艾珊珊,崔濤,周樂,申振,李偉,韓聰

(1.濟寧醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院,山東 濟寧 272067;2.濟南市章丘區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腎病科,山東 濟南 250200;3.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,山東 濟南 250014;4.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 山東 濟南 250014)

糖尿病腎病(DKD)是由糖尿病(DM)引起的腎臟損傷,主要表現為蛋白尿、腎小球濾過率(eGFR)持續(xù)下降及微血管病變等[1]。臨床多采用降糖、降壓、飲食控制等常規(guī)治療,可適當延緩疾病進展,但仍有部分患者療效不甚明顯,因此積極尋求有效的防治策略,具有重要的臨床和社會意義。益腎化濕顆粒是一種廣泛應用于治療慢性腎小球腎炎的中成藥,具有升陽補脾、益腎化濕、利水消腫的功效,多項臨床研究表明益腎化濕顆?？筛纳艱KD患者的癥狀,抑制炎癥反應,穩(wěn)定腎功能[2-5]。近年來關于“腸-腎軸”的研究揭示了腸道菌群可通過影響糖脂代謝、內毒素積累、炎癥反應、氧化應激等調節(jié)腎臟代謝進而影響DKD進程[6]。本團隊的前期實驗研究結果表明益腎化濕顆粒能通過“腸-腎軸”調節(jié)腸道菌群結構,降低腸道通透性,增加乳桿菌屬等益生菌含量,降低厭氧螺菌屬等條件致病菌含量,改善DKD大鼠糖脂代謝,減輕炎癥水平,保護腎功能[7]?；诖?本研究擬通過研究益腎化濕顆粒治療DKD的臨床療效及腸道菌群的變化,探討其通過“腸-腎軸”改善DKD的作用機制。

1 臨床資料

1.1 樣本量計算

使用臨床試驗的樣本量計算公式:n=(uα+uβ)22p(1-p)/(p1-p0)2,查閱相關文獻報道[3-5],p0代表西醫(yī)對癥治療后的達到療效約為60%,p1代表西醫(yī)對癥治療加用益腎化濕顆粒后達到的療效約為88%,計算出n≈42,即每組的樣本量為42,考慮到15%的脫失率,擬每組的樣本含量為42/(1-15%)≈50例。

1.2 一般資料

選取2020年11月至2021年8月于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腎病科就診的DKD脾虛濕盛證患者100例,按隨機數字表法分為試驗組及對照組,對結局評估者進行設盲。試驗組男31例,女19例;平均年齡(60.52±10.04)歲;平均收縮壓(127.26±8.23)mmHg;平均舒張壓(81.68±8.69)mmHg。對照組男27例,女23例;平均年齡(59.14±10.89)歲;平均收縮壓(128.82±7.89)mmHg;平均舒張壓(81.48±9.94)mmHg。2組患者一般資料、慢性腎臟病分期及尿蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理批號:KY2020-046)。

1.3 診斷標準

1.3.1 西醫(yī)診斷標準 符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]與《CKD評估與管理臨床實踐指南,KDIGO,2012》[9]制定的DKD診斷標準:有確診的糖尿病病史,根據尿蛋白肌酐比值(UACR)增高或腎小球濾過率(eGFR)下降、同時排除其他慢性腎臟病(CKD)。本研究選取患者分期為G1A1-G3aA3,參照2009年CKD流行病學協(xié)作組提出的CKD-EPI公式[10],G1-G3a即eGFR>45 mL·min·1·1.73 m-2,A1期:ACR<30 mg·g-1,A2期:ACR 30～300 mg·g-1,A3期:ACR>300 mg·g-1。

1.3.2 中醫(yī)診斷標準 參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[11]中脾虛濕盛證診斷標準,主癥:顏面部或肢體浮腫,疲倦乏力,食少納呆,便溏;次癥:畏寒肢冷,腰脊酸痛;舌脈:舌淡胖嫩,舌苔白或白膩,脈沉細。具備主癥2項加次癥2項,結合舌脈即可診斷。

1.4 納入及排除標準

1.4.1 納入標準 ①年齡18～75歲;②符合CKD(G1A1-G3aA3期)及中醫(yī)脾虛濕盛證診斷標準;③患者同意并簽署知情同意書。

1.4.2 排除標準 ①其他繼發(fā)性腎臟疾病;②合并有嚴重的心腦血管等原發(fā)性疾病或影響生存的其他嚴重疾病;③妊娠或哺乳期婦女;④近1月接受抗生素或微生物治療;⑤正參與其他藥物臨床研究。

1.4.3 剔除及脫落標準 ①出現過敏反應或嚴重不良事件;②依從性差,未按要求服藥;③納入后資料不完全;④主動退出研究。

2 方法

2.1 治療方法

對照組:予醫(yī)學營養(yǎng)治療、生活方式干預等一般治療。常規(guī)給與鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,每片0.5 g)口服,每次0.25 g,每日3次;達格列凈片(阿斯利康制藥有限公司,每片5 mg)口服,每次5 mg,每日1次;纈沙坦膠囊(天大藥業(yè)有限公司,每粒80 mg)口服,每次80 mg,每日1次。

試驗組:在對照組治療基礎上加用益腎化濕顆粒(廣州康臣藥業(yè),每袋10 g),熱水沖服,每次10 g,每日3次。若血壓控制不佳可加用非ACEI/ARB類藥物,原有方案不再加量。

2組患者均連續(xù)治療8周。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 實驗室指標 采集患者治療前后空腹靜脈血各5 mL,肝素抗凝,3 000 r·min-1離心5 min后取血清,置-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測患者尿蛋白肌酐比值(UACR)、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1C)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腎小球濾過率(eGFR)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)、尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平或活性。以上委托山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科完成。

2.2.2 中醫(yī)證候積分評估 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[11],記錄治療前后2組患者的中醫(yī)證候積分,主癥:顏面部或肢體浮腫,疲倦乏力,食少納呆,便溏,按輕、中、重分別記為2、4、6分;次癥:畏寒肢冷,腰脊酸痛按輕、中、重分別記為1、2、3分。積分越高,癥狀越嚴重。

2.2.3 臨床療效判定 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[11]擬定。顯效:①中醫(yī)證候積分減少≥60%;②UACR值減少≥40%;③FBG 控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指標值均減少≥10%。有效:①中醫(yī)證候積分減少≥30%;②UACR值減少,但沒有達到顯效標準;③FBG下降但未控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指標減少未達顯效標準。無效:患者各項臨床癥狀均無改善或者惡化,UACR等指標未下降甚至升高者。其中,①②③項為必備條件。

2.2.4 患者糞便16S rDNA V3+V4 區(qū)測序 治療8周后無菌隨機收集2組各30例患者糞便5 g至EP管,存于-80 ℃冰箱保存。提取患者糞便基因組 DNA,對16S V3+V4區(qū)進行PCR擴增,使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒構建文庫,經Qubit和Q-PCR定量檢測合格后使用NovaSeq6000進行上機測序。

2.2.5 安全性指標 治療前后檢測患者血常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能,監(jiān)測心電圖,觀察研究期間不良反應的發(fā)生情況。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分情況比較

結果見表1。

3.2 2組患者治療前后各生化指標情況比較

結果見表2、表3。

3.3 2組患者臨床療效比較

結果見表4。

表1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較

表2 2組患者治療前后生化指標情況比較[M(P25,P75), n=50]

表3 2組患者治療前后生化指標比較

表4 2組患者臨床療效比較(n=50)

3.4 2組患者安全性檢測

2組患者均無不良反應出現,治療前后未出現血常規(guī)、大便常規(guī)、肝功能等指標的異常。

3.5 2組治療后腸道菌群 16S V3+V4測序

3.5.1 測序質量評估及物種注釋分析 當測序序列接近 40 000時幾乎無新的OTUs產生,表明測序深度足夠,物種累積箱型圖漸進平緩,提示樣本量足夠。見圖1。

注:A.樣品稀釋曲線;B.物種累積箱型圖;N.對照組;Y.試驗組

3.5.2 腸道菌群多樣性分析 通過Shannon、Simpson指數分析2組樣本菌群群落,Alpha多樣性結果顯示試驗組患者腸道菌群較對照組顯著升高(P<0.05)。進一步對2組樣本進行Beta多樣性PCoA分析,結果試驗組菌群樣本聚合度明顯優(yōu)于對照組,提示組內患者間菌群構成差異較小。門水平條形圖顯示2組優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes),且試驗組F/B的值顯著低于對照組(P<0.05)。見圖2。

注:A.Shannon指數組間差異條形圖;B.Simpson指數組間差異條形圖;C.組間PCoA比較圖; D.2組前10菌門條形圖;E.F/B值組間差異條形圖;N.對照組;Y.試驗組;與對照組比較,*P<0.05。

3.5.3 組間差異屬種篩選 通過統(tǒng)計豐度前10的菌屬發(fā)現擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)占主要地位；統(tǒng)計豐度排名前10的菌種發(fā)現普氏糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)占主要地位。在此基礎上利用LEfSe分析組間豐度差異顯著的物種，發(fā)現試驗組的優(yōu)勢屬種為副擬桿菌屬、長雙歧桿菌、黏膜乳桿菌，對照組優(yōu)勢屬種為擬桿菌屬、糞擬桿菌(Bacteroides-caccae)。見圖3。

注:A.屬水平物種相對豐度柱狀圖;B.種水平物種相對豐度柱狀圖;C.LEfSe差異物種;N.對照組;Y.試驗組

4 討論

近年來DM患病率急劇增加,DKD的患病率亦迅速增長,因其低知曉率和高死亡率,現已成為CKD和終末期腎病(ESRD)的主要原因[12]。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為DKD屬于中醫(yī)學“腎消”“水腫”“虛勞”等范疇[13]。其由消渴病遷延而成,根本病機在于氣陰不足，燥熱內生。內熱灼陰,致使腎陰不足;內熱傷脾,脾氣不足失于運化。脾腎既虧,固攝失常,則見水液停聚,精微下注,發(fā)為本病。李東垣指出“地氣者,人之脾胃也,脾主五臟之氣,腎主五臟之精,皆上奉于天,二者俱主生化以奉升浮,是知春生夏長，皆從胃中出也”[14],重在調理脾腎二臟。益腎化濕顆粒方中重用黃芪為君藥，臣以人參、白術健脾益腎補氣，氣行則中焦通達，氣旺則升發(fā)有力；佐以羌活、獨活、柴胡、防風等諸風藥，味薄氣輕而升散之力強，功可升舉陽氣，氣升濕化，祛風除濕，可免滋補而戀邪之憂患；白芍養(yǎng)血和營斂陰，又可防諸風藥辛燥太過耗氣傷陰；黃連、半夏、陳皮清熱燥濕；茯苓、澤瀉利水滲濕，導濕熱從小便排出，濁邪去，而清陽得升；炙甘草為使藥，調和諸藥。整方補瀉有度，升降相宜，共奏健脾益腎、升陽化濕之效，為脾虛濕盛證之效方。本研究顯示,試驗組可明顯改善患者浮腫,疲倦乏力,食少納呆，便溏，畏寒肢冷等臨床癥狀,且有效率為84%,明顯優(yōu)于對照組。

研究表明[3, 15]IL-6的釋放增加,可以促進炎性巨噬細胞的浸潤,導致腎小球基底膜增厚,加速腎小球的硬化,從而加快腎小球的損傷。SOD可以催化超氧化物自由基轉化為過氧化氫,其活性可反映機體抗氧化能力,通過減少自由基堆積、破壞足細胞,減少細胞外基質降解等保護腎臟。本研究顯示益腎化濕顆?？捎行Ы档虳KD患者UACR、HbA1C、IL-6水平,提高SOD活性和ALB水平,提示益腎化濕顆粒能一定程度降低DKD患者腸道通透性,減少毒素物質進入循環(huán),降低尿蛋白水平,改善糖代謝,減輕炎癥和氧化應激損傷，從而多靶點保護腎功能,延緩疾病進展。

Meijers、Ritz等團隊相繼提出的“腸-腎軸”“腸腎綜合征”[16-17],認為腸道菌群失衡與腎臟疾病相互影響。研究表明[18],腸道菌群失調可增加腸道通透性、黏膜免疫反應,促進腸內代謝廢物和致病菌種進入血液循環(huán),產生大量炎癥介質,減少短鏈脂肪酸含量,加重氧化應激損傷,增加胰島素抵抗,促進DM進展。進一步擾亂RAS系統(tǒng)、損傷腎單位,降低腎小球濾過率,惡化腎功能[19-20]。腎損害導致的循環(huán)代謝廢物過度蓄積通過受損腸壁進入腸腔,進一步加重腸內菌群紊亂,形成腸-腎惡性循環(huán)[21]。江毅等[22]發(fā)現氣虛證患者腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的比值較健康人群升高,腸道結構發(fā)生改變,表明腸道菌群的差異性改變可能是導致氣虛證發(fā)生發(fā)展的生物學基礎。內濕致病會使體內的腸道菌群穩(wěn)態(tài)遭到破壞,出現腸道菌群失調,同時腸道菌群失調也是內濕致病的一個重要病理因素[23]。王卓等[24]發(fā)現脾虛濕盛證大鼠腸道較造模前菌群的數量及有益菌的種類明顯減少,中藥對癥治療后菌群逐漸恢復、中醫(yī)癥狀減輕。故針對DKD脾虛濕盛證,腸道菌群的分布及豐度亦是重要的作用環(huán)節(jié)。

本研究通過高通量16S rDNA基因測序分析腸道微生物群,發(fā)現2組患者腸道微生物存在一定的差異性。試驗組患者Shannon、Simpson指數高于對照組,F/B的值遠低于對照組。Shannon指數、Simpson指數與腸道菌群群落多樣性成正比,F/B的值與腸道菌群紊亂程度成正比。本研究結果顯示益腎化濕顆粒在一定程度上糾正了DKD患者腸道菌群紊亂,穩(wěn)定了菌群結構。進一步通過LEfSe分析發(fā)現試驗組的優(yōu)勢屬種為副擬桿菌屬、長雙歧桿菌和黏膜乳桿菌。有研究表明副擬桿菌屬下的菌種狄氏副擬桿菌可以通過產琥珀酸和次級膽汁酸,降低糖代謝紊亂程度[25];長雙歧桿菌可以降低血糖,緩解胰島素抵抗,調節(jié)免疫,改善炎癥狀態(tài)[26-27];黏膜乳桿菌可以改善糖脂代謝,穩(wěn)定屏障功能,減少“腸漏” 及病原體在腸道的定植,降低疾病易感性,后二者都可代謝產生乳酸、乙酸及醋酸鹽,降低腸道pH值,阻止病原體生長,與其他共生微生物群(例如糞桿菌)構建微生物生態(tài)網絡,共同改善腎臟代謝[28-30]。

綜上,益腎化濕顆?？捎行Ц纳艱KD脾虛濕盛證患者的中醫(yī)臨床證候,降低患者血糖、蛋白尿、炎癥及氧化應激損傷水平,并可以引起腸道菌群分布及豐度的改變,主要是副擬桿菌屬、長雙歧桿菌及黏膜乳桿菌等益生菌的含量升高。我們接下來將進行更為深入的糞菌移植研究。