馮韜,呂燁華,王盛,黃維,糜大國(guó)

(南通大學(xué)附屬南通市中醫(yī)院,江蘇 南通 226001)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病,在病理生理學(xué)上包含2個(gè)階段,即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[1]。這2個(gè)階段尤其是繼發(fā)性損傷階段中凋亡信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自由基形成等級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠?qū)е聶C(jī)體嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[2]。SCI以其高發(fā)病率、高致殘率以及治療護(hù)理的昂貴成本等特性,給患者家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)[3-5]。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性SCI持續(xù)存在所導(dǎo)致的病理表征,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的擴(kuò)大損傷過程中扮演重要角色。在大鼠SCI中,細(xì)胞凋亡最早在損傷后4 h發(fā)生,并在第7天達(dá)到高峰;在損傷部位,大部分少突膠質(zhì)細(xì)胞在SCI后7 d內(nèi)凋亡[6]。如何抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、恢復(fù)急性SCI后的神經(jīng)功能成為目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

黃芪注射液(Astragalus injection,AS)是由中藥黃芪提取而來,主要成分包含黃芪皂苷和黃酮兩大類[7-8]。黃芪具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等良好功效,在肝損傷、糖尿病、癌癥等疾病治療中蘊(yùn)藏著巨大應(yīng)用價(jià)值[7,9-11]。黃芪對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也具有較好的保護(hù)功能[12]。黃芪注射液可通過抑制死亡受體通路和線粒體通路中關(guān)鍵因子的激活抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,降低神經(jīng)毒性,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,進(jìn)而緩解腦缺血性損傷[13-16]。黃芪注射液在急性SCI中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但其機(jī)制尚不明確。本研究構(gòu)建了大鼠急性SCI模型,探究黃芪注射液對(duì)大鼠急性SCI的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制,為預(yù)防和治療SCI提供新的思路和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 動(dòng)物

40只SPF級(jí)雄性SD大鼠,購(gòu)自南京青龍山繁殖場(chǎng),許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0001,體質(zhì)量180～200 g。大鼠飼養(yǎng)于恒溫(21～23 ℃)、恒濕(45%～65%)的環(huán)境中,保持12 h明暗循環(huán),自由進(jìn)食飲水。所有實(shí)驗(yàn)均遵循南通大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用指南,本實(shí)驗(yàn)方案獲南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：S20201201-399。

1.2 試劑

黃芪注射液(上海禾豐制藥有限公司,每支10 mL(相當(dāng)于原藥材20 g);尼氏染色液(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào):YT167);TUNEL檢測(cè)試劑盒:DAB(SA-HRP) TUNEL Cell Apoptosis Detection Kit(Servicebio,貨號(hào):G1507);TRIzol(Sigma,貨號(hào):T9424);UeIris Ⅱ RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis(with dsDNase)(蘇州宇恒生物科技有限公司,貨號(hào):R2028);2×SYBR Green qPCR Master Mix(蘇州宇恒生物科技有限公司,貨號(hào):S2014);FAIM抗體(Affinity,貨號(hào):DF6119);FAS抗體(Affinity,貨號(hào):AF5342);Anti-TRAIL抗體(Abcam,貨號(hào):ab231063);Cleaved Caspase-8(Asp387)抗體(CST,貨號(hào):#9429);Anti-Bcl-2抗體(Abcam,貨號(hào):ab196495);Anti-Bax抗體(EPR18283)(Abcam,貨號(hào):ab182733);Cleaved Caspase-3(Asp175)(5A1E)Rabbit mAb(CST,貨號(hào):#9664);重組Anti-Caspase-9抗體(EPR18868)(Abcam,貨號(hào):ab184786);β-Tubulin抗體(CST,貨號(hào):#2146);山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(Affinity,貨號(hào):S0001);ECL Plus檢測(cè)試劑盒(Affinity,貨號(hào):K002)。

1.3 儀器

石蠟切片機(jī)(Leica,型號(hào):RM2235);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào):Tanon-4600);高通量組織勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號(hào):Scientz-48);微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司,型號(hào):Nano-500);倒置熒光顯微鏡(Olympus,型號(hào):IX3-SVR);PCR熱循環(huán)儀(Applied biosystems,型號(hào):VeritiPro);qPCR儀(Applied biosystems,型號(hào):QuantStudio 3)。

2 方法

2.1 大鼠SCI模型制備

參考姚年偉等[17]的方法。所有SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉,背部切開以暴露椎旁肌肉,在T9～T11進(jìn)行椎板切除術(shù),在不損傷硬膜的情況下暴露脊髓。將10 g的金屬棒從25 mm的高度自由落下,使大鼠后背暴露的脊椎承受重量墜落沖擊。隨后,將手術(shù)切口的肌肉和皮膚分別縫合。給每只大鼠皮下注射1 mL生理鹽水溶液以補(bǔ)充手術(shù)過程中損失的血容量。手術(shù)后,將無菌紗布包裹在大鼠的傷口周圍。每日向大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)飲食和水。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)假手術(shù)(Sham)組,組內(nèi)大鼠進(jìn)行相同手術(shù)過程,但不進(jìn)行脊椎重量墜落沖擊。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

40只健康的雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組,黃芪注射液低、中、高劑量組,每組8只。黃芪注射液低、中、高劑量組大鼠在造模后3 d內(nèi)每日腹腔注射相應(yīng)劑量的黃芪注射液(1、2、4 mL·kg-1)。黃芪注射液劑量設(shè)定參照Zhou等的研究[14]。假手術(shù)組和模型組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分

對(duì)造模給藥后1、2、3 d的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。按BBB評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠雙后肢神經(jīng)功能恢復(fù)情況[18]。評(píng)分由非本組實(shí)驗(yàn)人員且熟悉BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的觀察者獨(dú)立進(jìn)行。

2.4 Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)

在造模給藥后1、2、3 d的各組大鼠中隨機(jī)抽取6只,將大鼠豎直放于木板上,將木板從水平位置起逐漸增大該木板與水平面之間的角度,每次以5°為界值成梯度升高,以大鼠能夠在木板上停留5 s而不下落的最大角度作為其最終的神經(jīng)功能值。

2.5 骨髓組織病理切片的制備與觀察

將大鼠俯臥位,取腰背部后正中切口,依次切開皮膚、筋膜至棘上韌帶、棘突,由棘突兩旁分離豎脊肌,咬骨鉗咬除T9-L4棘突和椎板,鋒利刀片切斷神經(jīng)根、脊髓和馬尾神經(jīng),細(xì)心分離后完整取出T9段骨髓組織,一部分置-80 ℃冰箱備用,另一部分用4%多聚甲醛溶液固定,將標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、修片切片后,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及尼氏染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照與分析。

2.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序

將各組大鼠骨髓取材,按照TRIzol試劑使用方法進(jìn)行總RNA提取,通過微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度。使用VAHTS?mRNA-Seq V3 Library Prep Kit for Illumina(Vazyme,NR611)構(gòu)建RNA文庫(kù)后,再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.7 qPCR檢測(cè)

反應(yīng)混合物包含2 μL模板cDNA,正向和反向引物各0.3 mmol·L-1,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)試劑(TaKaRa)10 μL。將GAPDH用作內(nèi)部參照。FAIM正向引物:5′-CACGTCAGGCAAACGAGTTG-3′,反向引物:5′-GGTGGCTTTGGTCTTTGCAG-3′;TRAIL正向引物:5′-CCCAGAGGTAGAAGACCCCA-3′,反向引物:5′-TGGCCCAAGGTCTTTCCATC-3′;GAPDH正向引物:5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′,反向引物:5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。所有反應(yīng)重復(fù)3次。使用2-ΔΔCt方法分析基因相對(duì)表達(dá)量[19]。

2.8 Western blot檢測(cè)

參考前人的方法[14]。將提取的大鼠脊髓蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。分別與一抗[FAIM抗體、FAS抗體、Anti-TRAIL抗體、Cleaved Caspase-8(Asp387)抗體、Anti-Bcl-2抗體、Anti-Bax抗體、Cleaved Caspase-3(Asp175)(5A1E)抗體、Anti-Caspase-9抗體均1∶1 000稀釋，β-Tubulin抗體1∶5 000稀釋]和二抗(1∶5 000稀釋)孵育并洗滌后,利用ECL顯色。凝膠分析系統(tǒng)掃描每個(gè)條帶蛋白,通過圖像分析軟件(Image J)測(cè)量條帶的灰度值。

2.9 TUNEL檢測(cè)

TUNEL檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行：將大鼠脊髓組織石蠟切片脫蠟,利用Proteinase K對(duì)其修復(fù)、破膜,隨后再進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶滅活。經(jīng)室溫平衡后繼續(xù)標(biāo)記反應(yīng)、DAB顯色以及蘇木素染核,最后封片鏡檢。

2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)AS對(duì)急性SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能影響

BBB評(píng)分結(jié)果如圖1,假手術(shù)組在1、2、3 d時(shí)的評(píng)分分別為19.83±1.72、19.17±1.72、21.17±0.75,表明后肢神經(jīng)功能正常。模型組以及黃芪注射液組在給藥1 d時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的后肢神經(jīng)功能障礙。黃芪注射液各劑量組在給藥后第3天的BBB評(píng)分均高于模型組(P<0.01),表明黃芪注射液有助于急性SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能加速恢復(fù)。大鼠斜板實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出類似趨勢(shì)(圖1),與模型組比較,黃芪注射液各劑量組術(shù)后第3天的大鼠斜板實(shí)驗(yàn)臨界角度顯著增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。BBB行為評(píng)分和Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示黃芪注射液加速恢復(fù)急性SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。

注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01;與黃芪注射液低劑量組比較,

3.2 組織病理學(xué)觀察

脊髓組織HE染色觀察結(jié)果如圖2所示,假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整清晰,無病變。而模型組視野中脊髓組織有明顯出血、神經(jīng)細(xì)胞水腫。給予黃芪注射液后,脊髓組織病變程度得到緩解。與模型組和黃芪注射液低劑量組比較,黃芪注射液中劑量組和高劑量組的組織結(jié)構(gòu)較完整。與黃芪注射液低劑量組和中劑量組比較,高劑量組無明顯組織出血。尼氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2),與假手術(shù)組比較,模型組尼氏小體溶解消失,神經(jīng)元細(xì)胞損壞嚴(yán)重。黃芪注射液各劑量組尼氏小體數(shù)目較模型組多,其中中劑量組和高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)。由此可見,黃芪注射液對(duì)急性SCI后的神經(jīng)保護(hù)具有顯著作用。

注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,

3.3 差異表達(dá)基因分析

為探究黃芪注射液對(duì)SCI神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制,對(duì)假手術(shù)組、模型組、黃芪注射液高劑量組骨髓組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過層次聚類分析發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組和模型組被聚為2大類(圖3A),符合SCI后基因差異表達(dá)預(yù)期。而模型組和黃芪注射液高劑量組未被聚類。與假手術(shù)組比較,模型組顯著上調(diào)基因數(shù)為2 393個(gè),下調(diào)基因數(shù)為2 204個(gè)(圖3B)。模型組與黃芪注射液高劑量組比較,有54個(gè)基因差異表達(dá)顯著(圖3C～D)。韋恩圖分析數(shù)據(jù)顯示,假手術(shù)組與模型組顯著差異表達(dá)的基因中有21個(gè)基因在模型組與黃芪注射液高劑量組比較中同時(shí)存在顯著差異表達(dá)(圖3E),這暗示了黃芪注射液可能通過對(duì)這21個(gè)基因進(jìn)行靶向調(diào)控,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)SCI的治療作用。對(duì)這21個(gè)基因人工分析后,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的基因:FAIM和TRAIL。

注:A.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的層次聚類分析;B.模型組與假手術(shù)組比較差異表達(dá)基因火山圖;C.模型組與黃芪注射液高劑量組比較差異表達(dá)基因火山圖; D.描繪全基因組RNA-Seq數(shù)據(jù)的Circos圖;E.B和C中差異表達(dá)基因的韋恩圖;Sham.假手術(shù)組;SCI.模型組;SCI_AS.黃芪注射液高劑量組

3.4 差異表達(dá)基因定量驗(yàn)證

通過qPCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出來的2個(gè)基因FAIM和TRAIL在不同組的大鼠脊髓中的mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖4所示,與假手術(shù)組比較,模型組的FAIMmRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.01),中、高劑量黃芪注射液能上調(diào)損傷脊髓中的FAIM的表達(dá)(P<0.01)。相反,模型組中的TRAILmRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01),而黃芪注射液能夠下調(diào)損傷脊髓中的TRAIL轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05，P<0.01),并且劑量越高,下調(diào)程度越大。這與前述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。FAIM和TRAIL是死亡受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的2個(gè)重要基因,黃芪注射液對(duì)其表達(dá)量的影響表明細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑可能參與了黃芪注射液對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用過程。

注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與黃芪注射液低劑量組比較,

3.5 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

圖5顯示,與假手術(shù)組比較,模型組脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重(P<0.01)。黃芪注射液各劑量組的大鼠脊髓組織細(xì)胞凋亡率有所下降(P<0.05,P<0.01),隨著黃芪注射液劑量的提高,神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低。

注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與黃芪注射液低劑量組比較,

3.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

結(jié)果如圖6所示,與假手術(shù)組比較,模型組的死亡途徑受體Fas、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL以及促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01),凋亡信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8和Cleaved-Caspase-9被激活(P<0.01),Fas凋亡抑制分子FAIM蛋白和抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)量顯著降低(P<0.01),可見SCI后大量神經(jīng)元細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序。與模型組比較,黃芪注射液高劑量組的Fas、TRAIL、Bax蛋白表達(dá)量被顯著下調(diào)(P<0.05，P<0.01),Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-8和Cleaved-Caspase-9活性被抑制(P<0.01),FAIM和Bcl-2的表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(P<0.01)。表明黃芪注射液能夠通過影響細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑關(guān)鍵蛋白來保護(hù)損傷脊髓組織的神經(jīng)細(xì)胞。

注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與黃芪注射液低劑量組比較,

4 討論

SCI是一種破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病。近年來,科學(xué)研究在SCI的病理生理方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。雖然各類針對(duì)SCI的治療干預(yù)措施表現(xiàn)出較好的效果,但對(duì)于控制繼發(fā)性SCI階段相關(guān)事件的級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及對(duì)損傷脊髓組織的再生和神經(jīng)功能恢復(fù)仍具有挑戰(zhàn)性[20]。黃芪是一種常用的低毒、副作用小的中草藥，其提取物黃芪甲苷Ⅳ可以逆轉(zhuǎn)或緩解多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如帕金森病和腦缺血[21-22]。有研究報(bào)道,黃芪注射液對(duì)脊髓缺血再灌注的大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[14,23]。本研究通過組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),高劑量黃芪注射液有效改善損傷脊髓的組織病變,對(duì)SCI大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用。行為學(xué)研究表明,黃芪注射液能夠加速SCI大鼠后期神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(P<0.05，P<0.01)。由此可見,黃芪注射液對(duì)急性SCI疾病具有潛在的高效治療效果。

SCI中的繼發(fā)性SCI病癥涉及復(fù)雜的分子生化機(jī)制,包括自由基形成、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳遞等[24-25]。細(xì)胞凋亡在SCI的急性期以及繼發(fā)損傷病變中發(fā)揮關(guān)鍵作用,抑制SCI脊髓組織中細(xì)胞凋亡是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的有效思路。黃芪甲苷可通過各類途徑抑制腦缺血/再灌注損傷大鼠的細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13,26]。相關(guān)報(bào)道表明SCI 4 h后即開始出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[27]。本研究在給予黃芪注射液干預(yù)3 d后通過對(duì)急性損傷的脊髓組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重(P<0.01),而黃芪注射液干預(yù)后,細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性下降(P<0.05，P<0.01),這表明黃芪注射液對(duì)急性SCI中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路具有調(diào)控作用。

細(xì)胞凋亡通路主要包含外源性和內(nèi)源性2個(gè)途徑,半胱天冬酶是這兩個(gè)途徑中的重要組成部分[28-29]。外源性途徑也稱為死亡受體途徑,由TNFR(腫瘤壞死因子受體)、Fas-FasL和腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)介導(dǎo)[30]。死亡受體的激活導(dǎo)致Caspase-8和Caspase-10被募集和激活,繼而觸發(fā)Pro-Caspase-3向Caspase-3的轉(zhuǎn)化。另外,Fas信號(hào)途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可被Fas凋亡抑制分子FAIM所抑制[31]。在內(nèi)源性途徑中,組織損傷后刺激細(xì)胞色素C的釋放和促凋亡蛋白的上調(diào),招募凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1),激活Caspase-9活性,進(jìn)而促進(jìn)凋亡體的形成[32]。外源和內(nèi)源途徑雖然啟動(dòng)階段不同,但下游有多種相同蛋白質(zhì)的活性調(diào)控過程,如糖原合酶激酶3(GSK3)、Bcl-2家族成員(Bcl-2、Bax)等[33]。本研究為深入探究黃芪注射液的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,對(duì)各組大鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過層次聚類分析發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組和模型組被聚為2大類,符合SCI后基因差異表達(dá)預(yù)期。模型組和黃芪注射液高劑量組未被聚類,一方面,這可能由于黃芪注射液引起的顯著差異表達(dá)基因數(shù)相對(duì)于全基因數(shù)較少所導(dǎo)致;另一方面,可能因黃芪注射液干預(yù)時(shí)間不夠,機(jī)體還未產(chǎn)生足量的差異表達(dá)基因。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SCI后諸多細(xì)胞凋亡通路相關(guān)基因差異表達(dá),黃芪注射液的干預(yù)導(dǎo)致FAIM、Fas基因的表達(dá)變化。qPCR驗(yàn)證表明,大鼠脊髓損傷后,黃芪注射液可上調(diào)FAIMmRNA的表達(dá)(P<0.01),抑制FasmRNA的表達(dá)(P<0.01)。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量進(jìn)行Western blot檢測(cè),大鼠脊髓損傷后,促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降(P<0.01);Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9被激活(P<0.01),損傷組織的細(xì)胞凋亡被啟動(dòng)。黃芪注射液干預(yù)治療后,細(xì)胞凋亡有所抑制(P<0.05，P<0.01),死亡途徑啟動(dòng)階段的Fas、TRAIL蛋白表達(dá)被抑制(P<0.05，P<0.01),相反,Fas凋亡抑制分子FAIM表達(dá)被上調(diào)(P<0.05，P<0.01),這表明黃芪注射液調(diào)控了死亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,模型組相比于黃芪注射液干預(yù)組的差異表達(dá)基因,與模型組相比于假手術(shù)組的差異表達(dá)基因有21個(gè)共有基因，暗示可能存在其他多種信號(hào)通路介導(dǎo)黃芪注射液對(duì)SCI的神經(jīng)保護(hù),有待深入探索。

綜上所述,大鼠急性SCI后,啟動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。黃芪注射液的干預(yù)治療,可通過對(duì)死亡受體途徑Fas和TRAIL蛋白的抑制,進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的程序性凋亡,發(fā)揮對(duì)SCI的神經(jīng)保護(hù)作用,改善脊髓組織損傷病變程度,加速后期神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙的恢復(fù)。