人源化小鼠模型的研究進(jìn)展①

安凌波 張茂森 欒 晶（西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，院士工作站，西安 710021）

由于人類(lèi)和動(dòng)物基因的相似性較高，通過(guò)在動(dòng)物身上復(fù)制人類(lèi)疾病，構(gòu)建相關(guān)的動(dòng)物疾病模型，是研究人類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)制、探索治療方法、評(píng)估藥物藥效和安全性的重要手段。相比于體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型，在動(dòng)物模型上得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。為了縮小動(dòng)物和人之間因種屬差異性帶來(lái)的誤差，研發(fā)和構(gòu)建無(wú)限接近于人的動(dòng)物模型，即人源化動(dòng)物模型，成為模式動(dòng)物研究領(lǐng)域發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)。人源化動(dòng)物模型的快速發(fā)展基于免疫缺陷動(dòng)物受體的出現(xiàn)，為移植人類(lèi)細(xì)胞、組織、臟器等提供了可能性，免疫系統(tǒng)缺陷程度越高，對(duì)移植物的排斥反應(yīng)越小，移植效果越好。同時(shí)，移植物的成分越復(fù)雜，小鼠的人源化程度越高。

1 免疫缺陷小鼠的起源與發(fā)展過(guò)程

1.1 裸鼠 裸鼠因渾身無(wú)毛而得名，是最早出現(xiàn)的免疫缺陷小鼠，由于該小鼠體內(nèi)發(fā)生等位基因（即第11號(hào)染色體上的Foxnl基因）突變導(dǎo)致其先天性胸腺缺失，進(jìn)而影響胸腺參與的一系列特異性免疫功能，缺乏成熟的T細(xì)胞和T細(xì)胞參與的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，將裸鼠與不同品系的小鼠雜交可獲得多種突變品種，已在我國(guó)得到廣泛使用的有NIH-nu、BALB/c-nu、NC-nu、Swiss-nu等［2］。但由于裸鼠體內(nèi)仍存在鼠源的自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）和B細(xì)胞，完整的先天免疫在一定程度上仍會(huì)對(duì)移植的人源組織或細(xì)胞進(jìn)行防御進(jìn)而產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。此外，隨著年齡的增長(zhǎng)，裸鼠還會(huì)出現(xiàn)T細(xì)胞滲漏現(xiàn)象，限制其使用范圍［3］。

1.2 重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immuno‐deficiency，SCID）小 鼠BOSMA等［4］在1983年 發(fā)現(xiàn)，CB17小鼠體內(nèi)蛋白激酶催化亞基的基因（Prkdc基因）發(fā)生突變，導(dǎo)致T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體的修復(fù)和重組受阻，進(jìn)而影響T細(xì)胞和B細(xì)胞分化成熟的進(jìn)程，表現(xiàn)為胸腺和外周淋巴組織嚴(yán)重萎縮，缺乏成熟的功能性T、B淋巴細(xì)胞并患有低免疫球蛋白血癥［5］。這些特點(diǎn)使該小鼠可耐受人造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）以及惡性血液瘤等的低水平移植，此外，人源組織也可以在該小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)［6］。雖然SCID小鼠的移植效率優(yōu)于裸鼠，但仍存在一定問(wèn)題：首先，隨著年齡的增長(zhǎng)，部分SCID小鼠體內(nèi)會(huì)自發(fā)修復(fù)因基因突變?cè)斐傻拿庖呷毕荩瑥亩梢幌盗姓５拿庖呒?xì)胞并發(fā)育成熟，出現(xiàn)免疫細(xì)胞滲漏現(xiàn)象［7］；其次，SCID小鼠殘存NK細(xì)胞、補(bǔ)體及髓系細(xì)胞的正常免疫功能，可持續(xù)抵抗人源組織和細(xì)胞的植入并抑制其生長(zhǎng)。此外，SCID小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性T細(xì)胞淋巴瘤（主要在胸腺），發(fā)病率在15%左右［8］。以上缺陷限制了SCID小鼠的應(yīng)用。

1.3 非肥胖型糖尿?。╪on-obese diabetic，NOD）/SCID小鼠 為降低免疫缺陷小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的活性，提高異種細(xì)胞、組織移植成功率，1995年，SHULTZ等［9］通過(guò)將突變的Prkdc基因?qū)胫罭OD小鼠體內(nèi)，成功構(gòu)建了NOD/SCID小鼠模型。由于NOD小鼠的固有免疫系統(tǒng)存在缺陷導(dǎo)致其巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞均為低活性，且補(bǔ)體循環(huán)存在缺陷，抑制了補(bǔ)體活化［6］。在NOD小鼠基因背景上引入Prkdc突變基因的NOD/SCID小鼠同時(shí)缺乏完整的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和固有免疫系統(tǒng)，很大程度上降低了天然免疫細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，對(duì)在小鼠體內(nèi)重建人源實(shí)體瘤、血液瘤以及免疫細(xì)胞起到更好的支持作用［9］。不足之處在于：①該小鼠難以接受大幅度的放射線輻照；②大齡的小鼠發(fā)生滲漏現(xiàn)象的概率更高；③由于NOD基因易發(fā)生突變，使得自發(fā)性胸腺淋巴瘤的發(fā)生概率大幅提高，導(dǎo)致這種小鼠的壽命很短，平均壽命僅為8個(gè)月［4］。

1.4 重組酶激活基因（recombination activating genes，RAG）缺陷小鼠RAG缺陷小鼠的出現(xiàn)對(duì)NOD/SCID小鼠模型的不足進(jìn)行了彌補(bǔ)，RAG1基因和RAG2基因在抗體生成和TCR重排中發(fā)揮著重要作用，兩者缺陷將導(dǎo)致小鼠體內(nèi)缺乏成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞，使其成為較理想的移植受體［10］。該小鼠的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)放射線不敏感，也不會(huì)出現(xiàn)免疫滲漏現(xiàn)象。不足之處是其N(xiāo)K細(xì)胞活性仍然較高，限制了人造血干細(xì)胞重構(gòu)［5］。為了減少高活性NK細(xì)胞帶來(lái)的阻礙，研究人員對(duì)影響NK細(xì)胞發(fā)育的因子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)β2m是主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類(lèi)分子的重要組成部分，而該類(lèi)分子對(duì)NK細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。研 究 發(fā) 現(xiàn)，剔 除β2m后 獲 得 的NOD/SCID β2m?/?（NSB）小鼠缺乏功能性NK細(xì)胞，因此即便減少臍血造血干細(xì)胞的植入，也可以獲得比NOD/SCID小鼠的人源細(xì)胞重建水平更高的小鼠。不足之處是該小鼠仍殘存少量NK細(xì)胞，嚴(yán)重抑制了人源化T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化成熟［1］。

1.5 NOG、NPG、NCG、NSG、NRG、BRG小鼠 為了提高人源化免疫系統(tǒng)的重建水平，研究人員在NOD/SCID背景的小鼠基礎(chǔ)上又進(jìn)一步將IL-2受體的普通伽馬鏈（IL-2Rγc）進(jìn)行了敲除，該鏈?zhǔn)歉哂H和力受體的重要組成部分，編碼重要信號(hào)通路組成因子（如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）的功能［11］。具體操作是用NOD/SCID小鼠與C57BL/6JIL-2Rγcnull小鼠進(jìn)行8次回交得到NOG（NOD/SCID/IL-2Rγcnull）小鼠，其T、B細(xì)胞的免疫功能缺失，NK細(xì)胞發(fā)育受阻［12-13］。給每只小鼠接種約500萬(wàn)個(gè)人源細(xì)胞，通過(guò)對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，所有NOG小鼠的脾、肺和外周血中超過(guò)50%的細(xì)胞為人源，遠(yuǎn)大于接種的細(xì)胞數(shù)量，接種的人源細(xì)胞可以在NOG小鼠體內(nèi)增殖，并在各器官生長(zhǎng)和分化，因此，NOG小鼠在人血液系統(tǒng)移植方面是較為理想的模型［14］。隨后問(wèn)世的NSG（NOD/SCID/IL-2RYcnull）小鼠、NPG（NOD-PrkdcscidIL-2Rγnull）小鼠以及NCG（NOD-Prk‐dcem26Cd52IL-2Rγem26Cd22）小鼠與NOG小鼠構(gòu)建原理基本相同［15-19］。NOG與NSG小鼠的區(qū)別在于，NOG小鼠缺失IL-2Rγ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，而NSG小鼠則完全缺失IL-2Rγ，NSG小鼠的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是不發(fā)生滲漏現(xiàn)象和胸腺瘤，可能與其缺乏有活性的IL-2R有關(guān)［5］。NOG/NSG/NPG/NCG小鼠的不足之處在于，因SCID突變而對(duì)輻射高度敏感。

為了增強(qiáng)小鼠的抗輻射能力，采用基因編輯技術(shù)由RAG1或RAG2基因缺失代替SCID突變，得到NOD背景RAG1?/?（或RAG2?/?）、IL-2Rγ?/?表型的 小鼠，因此得名NRG小鼠［20］。NRG（NOD/RAG1/2?/?IL-2Rγnull）小鼠同樣具有T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞缺陷，因而可以作為高度免疫缺陷小鼠用于建立異種組織和腫瘤移植模型。因NRG小鼠無(wú)SCID基因突變，更耐輻射和耐受放療藥物組合的藥效試驗(yàn)。

與NRG小 鼠 類(lèi) 似，BRG（BALB/cRAG2?/?IL-2Rγcnull）小鼠是在BALB/c背景的小鼠中引入RAG1?/?或RAG2?/?突變以及IL-2Rγ缺失，表現(xiàn)為T(mén)、B細(xì)胞缺失和NK細(xì)胞無(wú)活性［21］。NRG小鼠的人HSC細(xì)胞植入率比BRG高，主要原因是NOD背景小鼠的SIRPα帶有突變，可以結(jié)合人源CD47，抑制巨噬細(xì)胞對(duì)人源細(xì)胞的吞噬作用［22］。

1.6 免疫缺陷小鼠的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比 在以上諸多免疫缺陷模型中（圖1），NOG（NSG、NPG、NCG）和NRG小鼠是目前最主要的幾種用于構(gòu)建人源化小鼠模型的重度免疫缺陷模型，是迄今為止免疫系統(tǒng)缺陷最為徹底的小鼠模型，適合CDX、PDX、PBMC和CD34+HSC移植重建，小鼠生存周期長(zhǎng)，利于長(zhǎng)期移植及藥效評(píng)價(jià)［23］。在使用過(guò)程中，各免疫缺陷小鼠有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)（表1），如NOG（NSG、NPG、NCG）小鼠對(duì)輻射和潛在藥物誘導(dǎo)的DNA損傷敏感性增強(qiáng)，而NRG和BRG小鼠則具有抗性。雖然這些差異不影響腫瘤的發(fā)病率，但可能對(duì)化療和放射治療產(chǎn)生極大的影響，因此研究者需仔細(xì)考慮治療問(wèn)題選擇合適的模型［20］。

表1 主要免疫缺陷小鼠的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)Tab.1 Advantages and disadvantages of immunodeficient mice

圖1 主要免疫缺陷小鼠的發(fā)展歷史Fig.1 Development history of immunodeficient mice

2 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建

2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞/人外周血淋巴細(xì)胞（pe‐ripheral blood mononuclear cell，PBMC/perihperal blood lymphocyte，PBL）小鼠模型 該模型構(gòu)建方法是將人PBMC或PBL移植到成年SCID小鼠循環(huán)系統(tǒng)，稱(chēng)為hu-PBMC-SCID或hu-PBL-SCID小鼠模型，首次由MOSIER等［26］建立。該模型具有以下特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，人外周血白細(xì)胞（human peripheral blood leuko‐cytes，PBLs）易于獲得；人體免疫細(xì)胞可在受體內(nèi)存活數(shù)周并發(fā)揮正常的免疫功能；移植的免疫細(xì)胞可以被嗜血細(xì)胞病毒如HIV-1、EB等感染。不足的是，人類(lèi)淋巴細(xì)胞的重建水平較低且不穩(wěn)定；人細(xì)胞重建后小鼠缺乏正常淋巴組織，脾臟中亦無(wú)法觀察到囊泡狀生發(fā)結(jié)構(gòu)；人源細(xì)胞的大量注入會(huì)激活小鼠免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致體內(nèi)淋巴細(xì)胞增生；另外，T細(xì)胞的注入可引發(fā)移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）。為有效減少GVHD的發(fā)生，延長(zhǎng)小鼠生存期，可在移植前除去人PBMC中的CD4+T細(xì)胞；此外，敲除小鼠MHCⅠ類(lèi)分子也可以降低hu-PBMC模型GVHD發(fā)生率［27］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用CB17-SCID小鼠構(gòu)建hu-PBL-SCID小鼠模型出現(xiàn)GVHD反應(yīng)程度較弱，并可分泌特異性抗體［1］。TAKAJO等［14］還發(fā)現(xiàn)，有效植入人PBMC的NOG小鼠均可正常生長(zhǎng)發(fā)育，1個(gè)月內(nèi)無(wú)立毛或體質(zhì)量減輕現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)腫瘤或淋巴結(jié)腫大。目前該小鼠模型多采用NOG（NOD/SCID/IL-2Rγcnull）、NSG（NOD/SCID IL-2Rγc?/?）或RG（BALB/c RAG2?/?IL-2Rγc?/?）小鼠進(jìn)行構(gòu)建，移植效果更為突出［28］。該類(lèi)模型多用于病毒免疫和對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞活性的研究［1］。

2.2 人造血干細(xì)胞（human-stem cell-severe com‐bined immunodeficiency，hu-HSC-SCID）小鼠模型該模型是將hu-HSC-SCID注射到新生的或成年免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使多系hu-HSC發(fā)育為包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞及NK細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞［27］。HSC的獲得途徑包括臍帶血、骨髓和粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）動(dòng)員后的外周血或胚胎肝臟，其中最常用的途徑來(lái)自于臍帶血和胚胎肝臟，因?yàn)榇藖?lái)源的HSCs較成年人HSCs在SCID小鼠體內(nèi)更易定植。KUCHMA等［29］在免疫表型的研究中發(fā)現(xiàn)，相比于臍帶血，胎肝含有更豐富的造血干細(xì)胞。早期該模型的構(gòu)建是通過(guò)靜脈或股動(dòng)脈注射的方式在合適的成熟NOD/SCID小鼠體內(nèi)植入CD34+HSCs，經(jīng)10~12周可重建淋巴細(xì)胞增殖過(guò)程，但該方法會(huì)影響小鼠骨髓生成，且通常不會(huì)進(jìn)行T細(xì)胞發(fā)育［14，30-31］。目前，多采用NSG、RG或NOG（NOD/Shi-SCID IL-2Rγc?/?）小鼠，由于這類(lèi)小鼠人體細(xì)胞定植效果更好，能夠產(chǎn)生全系T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等［31-32］。hu-HSC-SCID模型的優(yōu)勢(shì)在于其造血系統(tǒng)及免疫細(xì)胞是HSCs在小鼠體內(nèi)重新發(fā)育而來(lái)的，因此小鼠的免疫系統(tǒng)不會(huì)對(duì)人源細(xì)胞產(chǎn)生排斥反應(yīng)，GVHD發(fā)生率極低，模型構(gòu)建的穩(wěn)定期可達(dá)到近3個(gè)月［33］。缺陷在于小鼠胸腺上皮細(xì)胞僅表達(dá)來(lái)自小鼠自身的MHC分子，人T細(xì)胞在宿主體內(nèi)無(wú)法經(jīng)歷正常的陰性選擇和陽(yáng)性選擇［34］。因此，NSG等免疫缺陷小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的T細(xì)胞難以被人抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）以及人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）限制的方法激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入人HLA基因的免疫缺陷小鼠可以使同型人HSCs經(jīng)歷正常的分化篩選并產(chǎn)生功能性的人T細(xì)胞和B細(xì)胞［8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，該模型中影響免疫系統(tǒng)構(gòu)建的因素較多：首先是小鼠周齡，周齡小的小鼠體內(nèi)HSC的定植效果更優(yōu)；其次是小鼠性別，在雌性NSG小鼠體內(nèi)人HSC的植入更穩(wěn)定。目前該模型在病毒感染和腫瘤移植方面具有廣闊的研究前景［35］。

2.3 人源腫瘤組織異種移植（patient-derived tumor xenograft，hu-PDX）模型PDX小鼠模型的構(gòu)建方法是通過(guò)將人的新鮮腫瘤組織或細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。最早為1951年TOOLAN［36］通過(guò)X射線照射使得小鼠發(fā)生基因突變從而形成免疫缺陷小鼠，并向小鼠體內(nèi)植入人表皮癌組織所得。移植部位通常為皮下、腎包膜下或原位。皮下移植操作較為簡(jiǎn)單，且易觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，為目前多數(shù)PDX小鼠建模所采用的方法，但成功率低［37］。腎包膜下移植成功率較高，但操作難度較大［38］。原位移植能夠模擬腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)，但操作難度大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也不易采集整理［8］。從BALB/c、裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠到NSG/NRG小鼠，隨著免疫系統(tǒng)缺失程度的加重，PDX模型成功率也依次提高。另外，PDX模型構(gòu)建的成功率還與腫瘤類(lèi)型和疾病特征有關(guān)，如胰腺癌組織比乳腺癌組織移植成功率更高［39］。該模型的優(yōu)勢(shì)在于其保留了較為完整的腫瘤發(fā)生微環(huán)境，取自患者腫瘤部位的組織或細(xì)胞可以在小鼠體內(nèi)維持正常的形態(tài)和生理功能［40-41］。同時(shí)，受體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織的防御吞噬也可在該模型中被完整觀察到，是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中最接近患者臨床表現(xiàn)的模型。不足之處在于，受體小鼠缺乏完整的人體免疫系統(tǒng)，因此無(wú)法針對(duì)特定患者腫瘤組織發(fā)揮防御作用，且腫瘤生長(zhǎng)速度較慢，移植物的成活率不穩(wěn)定［42］。為了對(duì)上述缺陷進(jìn)行優(yōu)化，研究者將人HSC和患者來(lái)源的腫瘤組織或細(xì)胞同時(shí)移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，進(jìn)而構(gòu)建出人源腫瘤組織異種移植（hu-HSC-PDX）小鼠模型。該模型構(gòu)建成功的標(biāo)志是能夠在腫瘤組織中檢測(cè)到人成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。其優(yōu)勢(shì)在于能夠更完整地模擬腫瘤發(fā)生的微環(huán)境，為腫瘤組織或細(xì)胞提供更舒適的生長(zhǎng)環(huán)境，使得人類(lèi)腫瘤的病理結(jié)構(gòu)和組織成分得以更好地保存［43］。PDX小鼠模型已廣泛用于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤的臨床研究，在模擬腫瘤組織生長(zhǎng)、臨床預(yù)后等方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)［44］。

2.4 人骨髓、肝臟、胸腺（human-bone、liver、thy‐mus，hu-BLT）小鼠模型BLT小鼠是通過(guò)將人的胚胎肝臟和胸腺共同移植到免疫缺陷鼠的腎被膜下，同時(shí)將同一胚胎來(lái)源的肝臟造血干細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)而建立的目前人源化程度最高的小鼠模型［14］。早期BLT小鼠用NOD-SCID小鼠構(gòu)建，目前多采用NSG或NOG小鼠［45］。由于表達(dá)人HLA分子同源胸腺的植入為人HSC提供了較為完整的人體微環(huán)境，使其能夠經(jīng)歷正常分化篩選并發(fā)育成熟。因此，BLT小鼠的所有組織均能檢測(cè)出包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞系在內(nèi)的人免疫系統(tǒng)的高水平移植，更重要的是可產(chǎn)生有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。該模型具有如下特點(diǎn)：免疫系統(tǒng)的構(gòu)建非常完整，重組的人T細(xì)胞在小鼠胸腺上皮中受到教化，限制了抗原抗體的特異性結(jié)合，因此人胸腺細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育可在小鼠胸腺內(nèi)被觀察到；同時(shí)該人源化小鼠的脾臟和淋巴結(jié)會(huì)明顯大于普通小鼠［27，30］。但其局限性在于胚胎組織及成年供體樣本難以取得，且比其他小鼠更易發(fā)生GVHD［46］。LAVENDER等［47］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，為有效避免GVHD發(fā)生，可在BLT小鼠體內(nèi)對(duì)CD47基因進(jìn)行敲除。另外，為降低BLT小鼠的局限性，AGARWAL等［30］將人脾臟組織移植入BLT小鼠體內(nèi)，構(gòu)建了BLTS小鼠模型，由于脾臟可吞噬衰老紅細(xì)胞，產(chǎn)生并集合淋巴細(xì)胞，因此該模型可促進(jìn)生發(fā)中心形成，進(jìn)而推動(dòng)次級(jí)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.5 基因工程小鼠（genetically engineered mouse models，GEMMs）模型GEMMs模型是將人源目的基因?qū)胄∈蠡蚪M內(nèi)，通過(guò)基因鑒定篩選出可表達(dá)目的基因并穩(wěn)定遺傳的小鼠模型。20世紀(jì)80年代早期，利用基因工程構(gòu)建的基因修飾小鼠模型徹底改變了人類(lèi)對(duì)癌癥的研究進(jìn)程。1974年，JAE‐NISCH等［48］將來(lái)自西米安病毒的病毒腫瘤基因（SV40）顯微注射到小鼠胚胎中，雖然由此構(gòu)建的小鼠模型未長(zhǎng)出腫瘤，但在其體內(nèi)可以檢測(cè)到整合在不同組織細(xì)胞基因組的病毒DNA，因此被認(rèn)為是第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。20世紀(jì)80年代后期，研究人員構(gòu)建出第一只轉(zhuǎn)基因癌癥小鼠模型，該小鼠可表達(dá)特定的人癌癥基因。構(gòu)建基因工程小鼠主要通過(guò)以下三種方法：①逆轉(zhuǎn)錄病毒法，該方法不常用于造模，因?yàn)椴迦牖蜻^(guò)小以及基因間的隨機(jī)整合，有可能影響相鄰基因的表達(dá)，導(dǎo)致表型與所轉(zhuǎn)基因無(wú)關(guān)；另外，在插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后，病毒起源的目的基因在DNA去甲基化后不發(fā)揮作用；②標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因方法，通過(guò)顯微注射目的基因或?qū)⒁院怂醿?nèi)切酶為基礎(chǔ)的試劑（如Cas9+sgRNA+ssDNA混合物）直接注入受精小鼠卵母細(xì)胞的原核中。其優(yōu)勢(shì)在于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代的速度較快；向小鼠直接注入DNA結(jié)構(gòu)，目的基因被隨機(jī)混入一部分卵母細(xì)胞中，其后代絕大多數(shù)均含有目的基因，缺陷在于DNA可能插入關(guān)鍵位點(diǎn)導(dǎo)致有害的基因突變，或者插入沉默位點(diǎn)，不表達(dá)所需表型；③靶向轉(zhuǎn)基因方法，通過(guò)靶向操作使小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）在選定的位點(diǎn)喪失目的基因的功能，將該ES顯微注射到小鼠囊胚后植入假孕小鼠；該方法至少需要經(jīng)過(guò)兩代小鼠進(jìn)行篩選，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)［49］。基因工程在造模中發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但基因工程并不適用于臨床研究，因?yàn)榘┘?xì)胞最早來(lái)源于小鼠細(xì)胞，小鼠乳腺腫瘤病毒感染的歷史模型在組織學(xué)上未表現(xiàn)出人類(lèi)腫瘤特征。此外，建立模型耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，通常在1年及以上［50］。

2.6 人源化小鼠模型總結(jié) 隨著重度免疫缺陷小鼠的發(fā)展和成熟，其可耐受人源細(xì)胞和組織的程度越來(lái)越高，小鼠人源化的水平也越來(lái)越高。從最易構(gòu)建的PBL小鼠模型到目前為止人源化水平最高的BLT小鼠模型，再到基因工程小鼠，人源化小鼠模型的快速發(fā)展為人類(lèi)疾病的在體研究和精準(zhǔn)治療的發(fā)展提供了前所未有的平臺(tái)。本文詳細(xì)介紹5種模型，現(xiàn)將各模型優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下（表2）。

表2 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建Tab.2 Construction of humanized mouse model of immune system

3 人源化小鼠模型的應(yīng)用

3.1 在感染性疾病中的研究 人源化小鼠模型通過(guò)移植人免疫細(xì)胞至免疫缺陷小鼠，可以使許多人特異性致病源發(fā)揮感染作用。在病毒研究領(lǐng)域中，隨著人源化小鼠模型構(gòu)建技術(shù)的逐步發(fā)展，人源化小鼠模型在人免疫缺陷病毒（HIV-1）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、EB病毒、登革熱病毒、流感病毒等病毒感染性疾病中有較廣泛的應(yīng)用，其中HIV-1的研究發(fā)展最為迅速［52-56］。作為一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，HIV-1能夠特異性感染人的免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，HIV病毒可通過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）抑制其復(fù)制并阻止病程發(fā)展，但由于HIV病毒可以在CD4+T細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，ART目前并不能完全治愈HIV-1感染患者［57］。

早期主要通過(guò)hu-PBL-SCID模型和hu-SCID模型研究HIV感染的作用機(jī)制，這兩種模型在小鼠體內(nèi)很好地演示了HIV感染、復(fù)制和致病性，即HIV介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞清除的過(guò)程［58］。但由于在hu-PBLSCID小鼠模型中缺乏明顯的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，輸入的PBLs不能地活化且數(shù)量持續(xù)下降，使該模型應(yīng)用受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，BRG、NOG和NSG小鼠可以觀察到持續(xù)的病毒血癥和CD4+T細(xì)胞清除，但針對(duì)病毒的特異性適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)非常微弱，且并非存在于所有小鼠。隨后，BLT小鼠模型被投入到對(duì)HIV發(fā)病機(jī)制的探索研究中，研究發(fā)現(xiàn)其可在多數(shù)感染的小鼠中檢測(cè)到明顯的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［1］。除HIV致病機(jī)制的研究，該模型還支持人類(lèi)細(xì)胞在小鼠黏膜組織的重構(gòu)，在對(duì)人類(lèi)HIV黏膜感染預(yù)防及治療方面也有較好的應(yīng)用前景。

通過(guò)將人HSCs和/或PBMCs懸液注入SCID小鼠可獲得免疫系統(tǒng)人源化（human immune system，HIS）小鼠模型，小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)且具有更多與人體組織的相似性，有利于臨床評(píng)價(jià)治療方案的安全性和有效性［59］。

3.2 在腫瘤中的研究 人源化小鼠模型現(xiàn)已成為驗(yàn)證與評(píng)估人類(lèi)癌癥疾病治療效果方面非常有價(jià)值的工具，當(dāng)前主要依賴(lài)在HIS基礎(chǔ)上構(gòu)建的人類(lèi)腫瘤小鼠模型（human tumor model，HTM），即在NSG等免疫缺陷小鼠體內(nèi)同時(shí)移植人免疫細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞系獲得的小鼠模型，可在重塑功能性人免疫系統(tǒng)的同時(shí)支持人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。研究者可以通過(guò)HTM小鼠探索腫瘤如何與免疫系統(tǒng)相互作用、腫瘤免疫逃逸的機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)潛在療法的機(jī)制等［60］；通過(guò)選擇移植特定的免疫細(xì)胞，研究其在腫瘤免疫中特定免疫細(xì)胞所發(fā)揮的主要功能；此外，該模型還可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的評(píng)價(jià)工具，免疫檢查點(diǎn)主要包括程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1），細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4），T細(xì)胞免疫球蛋白3（TIM-3）和淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG-3），這些調(diào)節(jié)分子可抑制過(guò)度活化的T細(xì)胞攻擊自身組織，防止自身免疫疾病的發(fā)生［61］。利用HTM小鼠以探究免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果和作用機(jī)制［35，44］，如 有 研 究 用LIN等［62］構(gòu) 建 的hu-PBL-NSI（NOD/SCID IL2rg?/?）和hu-HSC-NSI兩種模型來(lái)評(píng)估靶向PD-L1/PD-1免疫檢查點(diǎn)的治療策略，發(fā)現(xiàn)Hu-PBL-NSI人源化小鼠模型在免疫靶向治療中顯示出更高的抗腫瘤效果，推測(cè)其差異可能與供體T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程有關(guān)［35］。此外，值得一提的是，目前生物抗體藥物的表現(xiàn)遠(yuǎn)優(yōu)于藥物平均水平，而非人源性抗體進(jìn)入人體內(nèi)會(huì)引起嚴(yán)重的排異反應(yīng)，進(jìn)而影響抗體在臨床應(yīng)用時(shí)的安全性和治療效果，因此人源化抗體已經(jīng)成為抗體藥物的發(fā)展趨勢(shì)，而人源化抗體藥物的一系列評(píng)價(jià)更苛刻地依賴(lài)于人源化小鼠模型的構(gòu)建。

3.3 實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療 精準(zhǔn)醫(yī)療是一種將個(gè)人遺傳物質(zhì)與生活習(xí)慣差異考慮在內(nèi)的新興預(yù)防和治療方法，其本質(zhì)是通過(guò)基因組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)和醫(yī)療手段，尋找疾病發(fā)生機(jī)制，從而達(dá)到對(duì)特定患者制定出符合個(gè)體情況的治療方案，進(jìn)而開(kāi)展精準(zhǔn)治療的目的。目前，開(kāi)展最多的腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療，即通過(guò)基因檢測(cè)獲得患者基因變異的信息，如通過(guò)高通量測(cè)序方法獲得腫瘤DNA的突變位點(diǎn)、變異基因拷貝數(shù)、基因移位和融合基因等，結(jié)合大數(shù)據(jù)分析設(shè)計(jì)治療方案，再利用人源化小鼠模型進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以實(shí)現(xiàn)治療效果最優(yōu)化和毒副作用最小化［63］。

腫瘤精準(zhǔn)治療策略要求腫瘤模型務(wù)必具有原腫瘤各種特征的良好保真性，人源化小鼠模型可以較好地復(fù)制人類(lèi)免疫微環(huán)境，以模擬腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程［64］。目前，PDX小鼠模型已廣泛用于對(duì)患者進(jìn)行腫瘤移植治療的臨床試驗(yàn)，將患有難治性實(shí)體腫瘤或早期、預(yù)后性不佳的癌癥患者的部分腫瘤組織植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建PDX小鼠模型，再對(duì)這些PDX小鼠進(jìn)行治療從而篩選出最有效的治療藥物。AIDALGO等［41］從6例原發(fā)性再切腫瘤患者和8例再切轉(zhuǎn)移患者中共獲得14個(gè)腫瘤移植物，并在232個(gè)單劑或組合治療中用63種不同的抗癌劑進(jìn)行治療，共跨越了33種獨(dú)特的機(jī)制。治療結(jié)果顯示，14例受試者中有12例確定了異種移植的有效治療方案，另有2例患者無(wú)有效治療方法。得到有效治療方案的12例患者，其中1例在接受治療前死亡，另11例接受了17次前瞻性指導(dǎo)治療，其中15種得到持久的部分緩解［41］。這項(xiàng)數(shù)據(jù)證實(shí)了人源化小鼠模型在實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療方面具有巨大的潛力。人源化小鼠還可以結(jié)合單細(xì)胞基因組學(xué)，促進(jìn)功能性精準(zhǔn)醫(yī)療，如風(fēng)險(xiǎn)分層和個(gè)體優(yōu)化治療方法，廣泛用于對(duì)人類(lèi)造血系統(tǒng)的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和功能研究［42］。

4 結(jié)語(yǔ)

人源化小鼠模型在探索各類(lèi)發(fā)病機(jī)制和評(píng)估治療性藥物尤其是人源化抗體類(lèi)藥物的研發(fā)中發(fā)揮重要作用。目前，人源化小鼠模型已在感染性疾病、血液系統(tǒng)病及腫瘤等方面研究中得到了廣泛應(yīng)用并逐漸成為人類(lèi)個(gè)性化治療的載體。但人源化小鼠模型的發(fā)展仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如是否能徹底消除小鼠天然NK細(xì)胞活性、簡(jiǎn)化供者組織提取、降低免疫排斥反應(yīng)等。人源化小鼠模型的構(gòu)建成本相對(duì)較高，一方面是其依賴(lài)于重度免疫缺陷小鼠作為受體，另一方面，供體由于是人體組織和細(xì)胞，來(lái)源較為受限，同時(shí)存在一些倫理問(wèn)題；此外，由于重度免疫缺陷小鼠遺傳背景的單一性，其應(yīng)用也受到一定限制。如何有效克服這些問(wèn)題并推廣到臨床研究中，需要更多的探索和驗(yàn)證。

人源化小鼠模型為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了理想的工具，隨著重度免疫缺陷小鼠的發(fā)展和成熟，其可耐受人源細(xì)胞和組織的程度越來(lái)越高，小鼠人源化的水平也越來(lái)越高。通過(guò)用人源化小鼠模型盡可能復(fù)制人類(lèi)免疫微環(huán)境，以模擬患者腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，在研究腫瘤耐藥、患者抗癌方案的篩選方面得到的數(shù)據(jù)更為可靠，特別是引入PDX小鼠模型中的免疫細(xì)胞提高了個(gè)體潛在臨床前治療的可預(yù)測(cè)性［65-66］。另外，目前較火爆的靶向免疫療法應(yīng)用評(píng)價(jià)也得益于人源化小鼠模型［67-68］。然而，人源化小鼠模型在精準(zhǔn)醫(yī)療方面的應(yīng)用仍面臨諸多瓶頸，包括免疫細(xì)胞和腫瘤之間的MHC不相容性，鼠類(lèi)固有免疫細(xì)胞的殘留以及缺乏人類(lèi)特異性的細(xì)胞因子等。由于免疫缺陷小鼠自身存在個(gè)體差異，加之在移植人源組織或細(xì)胞的過(guò)程中由于組織或細(xì)胞的不均一性以及手術(shù)操作的不穩(wěn)定性，人源化小鼠模型的可復(fù)制性和建模成功率較不穩(wěn)定。例如，建模成功后部分小鼠體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)移植物抗宿主排斥反應(yīng)，而部分小鼠體內(nèi)并未出現(xiàn)；移植物存活時(shí)間和存活狀態(tài)因個(gè)體不同而存在較大差異；人源化小鼠的成模時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，造模成功后模型穩(wěn)定期相較于治療方案的一一驗(yàn)證又相對(duì)較短，對(duì)急需有效治療方案的腫瘤患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)漫長(zhǎng)的等待過(guò)程，甚至有部分患者在治療方案沒(méi)有優(yōu)化前就出現(xiàn)病情惡化。人源化小鼠模型為精準(zhǔn)治療的發(fā)展提供了前所未有的平臺(tái)，優(yōu)化人源化小鼠模型對(duì)于精準(zhǔn)醫(yī)療來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)長(zhǎng)期的革命，建模前對(duì)重度免疫缺陷小鼠均一性的優(yōu)選、建立系統(tǒng)化的樣本處理流程指南、臨床醫(yī)生和科研人員的密切配合和無(wú)延時(shí)銜接等，都是未來(lái)要解決的問(wèn)題。