肪酶B 優(yōu)化了白酒丟糟的再利用條件，最終在最適條件下，生產(chǎn)酒樣中增香物質(zhì)得到了極大提高，并且其中乙酸乙酯和乳酸乙酯濃度均超過110 mg/100 mL；方躍進(jìn)[28]和王述榮[29]分別利用酯化紅曲霉與根霉菌、紅曲霉和酵母菌的混合霉菌應(yīng)用于酒醅中，最終均能使成品酒的優(yōu)級(jí)品率提高10 %以上。綜上所述，利用產(chǎn)酯化酶的菌株生產(chǎn)的酶劑能較大地提升白酒品質(zhì)并得以廣泛運(yùn)用。

2.3 蛋白酶在白酒釀造的應(yīng)用

蛋白酶是一類可以水解蛋白質(zhì)肽鏈的酶類總稱，根據(jù)其最適pH 值，可分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶[30]。白酒酒醅中酸度較高，且各類曲在擴(kuò)大生產(chǎn)白酒的過程中也不斷產(chǎn)生酸性物質(zhì)，因此酸性蛋白酶在白酒生成過程起到主要作用[31]。酸性蛋白酶既可以將酒醅中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸，與葡萄糖產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，生成決定白酒香型的關(guān)鍵型風(fēng)味物質(zhì)，又能促使L-氨基酸被酒醅中菌株所吸收，最終促進(jìn)菌株的生成代謝[32]。

黃永光[33]在白酒發(fā)酵過程中向酒醅添加酸性蛋白酶，發(fā)現(xiàn)其不僅能將酒精濃度提高至原有酒精濃度的138%，而且還能在較大程度上將成品酒的揮發(fā)性成分和總酸含量提升至284 %和136 %；向雙全等[34]通過探究酸性蛋白酶在大曲中最適的蛋白酶活力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活力為14.37 U/g 時(shí)，大曲的出酒率為48.1%；王立釗[35]和孫金旭等[36]分別向白酒發(fā)酵工藝中加入適量的酸性蛋白酶，成品酒中的雜醇油含量相對(duì)最低?？梢钥闯鏊嵝缘鞍酌甘怯绊懓拙浦须s醇油類物質(zhì)生成的關(guān)鍵因素，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，雜醇油類物質(zhì)的生成量隨之降低。由此可以看出，酸性蛋白酶對(duì)白酒中雜醇油類物質(zhì)生成量并不是單一的線性關(guān)系，后期仍需要繼續(xù)研究酸性蛋白酶對(duì)白酒發(fā)酵的影響。

2.4 糖化酶在白酒釀造的應(yīng)用

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶，能將糧食谷物中的淀粉等物質(zhì)依次水解成單一的葡萄糖單元，并通過構(gòu)型變化形成復(fù)合葡萄糖，再通過微生物的發(fā)酵作用，最終生成酒精[37]。現(xiàn)有研究表明，糖化酶單位酶活力越高，其轉(zhuǎn)化淀粉等物質(zhì)生成酒精的能力越強(qiáng)，最適pH4.0～4.5，耐酸能力較強(qiáng)，在白酒釀造的酸性環(huán)境中，仍能保持較高酶活力[38]。高級(jí)醇是呈現(xiàn)白酒獨(dú)特風(fēng)味的主要物質(zhì)，適量的高級(jí)醇可賦予白酒濃郁醇香，但白酒中若存在較高含量的高級(jí)醇，不僅影響口感，還將給人體帶來危害[37]。通過向酒醅中添加適量糖化酶，在提高白酒出酒率的基礎(chǔ)上，能有效控制高級(jí)醇的生成，保證酒體質(zhì)量。周天銀[39]和羅惠波等[40]均通過添加糖化酶發(fā)酵的措施，使白酒中高級(jí)醇的含量得以控制或者降低，出酒率得以提升；孫金旭等[36]通過對(duì)比添加與未添加糖化酶的實(shí)驗(yàn)組對(duì)醬香型白酒生成的影響發(fā)現(xiàn)，添加糖化酶實(shí)驗(yàn)組的高級(jí)醇生成量顯著降低。由此可看出，在利用糖化酶調(diào)控白酒中高級(jí)醇的生成量時(shí)，高級(jí)醇的含量隨糖化酶添加量的增加而減少[41]。

2.5 淀粉酶在白酒釀造的應(yīng)用

淀粉酶泛指可以水解淀粉的一類酶，根據(jù)作用于不同淀粉主要可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶[42]。α-淀粉酶又稱為液化酶，能將淀粉中α-1，4 葡萄糖苷鍵切斷成具有不同分子量的糊精，同時(shí)能將少量麥芽糖和葡萄糖迅速液化，進(jìn)而達(dá)到液化淀粉的目的，最終轉(zhuǎn)化生成麥芽糖、葡萄糖和異麥芽糖[43]?，F(xiàn)有研究[44]表明α-淀粉酶多用于酒精和液態(tài)白酒發(fā)酵過程中，可降低反應(yīng)底物黏度。β-淀粉酶因其直接作用于淀粉非還原性末端，通過瓦爾登反應(yīng)生成麥芽糖，故又稱為淀粉1,4-麥芽糖苷酶，多存在于麥芽與曲霉菌中，可廣泛應(yīng)用于啤酒糖化、酒精發(fā)酵、白酒生成等領(lǐng)域[45]。

2.6 其他酶在白酒釀造的應(yīng)用

單寧酶是一類可將單寧酸水解并生成沒食子酸及葡萄糖的酶類，通過減少單寧和沒食子酸對(duì)酵母的發(fā)酵生長產(chǎn)生抑制作用，從而促進(jìn)白酒發(fā)酵，提高酒體品質(zhì)[46]。果膠酶泛指能促進(jìn)果膠分解的酶類，通過與纖維素酶的協(xié)同作用，破碎分解糧食產(chǎn)物的細(xì)胞壁，充分釋放內(nèi)容物質(zhì)，不僅能縮短發(fā)酵周期，還能提升糧食利用率[47]。轉(zhuǎn)肽酶能夠?qū)㈤L鏈的蛋白質(zhì)分子切斷，釋放出氨基酸，具有較高酶活力的轉(zhuǎn)肽酶將提高白酒釀造過程中的氨基酸含量，促進(jìn)白酒中各香氣成分生成[48]。裂解酶、異構(gòu)酶作為參與微生物細(xì)胞內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化的重要酶類，在白酒發(fā)酵過程中主要參與糖類物質(zhì)向酒精轉(zhuǎn)化的進(jìn)程[49]。在白酒釀造過程中，參與其中的酶類物質(zhì)復(fù)雜多樣，現(xiàn)有研究多針對(duì)胞外酶，對(duì)于胞內(nèi)酶的探究相對(duì)較少，未來將在這方面有極大擴(kuò)展。

3 白酒釀造用酶的發(fā)展趨勢(shì)

3.1 復(fù)合酶技術(shù)在白酒釀造過程中的應(yīng)用

純種微生物合成酶的高催化單一性酶，具有酶活力強(qiáng)、用量少、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但因酶學(xué)底物的特異性，具有高度專一性，影響了白酒發(fā)酵的周期性，一定程度上限制了傳統(tǒng)白酒發(fā)酵的出酒率。因此復(fù)合酶發(fā)酵技術(shù)將成為白酒發(fā)酵的新方向。董友新[50]將具有復(fù)合功能的阿米諾酶與中溫曲一起加入發(fā)酵體系，與單一酶的發(fā)酵體系相比，在成品酒體品質(zhì)和風(fēng)味保持一致的條件下，對(duì)于淀粉原料的利用率提升了2 %～3 %，最終出酒率提升了2%；崔如生等[51]和張靜等[52]的研究均表明，將復(fù)合酶制劑應(yīng)用于白酒生產(chǎn)過程中，試驗(yàn)組成品酒的總酸、總酯等相關(guān)指標(biāo)明顯高于對(duì)照組，且成品酒中主要酯類物質(zhì)與其他微量成分比例協(xié)調(diào)，酒體風(fēng)味好。

3.2 固定化技術(shù)在白酒釀造過程中的應(yīng)用

一般而言，酶類制劑極易受到外界條件影響，具有酶活力不穩(wěn)定、易失活等特性，但其制造成本昂貴，且難以回收利用，造成了酶制劑在白酒釀造過程廣泛運(yùn)用的局限性[53]。酶的固定化技術(shù)正好可以解決這些問題。固定化技術(shù)即用固體材料將酶類物質(zhì)限制在一定區(qū)域內(nèi)，但酶類物質(zhì)仍然具有活躍的、特有的催化作用，可回收，并能長時(shí)間使用的一種技術(shù)[54]。梁龍?jiān)萚55]通過對(duì)比酯酶與固定化酶酯化合成風(fēng)味酯類物質(zhì)的能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，固定化后的酯酶不僅降低了酶含量的丟失，而且具有更高的催化形成風(fēng)味酯類物質(zhì)的能力；田梁等[56]以高粱糖化液為原料，采用序批式固定化菌液態(tài)發(fā)酵白酒工藝，通過優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵白酒固定化菌株的發(fā)酵條件，產(chǎn)總酸和總酯的含量分別為486.62 mg/L 和258.28 mg/L。該工藝縮短了酒精發(fā)酵時(shí)間，并且提高了白酒品質(zhì)。在處理白酒的副產(chǎn)物時(shí)，如黃水及酒尾等，直接使用固定化的酯化酶可以實(shí)現(xiàn)回收利用，對(duì)釀造后除雜醇油及處理副產(chǎn)物有極大的作用。王洪海等[57]得到的固定化酯化酶，對(duì)酯化白酒中雜醇油有一定的參考價(jià)值，不僅適合回收酶類物質(zhì)，也有利于增加酶效率。

3.3 基因工程技術(shù)在白酒釀造過程中的應(yīng)用

基因工程又稱DNA 重組技術(shù)，是指通過改造生物體基因組獲得所需基因產(chǎn)物的技術(shù)，被用于工程菌的構(gòu)建，通過基因過表達(dá)將含有目的基因的編碼區(qū)拼接至相應(yīng)的載體中，上調(diào)表達(dá)目的基因，使目的基因被過度轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而提高目標(biāo)蛋白或目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[58]。張翠英等[59]研究了低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母工程菌株對(duì)小曲酒品質(zhì)的影響，研究結(jié)果顯示，該菌株的添加對(duì)小曲酒酒度、殘?zhí)?、總酸和總酯基本無影響,高級(jí)醇含量的降低也并不明顯；王文宗等[60]運(yùn)用自制新型麩曲對(duì)糧糟和丟糟進(jìn)行釀酒發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此菌能極大地提高成品酒的產(chǎn)量和丟糟的資源利用率。

4 結(jié)語與展望

白酒傳統(tǒng)發(fā)酵主要依賴酒曲和酒醅中的酶類物質(zhì)進(jìn)行，向酒醅發(fā)酵、蒸餾勾兌以及酒糟利用的生產(chǎn)階段中添加不同種類和含量的酶類物質(zhì)，將極大提高糧食底物的利用率，提升白酒產(chǎn)量和品質(zhì)，如何協(xié)調(diào)各酶類物質(zhì)的相關(guān)比例，以及探究其復(fù)合酶類物質(zhì)的相關(guān)酶學(xué)機(jī)理、代謝體系仍是接下來需要深入探討的。同時(shí)，隨著代謝組學(xué)等相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，進(jìn)一步研究白酒發(fā)酵過程中各酶類物質(zhì)與發(fā)酵產(chǎn)物、香氣成分的相關(guān)關(guān)系，為定向調(diào)控生成更多益于白酒品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，以期為提高白酒品質(zhì)帶來更加長遠(yuǎn)的意義。