孫繼超,張碧霞,李偉偉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

注意缺陷多動障礙(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是兒童常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,其核心癥狀表現(xiàn)為與年齡不相稱的注意力不集中、多動和沖動行為,全球患病率為6%～8%[1]。目前ADHD發(fā)病機制尚不明確,研究認(rèn)為該病是由遺傳與環(huán)境共同作用導(dǎo)致的,其中針對分子遺傳學(xué)的相關(guān)研究,尤其是有關(guān)“多巴胺系統(tǒng)缺陷”假說是研究的熱點[2]。

滋腎瀉青湯是遵從錢乙“五臟辨證”理論中“補虛瀉實”的原則組方,由熟地黃、山萸肉、白芍、丹皮、何首烏、杜仲、龍膽草、柴胡、石菖蒲、甘草組成,具有益腎填精、疏肝瀉火、安神定志的功效,適用于ADHD證屬肝腎陰虛的患兒。方中熟地黃填精益髓，滋陰補腎,為本方之君藥。山萸肉滋補肝腎，補血固精,何首烏補益精血,杜仲補肝腎,柴胡為“肝膽之要藥”,味苦微寒,疏肝解郁,共為臣藥。白芍柔肝斂陰，平抑肝陽,丹皮清瀉虛熱兼緩山萸肉溫澀之藥性,龍膽草瀉肝膽之火,石菖蒲開竅豁痰，醒神益智共為佐藥,甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥配伍,補中有瀉,瀉中寓補,補瀉兼施,補大于瀉,可補肝腎之陰,兼顧清瀉“風(fēng)”“火”“痰”等病理產(chǎn)物[3]。

臨床研究表明滋腎瀉青湯治療ADHD有較好的療效[3],為進一步闡明滋腎瀉青湯方治療ADHD的作用機制,本實驗擬基于模型動物前額葉的多巴胺受體脫敏-復(fù)敏信號通路進行相關(guān)研究,以期為后期該方的進一步推廣提供參考。

1 材料

1.1 動物

3周齡SPF級雄性WKY大鼠10只,SHR大鼠50只,體質(zhì)量(62～75)g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,自由飲食進水,正式實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。實驗經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核，倫理編號：20180310。

1.2 藥物

滋腎瀉青湯方由熟地黃15 g，山萸肉10 g，白芍15 g，丹皮10 g，何首烏10 g，杜仲10 g，龍膽草5 g，柴胡10 g，石菖蒲10 g，甘草6 g組成,藥材同批次購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。將藥液濃縮至0.41、0.80、1.61 g·mL-1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利他林片(10 mg·片-1,批號:210619,蘇州第一制藥有限公司)。加雙蒸水溶解成0.067 g·L-1的混合液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器

pH酸度儀、精密天平(德國Sartorius公司);ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印儀、電泳槽(美國Bio Rad公司);M200 pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);Light Cycle型DNA熒光定量分析儀(德國Roche公司);Quantsdudio7熒光PCR儀(美國Life公司)等。開場試驗、水迷宮等行為學(xué)設(shè)備購自北京碩林苑科技有限公司,設(shè)備規(guī)格:開場實驗箱(100 cm×100 cm×40 cm),溫控水迷宮池(150 cm×50 cm),設(shè)備均經(jīng)黑色噴漆處理。通用小動物軌跡分析系統(tǒng)(SLY-ETS Version 1.66)。

1.4 主要試劑

β-actin多克隆抗體(美國Santa cruz，批號:sc-47778);Anti-GRK-6抗體、Anti-β-arrestin2抗體、Anti-NCS-1抗體、Anti-PSD-95抗體、Anti-PP2A抗體(美國Abcam公司,批號：ab106673、ab167047、ab129166、ab18258、ab32141)；羊抗兔二抗(美國Abcam,批號：ab6271);BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物(美國Thermo,貨號：23227、32109);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、RT-PCR試劑盒(日本TAKARA,貨號：9109、RR036A、RR820A)；PCR吸頭和離心管均為一次性無RNA酶產(chǎn)品,氯仿等其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 動物分組及處理

將10只WKY大鼠設(shè)為正常對照組,按數(shù)字表法將50只SHR大鼠隨機分為5組:模型組，利他林組，滋腎瀉青湯低、中、高劑量組,每組10只。服藥量根據(jù)9歲(體質(zhì)量26 kg)兒童體表面積和4周齡(體質(zhì)量60 g)SHR幼鼠體表面積進行換算[4]。正常對照組、模型組均以雙蒸水0.015 mL·g-1灌胃,滋腎瀉青湯低、中、高劑量組分別以對應(yīng)中藥溶液0.015 mL·g-1灌胃,合生藥量利他林組2 mg·kg-1，滋腎瀉青湯低劑量組、中劑量組、高劑量組6.0、12.1、24.1 g·kg-1,每日2次,持續(xù)4周。

2.2 行為學(xué)檢測

當(dāng)天首次給藥1 h后開始,在第2次灌胃前結(jié)束行為學(xué)測試,檢測過程中保持外界環(huán)境一致。實驗方法參照課題組前期實驗方法[5]。

開場實驗:分別在給藥前及給藥后2、4 周進行。將大鼠置于開場實驗箱中央?yún)^(qū)域,系統(tǒng)自動記錄大鼠5 min內(nèi)的總運動距離(m),攝像頭跟蹤描繪動物運動軌跡。

Morris水迷宮:在治療3周時進行。實驗連續(xù)進行6 d,第1～5天進行隱蔽站臺實驗,第6天進行空間探索實驗。統(tǒng)計各組大鼠第1～5天的潛伏期時間及第6天潛伏期的數(shù)據(jù)。

2.3 樣本處理

末次給藥后次日處死大鼠,冰臺上分離大腦前額葉組織,保存在液氮中,后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱備用。

2.4 Western blot法

蛋白提取、制膠及計算方法同前[6]。一抗?jié)舛确謩e為:兔源GRK-6一抗(1∶1 000)、兔源β-arrestin2一抗(1∶1 000)、兔源NCS-1一抗(1∶2 000)、兔源PSD-95一抗(1∶500)、兔源PP2A一抗(1∶5 000)。

2.5 引物設(shè)計

根據(jù)Gen-Bank設(shè)計引物,由生工生物工程有限公司完成,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,序列參見表1。

表1 引物序列

2.6 實時定量PCR法

腦組織提取RNA步驟及計算方法同前[6]。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 滋腎瀉青湯對SHR大鼠開場實驗運動距離的影響

結(jié)果如表2所示,與正常組相比,SHR大鼠在開場實驗中的活動距離顯著增加(P<0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后,與模型組對比,利他林組及中藥干預(yù)組的活動距離有所減少,其中滋腎瀉青湯各劑量組均可減少SHR大鼠的開場實驗運動距離(P<0.05，P<0.01)。

表2 滋腎瀉青湯對SHR大鼠開場實驗活動距離的影響

3.2 滋腎瀉青湯對SHR大鼠水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的影響

結(jié)果如表3所示,與正常組相比,SHR大鼠在水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的時間明顯減少(P<0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后,與模型組對比,利他林組及中藥干預(yù)組大鼠在水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的時間有減少趨勢或顯著減少(P<0.05，P<0.01)。

表3 滋腎瀉青湯對SHR大鼠水迷宮隱蔽站臺實驗潛伏期的影響

3.3 滋腎瀉青湯方對大鼠前額葉多巴胺受體脫敏-復(fù)敏信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組PP2A蛋白有下降趨勢,無統(tǒng)計學(xué)差異,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95蛋白表達明顯降低(P<0.05),而GRK-6的蛋白表達明顯增加(P<0.05);治療后,相比模型組,利他林組和滋腎瀉青湯治療組有上調(diào)β-arrestin2、NCS-1、PSD-95、PP2A蛋白表達的趨勢或能顯著提高上述蛋白的表達(P<0.05),同時有下調(diào)GRK-6蛋白表達的趨勢或顯著下調(diào)GRK-6的蛋白表達(P<0.05)。見圖1。

注: WKY+DDW.正常對照組;SHR+DDW.模型組;SHR+MPH. 利他林組;SHR+ZXT-L、M、H.滋腎瀉青湯低、中、高劑量組。與WKY+DDW組比較,*P<0.05;與SHR+DDW組比較,

3.4 滋腎瀉青湯方對大鼠前額葉多巴胺受體脫敏-復(fù)敏信號通路相關(guān)因子mRNA表達的影響

與正常組相比,模型組PP2A的mRNA表達有下調(diào)趨勢,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95 mRNA表達明顯降低(P<0.05),GRK-6的mRNA表達明顯增加(P<0.05);治療后,與模型組相比,利他林組和滋腎瀉青湯治療組有上調(diào)β-arrestin2、PSD-95、NCS-1、PP2A mRNA的表達趨勢或能顯著提高上述mRNA的表達(P<0.05),有下調(diào)GRK-6的mRNA表達的趨勢或能顯著下調(diào)其表達(P<0.05),且以利他林組和滋腎瀉青湯高劑量組療效為佳,見圖2。

注:WKY+DDW.正常對照組;SHR+DDW.模型組; SHR+MPH.利他林組;SHR+ZXT-L、M、H.滋腎瀉青湯低、中、高劑量組。 與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,

4 討論

ADHD患兒在學(xué)齡期往往存在學(xué)習(xí)困難、人際關(guān)系不佳等問題,若不經(jīng)正規(guī)持續(xù)合理的治療,癥狀可能會持續(xù)終身,導(dǎo)致成年后職業(yè)成就低,社會功能受到損害。循證醫(yī)學(xué)結(jié)果表明,經(jīng)過正確診斷及合理治療,該病往往可以取得較好的治療效果,從而改善學(xué)業(yè)、工作、社會功能等諸多問題。盡管目前ADHD的發(fā)病機制不明,但多巴胺系統(tǒng)功能的缺陷,特別是其對前額葉-紋狀體環(huán)路的調(diào)控異常,被認(rèn)為與ADHD的發(fā)病密切相關(guān)[7-9]。而前額葉皮質(zhì)的神經(jīng)功能與ADHD癥狀表現(xiàn)密切相關(guān),包括注意力集中、工作記憶和執(zhí)行功能等,故本實驗將前額葉皮質(zhì)作為研究部位,探討復(fù)方滋腎瀉青湯治療ADHD的潛在作用機制。

本實驗重點研究滋腎瀉青湯對SHR大鼠行為學(xué)及前額葉皮質(zhì)多巴胺受體脫敏-復(fù)敏信號通路的影響。脫敏即受體對激動劑刺激做出不反應(yīng)或反應(yīng)減低,包括同源性脫敏及異源性脫敏。同源性脫敏指激動劑引起的G蛋白偶聯(lián)受體與其相應(yīng)G蛋白的解偶聯(lián),因此使G蛋白偶聯(lián)受體失活,其過程與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GPCR kinase, GRK)、β-arrestins磷酸化受體密切相關(guān)[10-12];異源性脫敏指與該受體激動劑無關(guān)的脫敏,即該受體并未受到其選擇性激動劑刺激的情況下出現(xiàn)脫敏,其與細(xì)胞第二信使系統(tǒng)激酶的激活關(guān)系密切,如多巴胺D1受體是蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)的磷酸化位點[13-14];有研究表明神經(jīng)元鈣感應(yīng)蛋白(Neuronal calcium sensor-1,NCS-1)與D2受體脫敏機制存在關(guān)聯(lián)[15]。復(fù)敏指的是受體內(nèi)吞后被細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶去磷酸化,并被重新回收到膜上繼續(xù)行使其功能的過程,這一過程與細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)的功能相關(guān)[16];除了上述機制,新的研究表明突觸后致密物-95(Postsynaptic density-95,PSD-95)可提高多巴胺受體的復(fù)敏[17-18],說明多巴胺受體的表達受到脫敏、復(fù)敏雙向機制的調(diào)控。綜上,上述信號通路任何環(huán)節(jié)的異常均可通過脫敏-復(fù)敏的狀態(tài)影響多巴胺受體的功能。

實驗結(jié)果提示利他林及滋腎瀉青湯能改善大鼠行為學(xué)的表現(xiàn),減少其多動表現(xiàn);并能影響SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中多巴胺受體脫敏-復(fù)敏信號通路中相關(guān)調(diào)控因子的表達。與正常組相比,模型組中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A的蛋白及mRNA相關(guān)表達呈下調(diào)趨勢,而GRK-6的相關(guān)表達則被上調(diào)。說明較正常組,模型組多巴胺受體影響復(fù)敏的相關(guān)因子表達減弱,而影響脫敏的相關(guān)因子有增強表達,提示脫敏發(fā)揮的效應(yīng)可能強于復(fù)敏,從而影響了多巴胺受體的功能。經(jīng)藥物干預(yù)后,藥物組能上調(diào)大鼠前額葉皮質(zhì)中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A相關(guān)表達的同時能下調(diào)GRK-6的表達,提示藥物有增強受體復(fù)敏、減少脫敏的干預(yù)作用。綜合分析實驗結(jié)果后,推測滋腎瀉青湯作用機制可能與抑制多巴胺受體脫敏、促進復(fù)敏有關(guān),進而影響多巴胺受體的功能,達到改善行為學(xué)表現(xiàn)的目的。