廣 敏 靳洪振 彭康堯 李華明 項(xiàng) 維 陳瑞格 雷連成，2* 張付賢*

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023;2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起的一種豬全身性疾病，感染該病的豬以腦膜炎、心包炎、纖維素性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎為主要特征[1]；不同階段豬群均對(duì)其易感，其中對(duì)斷奶前后和保育期的仔豬危害最為嚴(yán)重，是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一[2]。副豬嗜血桿菌可分為15個(gè)血清型，不同血清型菌株之間毒力存在顯著差異，且各血清型之間交叉保護(hù)力弱，導(dǎo)致疫苗的免疫效果差[3]。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖密度的增加，副豬嗜血桿菌感染以及與其他病原混合感染多發(fā)，是導(dǎo)致仔豬群死亡率上升的重要原因[4]，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

目前針對(duì)副豬嗜血桿菌的檢測(cè)方法主要有：細(xì)菌學(xué)分離鑒定[5]、血清學(xué)檢測(cè)方法[6]、分子生物學(xué)檢測(cè)方法及包括PCR[7]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[8]、數(shù)字PCR[9]、原位雜交(ISH)[10]等多種方法[11]，但這些方法均適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，且對(duì)設(shè)備依賴性高，不適合即時(shí)、臨場(chǎng)檢測(cè)。日本學(xué)者Notimi于2000年發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是一種適用于病原學(xué)診斷的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該方法利用4條特異性引物識(shí)別靶DNA中的6個(gè)片段，結(jié)合具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在恒定溫度下即可完成靶DNA的特異性擴(kuò)增[12]，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏和特異性高等特點(diǎn)。LAMP反應(yīng)在基因擴(kuò)增方面具有很大優(yōu)勢(shì)，已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，并成功應(yīng)用于分子檢測(cè)和診斷[13]。目前用來(lái)判定LAMP擴(kuò)增結(jié)果的方法主要有：焦磷酸鎂沉淀、染料法[14]、瓊脂糖凝膠電泳[15]、實(shí)時(shí)熒光定量法[16]和濁度法[17]，前2種判定方式存在因結(jié)果差異不明顯而造成觀察不便捷以及誤判等問(wèn)題，而后3種判定方式則需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，也無(wú)法完成即時(shí)檢測(cè)。因此，亟需建立一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確有效的副豬嗜血桿菌可視化診斷方法應(yīng)用于臨場(chǎng)和快速檢測(cè)。

目前，LAMP-LFD技術(shù)已成功應(yīng)用于乙型肝炎病毒、綿羊肺炎支原體等病原的檢測(cè)[18-20]，但對(duì)副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在建立一種適用于基層副豬嗜血桿菌臨場(chǎng)檢測(cè)的快速方法，實(shí)現(xiàn)副豬嗜血桿菌的可視化、便捷化鑒別。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株與試劑

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，PM)、豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)、豬沙門(mén)氏菌(Salmonellosis，SAL)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，KP)均由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物重要病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院雷連成教授課題組惠贈(zèng)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司，2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)、標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司，6× loading buffer、Bst DNA聚合酶、10× ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTPs均購(gòu)自Vazyme Biotech Co公司，DEPC水購(gòu)自Biosharp，染料購(gòu)自北京凱萊酶新業(yè)生物科技有限公司。

1.2 臨床樣品

采集2020—2022年間來(lái)自河南漯河、駐馬店、南陽(yáng)等規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床樣品52份(豬口鼻拭子23份、胸腔積液8份、肺臟組織樣品21份)。

1.3 基因組DNA提取

按照天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組，提取的基因組DNA測(cè)定濃度，并在-20 ℃保存。

1.4 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank中已發(fā)表的infB序列，采用Blast獲得高度保守區(qū)域。針對(duì)保守區(qū)域序列，參考LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer Explorer V5軟件(http:∥primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設(shè)計(jì)5組LAMP引物，每組引物針對(duì)6個(gè)特定區(qū)域，設(shè)計(jì)出4條特異性引物F3、B3、FIP和BIP；選取其中高特異性引物組進(jìn)行試驗(yàn)。將最終選取的引物FIP和BIP的5′末端分別用Biotin和6-FAM進(jìn)行標(biāo)記，上述引物和修飾引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LAMP引物序列信息如表1所示。

表1 副豬嗜血桿菌inf B基因的LAMP引物信息Table 1 LAMP primer information of inf B gene of Haemophilus parasuis

圖1 副豬嗜血桿菌LAMP引物在inf B基因序列的位置Fig.1 Location of LAMP primers of Haemophilus parasuis in inf B gene sequence

1.5 副豬嗜血桿菌LAMP反應(yīng)體系的建立

提取的副豬嗜血桿菌基因組DNA作為陽(yáng)性模板，DEPC水作為陰性對(duì)照?？偡磻?yīng)體系為25 μL，擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 3.5 μL，內(nèi)引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (100 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜堿2 μL，模板2 μL，DEPC水補(bǔ)足至25 μL，將反應(yīng)物置于反應(yīng)管中，于65 ℃恒溫反應(yīng)60 min。

1.6 副豬嗜血桿菌LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

1.6.1LAMP引物比的優(yōu)化

保持其他條件不變，使內(nèi)外引物濃度比(F3∶FIP和B3∶BIP)分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)比較瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，選出最佳內(nèi)外引物比。

1.6.2MgSO4濃度的優(yōu)化

保持其他條件不變，將反應(yīng)體系中加入MgSO4的體積分別變?yōu)?、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 μL，以MgSO4終濃度梯度0、2、4、6、8和10 mmol/L分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)比較瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，選出最佳MgSO4濃度。

1.6.3dNTPs濃度的優(yōu)化

保持其他條件不變，將反應(yīng)體系中加入dNTPs的量分別變?yōu)?.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 μL，以dNTPs終濃度梯度1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)比較瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，選出最適宜的dNTPs濃度。

1.6.4反應(yīng)溫度的優(yōu)化

按上述優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，分別設(shè)定反應(yīng)溫度為60～67 ℃溫度梯度，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)比較選出最佳反應(yīng)溫度。

1.6.5反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

按上述優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，分別設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為15、30、45和60 min，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳篩選出最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

1.7 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD方法的建立

將5 μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物加入100 μL緩沖液中，混勻，將混合物加入試紙條上的樣品墊中，靜置5 min后判定試驗(yàn)結(jié)果。觀察LFD試紙條的T線和C線的顏色變化，若T、C線均顯示為紅色，判定為陽(yáng)性；若只有C線顯紅色，則判定為陰性；若T、C線均無(wú)色，則為無(wú)效。判斷標(biāo)準(zhǔn)如圖2。

(a)陽(yáng)性；(b)陰性；(c)無(wú)效(a) Positive； (b) Negative； (c) Invalid

1.8 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)方法的特異性

分別以副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌基因組為模板，按照已建立的LAMP方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法與LFD進(jìn)行分析。

1.9 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)方法的靈敏度

將提取的副豬嗜血桿菌基因組以紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并用DEPC水進(jìn)行10倍梯度稀釋。分別以不同濃度的基因組作為模板，反應(yīng)結(jié)束后LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法與LFD進(jìn)行分析，同時(shí)以不同濃度的基因組DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)，對(duì)比3種檢測(cè)方法的靈敏度。PCR引物F3:TATGGCGGAAGGCGATGT，B3:TGCACGGACGTTAAAGCC，目的片段長(zhǎng)度為211 bp；反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.10 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

取30份已知病原結(jié)果的豬臨床樣品，平均分為3組，每組10份(副豬嗜血桿菌樣品2份、豬鏈球菌樣品1份、肺炎克雷伯菌樣品1份、沙門(mén)氏菌樣品1份、胸膜肺炎放線桿菌樣品1份、巴氏桿菌樣品1份和陰性樣品3份)。按照天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組，分3批次應(yīng)用建立的LAMP-LFD方法檢測(cè)這些樣品，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)批內(nèi)和批間變異系數(shù)，評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.11 副豬嗜血桿菌臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)采集的52份豬臨床樣品(豬口鼻拭子23份、胸腔積液8份、肺臟組織樣品21份)分別進(jìn)行普通PCR、LAMP和LAMP-LFD檢測(cè)，比較3種方法的檢出率，評(píng)估建立的LAMP-LFD方法在臨床檢測(cè)上的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 副豬嗜血桿菌LAMP引物篩選

將本研究設(shè)計(jì)的5組引物進(jìn)行LAMP檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。引物組1～5陰性均沒(méi)有擴(kuò)增，陽(yáng)性均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線。引物組1于反應(yīng)18 min時(shí)最先出現(xiàn)上升趨勢(shì)，30 min后反應(yīng)進(jìn)入平緩期；引物組2和5于反應(yīng)后20 min出現(xiàn)擴(kuò)增；引物組3和4于反應(yīng)后30 min才出現(xiàn)擴(kuò)增，且引物組1較其他引物組擴(kuò)增效率最高。因此，選擇引物組1作為副豬嗜血桿菌LAMP法檢測(cè)的最適引物組。

圖3 副豬嗜血桿菌LAMP引物篩選Fig.3 Screening of LAMP primers forHaemophilus parasuis

2.2 副豬嗜血桿菌LAMP檢測(cè)體系確立

LAMP檢測(cè)副豬嗜血桿菌采用控制變量法分別進(jìn)行內(nèi)外引物濃度比、MgSO4濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化。結(jié)果如圖4所示，內(nèi)外引物濃度比(F3∶FIP和B3∶BIP)為1∶8時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)明亮、清晰的條帶(圖4(a))；MgSO4終濃度在4 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物能夠出現(xiàn)典型的梯狀條帶，終濃度為6 mmol/L時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶最亮(圖4(b))；dNTPs在1 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物即可出現(xiàn)梯狀條帶，終濃度為1.8 mmol/L時(shí)的條帶最清晰、明顯(圖4(c))；當(dāng)反應(yīng)溫度在61 ℃左右時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物即可出現(xiàn)典型的梯狀條帶，在66 ℃左右時(shí)反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物的梯形條帶最為明顯(圖4(d))；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過(guò)短時(shí)，反應(yīng)體系沒(méi)有梯形條帶產(chǎn)生，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在30 min及其以上時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物趨于穩(wěn)定，電泳產(chǎn)生的梯形條帶清晰且明亮(圖4(e))。因此，最佳檢測(cè)體系為：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol/L) 1.5 μL，dNTP Mix (10 mmol/L) 4.5 μL，內(nèi)引物FIP、BIP (10 mmol/L) 4 μL，外引物F3、B3 (10 mmol/L) 0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，甜菜堿2 μL，模板2 μL，DEPC水補(bǔ)足至25 μL。

(a)內(nèi)外引物濃度比：M，DL 2 000 DNA Marker；1～6引物濃度比分別為1∶1；1∶2；1∶4；1∶6；1∶8；1∶10；7為陰性；(b)MgSO4濃度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～6 MgSO4濃度分別為0、2、4、6、8和10 mmol/L；(c)dNTPs濃度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～9 dNTPs濃度分別為0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 mmol/L；(d)LAMP反應(yīng)溫度：M，DL 2 000 DNA Marker；1～8分別為67.0、66.5、65.6、64.3、62.7、61.4、60.5和60.0 ℃；(e)反應(yīng)時(shí)間：M，DL 2 000 DNA Marker；1～4分別為15、30、45和60 min；5為陰性。(a) Concentration ratio of internal and external primers: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-6 primer concentration ratios are 1∶1; 1∶2; 1∶4; 1∶6; 1∶8; 1∶10; 7 is negative; (b) MgSO4 concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; the concentrations of 1-6 MgSO4 are 0, 2, 4, 6, 8 and 10 mmol/L, respectively; (c) dNTPs concentration: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-9 dNTPs concentrations are 0, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2 and 2.4 mmol/L, respectively; (d) LAMP reaction temperature: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-8 are 67.0, 66.5, 65.6, 64.3, 62.7, 61.4, 60.5, and 60.0 ℃, respectively; (e) Reaction time: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-4 are 15, 30, 45 and 60 min, 5 is negative.

2.3 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)的特異性分析

利用建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)方法對(duì)豬常見(jiàn)病原菌：豬鏈球菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果如圖5(a)所示，以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)特異性梯形條帶；而豬鏈球菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌基因組DNA的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中均無(wú)梯狀條帶。LFD檢測(cè)副豬嗜血桿菌的LAMP產(chǎn)物，T線和C線同時(shí)顯色，判定為陽(yáng)性；LFD檢測(cè)其他病原菌時(shí)，僅C線顯示紅色條帶，T線無(wú)顏色變化，均為陰性(圖5(b))。LAMP與LAMP-LFD檢測(cè)病原的結(jié)果一致，如表2所示。結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌LAMP引物具有良好的特異性，與其他病原菌無(wú)交叉反應(yīng)，可特異識(shí)別副豬嗜血桿菌。

表2 副豬嗜血桿菌不同檢測(cè)方法特異性分析Table 2 Specificity analysis of different detection methods of Haemophilus parasuis

(a)LAMP特異性結(jié)果：M，DL 2 000 DNA Marker；1～7分別表示陰性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS；(b)LAMP-LFD 特異性結(jié)果：1～7分別表示陰性、APP、PM、SS、SAL、KP、HPS。(a) LAMP specific results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1-7 shows negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS; (b) LAMP-LFD specific results: 1-7 are Negative, APP, PM, SS, SAL, KP and HPS, respectively.

2.4 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)的靈敏度

紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的副豬嗜血桿菌基因組DNA的濃度為128.5 ng/μL，按照10倍倍比稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11，以LAMP擴(kuò)增，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法與LFD、PCR進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示(圖6)，當(dāng)DNA稀釋至10-8時(shí)，常規(guī)PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中無(wú)特異性條帶產(chǎn)生；當(dāng)DNA稀釋至10-10時(shí)，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中均顯示有梯形條帶產(chǎn)生，在橫向流動(dòng)試紙條上均出現(xiàn)T線和C線2條帶，陰性對(duì)照顯示質(zhì)控線一條帶；LAMP方法和LAMP-LFD方法的最低檢測(cè)限均為1.285×10-12ng/μL。統(tǒng)計(jì)3種方法的最低檢測(cè)濃度，結(jié)果如表3所示，常規(guī)PCR法的最低檢測(cè)限為1.285×10-9ng/μL，LAMP和LAMP-LFD的檢測(cè)結(jié)果一致，最低檢測(cè)限均為1.285×10-12ng/μL，較常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度提高103倍，表明建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD可視化檢測(cè)方法較常規(guī)PCR具有較高的靈敏度。

(a)PCR靈敏度結(jié)果：M，DL 2 000 DNA Marker；1為陰性；2～11為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-10 ng/μL；(b)LAMP靈敏度結(jié)果：M，DL 2 000 DNA Marker；1為陰性，2～12為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL；(c)LAMP-LFD靈敏度結(jié)果：1為陰性；2～11為HPS基因組稀釋濃度分別為1.285×10-1～1.285×10-11 ng/μL。(a) PCR sensitivity result: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-10 ng/μL, respectively; (b) LAMP sensitivity results: M. DL 2 000 DNA Marker; 1 is negative; 2-12 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively; (c) LAMP-LFD sensitivity results: 1 is negative, 2-11 are HPS genome dilution concentration of 1.285×10-1-1.285×10-11 ng/μL, respectively.

表3 副豬嗜血桿菌不同檢測(cè)方法靈敏度分析Table 3 Sensitivity analysis of different detection methods for Haemophilus parasuis

2.5 副豬嗜血桿菌LAMP-LFD檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用臨床樣品分批次驗(yàn)證建立的LAMP-LFD方法的重復(fù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3批次建立的LAMP-LFD方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到臨床樣品中的副豬嗜血桿菌感染樣品，且不會(huì)與其他細(xì)菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法結(jié)果一致，表明本研究建立的LAMP-LFD檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 副豬嗜血桿菌臨床樣品的檢測(cè)

從河南漯河、駐馬店、南陽(yáng)等規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)采集52份臨床樣品，提取基因組作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR、LAMP和LAMP-LFD可視化檢測(cè)。結(jié)果如表4所示，52份樣品中，常規(guī)PCR法檢測(cè)出9份副豬嗜血桿菌陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為17.3%；LAMP和LAMP-LFD法均檢出10份副豬嗜血桿菌陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為19.2%，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為100%。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，本研究建立的副豬嗜血桿菌LAMP-LFD可視化檢測(cè)方法可用于臨床副豬嗜血桿菌感染樣品的檢測(cè)，且靈敏度高于常規(guī)PCR方法。

表4 副豬嗜血桿菌臨床樣本檢測(cè)分析Table 4 Detection analysis of clinical samples of Haemophilus parasuis

3 結(jié)論與討論

目前，副豬嗜血桿菌病存在于主要養(yǎng)豬的國(guó)家，隨著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，副豬嗜血桿菌病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要細(xì)菌病之一[21]。研究表明，當(dāng)前副豬嗜血桿菌病發(fā)生呈遞增趨勢(shì)，與大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌等細(xì)菌和豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病毒混合感染影響各個(gè)階段的生豬，加上多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[22]。結(jié)合規(guī)模化、集約化生豬養(yǎng)殖生產(chǎn)的需求，臨床上亟需副豬嗜血桿菌等病原的快速、靈敏、便捷的臨場(chǎng)檢測(cè)方法。

Kiatpathomchai等[23]在2008年將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)和橫向流動(dòng)技術(shù)(LFD)結(jié)合用于病原的檢測(cè)。LAMP的產(chǎn)物可在橫向流動(dòng)試紙條上5 min內(nèi)以顯色的方式呈現(xiàn)，通過(guò)肉眼即可快速判定試驗(yàn)結(jié)果；該方法消除了對(duì)儀器設(shè)備的依賴，節(jié)省了檢測(cè)成本與時(shí)間，也避免了與溴化乙錠(EtBr)的接觸，非常適用于即時(shí)檢測(cè)。本研究將副豬嗜血桿菌的LAMP恒溫?cái)U(kuò)增方法與LFD檢測(cè)方法相結(jié)合，建立了副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)副豬嗜血桿菌的快速、靈敏、可視化檢測(cè)。在引物設(shè)計(jì)上，本研究同時(shí)針對(duì)副豬嗜血桿菌不同基因保守核酸序列設(shè)計(jì)特異性引物用于LAMP擴(kuò)增，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)針對(duì)infB基因的1個(gè)引物組在靈敏度、特異性上都具有良好的性能，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)副豬嗜血桿菌基因的特異性識(shí)別和擴(kuò)增。同時(shí)，通過(guò)在內(nèi)引物FIP和BIP的5′末端分別添加Biotin和6-FAM進(jìn)行標(biāo)記，使得副豬嗜血桿菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物具備了與LFD結(jié)合顯色的能力；經(jīng)驗(yàn)證副豬嗜血桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物能有效地與LFD結(jié)合，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程加顯色只需35 min即可判斷結(jié)果。陳歡等[24]建立的應(yīng)用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)的LAMP-LFD法，檢測(cè)時(shí)間只需35 min；劉露等[25]建立的檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒LAMP-LFD法，檢測(cè)時(shí)間在50 min左右，總體來(lái)講，本研究針對(duì)副豬嗜血桿菌的LAMP-LFD具有快速、便捷的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，我們對(duì)建立的LAMP-LFD檢測(cè)特異性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所設(shè)計(jì)的副豬嗜血桿菌LAMP引物具有良好的特異性，未檢測(cè)到與其他病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)；在靈敏度上，LAMP-LFD檢測(cè)副豬嗜血桿菌的靈敏度較常規(guī)PCR高103倍，這與LAMP-LFD在豬支原體肺炎、羊口瘡病毒等病原的檢測(cè)中表現(xiàn)出的靈敏度相一致[26-27]；應(yīng)用臨床樣品分批次驗(yàn)證建立的LAMP-LFD方法的重復(fù)性，不同批次的LAMP-LFD均能有效的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果，且與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法結(jié)果一致；進(jìn)一步將LAMP-LFD可視化檢測(cè)方法用于臨床副豬嗜血桿菌感染樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證了本研究建立的LAMP-LFD方法能夠高靈敏、特異性地檢測(cè)臨床副豬嗜血桿菌感染樣品，具有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，適用于基層養(yǎng)殖企業(yè)臨場(chǎng)、便捷檢測(cè)。

LAMP反應(yīng)需要多對(duì)引物，容易產(chǎn)生引物二聚體；引物設(shè)計(jì)上對(duì)靶序列和引物的長(zhǎng)度要求高，且由于該方法靈敏度高，在瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程中由于加樣、EP管的開(kāi)蓋、氣溶膠的形成等極易發(fā)生污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果[28-29]。這些存在的問(wèn)題需要通過(guò)對(duì)操作人員的規(guī)范培訓(xùn)及通過(guò)加入某些LAMP輔助劑進(jìn)行克服改進(jìn)。本研究將LAMP與LFD結(jié)合，在實(shí)際操作中省去了瓊脂糖凝膠電泳的步驟，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，可代替瓊脂糖凝膠電泳對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化判讀[30]。

本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)成功建立了副豬嗜血桿菌的可視化檢測(cè)方法，LAMP方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)副豬嗜血桿菌infB基因的特異性檢測(cè)，結(jié)合橫向流動(dòng)試紙條使LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可視化；LAMP結(jié)合LFD的副豬嗜血桿菌檢測(cè)方法具有高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)單、不依賴儀器設(shè)備等特點(diǎn)，結(jié)果判定明顯直觀，適用于基層使用和推廣。