劉歡歡,張婷,王敏,于銀萍,蘇聯(lián)麟,季德,陸兔林,李林

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心,江蘇 南京 210023)

當歸為傘形科植物當歸AngeliaSinensis(Oliv.) Diels的干燥根,味甘,性溫,歸心、肝、脾經(jīng)，具有補血活血、祛瘀生新的功效,被醫(yī)家譽為“婦科要藥”?！吨袊幍洹?020年版主要利用其中的阿魏酸和揮發(fā)油含量測定對其進行質(zhì)量評價[1],而當歸單一化學成分的含量高低并不能直接指征當歸飲片補血活血的藥效優(yōu)劣,因此該方法不能完全反映當歸質(zhì)量[2-4]。

目前,中藥及其飲片多以有限個成分的定性、定量分析來控制其質(zhì)量優(yōu)劣,部分品種甚至沒有含量測定項,因此化學測定不能有效表征其藥效水平,較難滿足現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展需求。如常用消食藥雞內(nèi)金,《中國藥典》2020年版對其質(zhì)量評價僅限于性狀、檢查等常規(guī)的理化檢測[1],與其關(guān)鍵生物活性相關(guān)性不高,難以準確反映其臨床功效。黃偉等[5]建立了一種基于胃蛋白酶活性的雞內(nèi)金促消食效價測定法,能夠直觀反映雞內(nèi)金消食化積的臨床功效,也為神曲、麥芽等消食類中藥質(zhì)量控制提供參考。因此,為更好保障中藥飲片臨床使用的安全有效,有必要在現(xiàn)有化學測定的基礎(chǔ)上增加生物活性測定,以綜合評價其質(zhì)量。

諸多研究顯示,當歸具有補血功效,主治血虛之癥,可以有效改善貧血,其作用機制主要是促進造血祖細胞增殖,提高血紅蛋白水平[6-10]。本實驗擬結(jié)合血紅蛋白檢測技術(shù),從補血活性層面探索建立當歸飲片生物效價方法,從而在化學測定的基礎(chǔ)上補充藥效檢定,以期完善當歸現(xiàn)行質(zhì)量標準體系,并為其他補血類中藥生物活性測定及其質(zhì)量控制提供新思路[11-13]。

1 材料

1.1 儀器

INC0108型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert);Synergy H1型多功能酶標儀(美國Biotek);FA1104N型電子天平(上海菁海儀器有限公司);Eclipse 80i型倒置顯微鏡(上海衡浩儀器有限公司)。

1.2 試劑

人類髓性白血病K562細胞、RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(南京貝佳生物科技有限公司);胎牛血清(上海李記生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);二甲基亞砜(DMSO,南京翼飛雪生物科技有限公司);氯化血紅素(Hemin,上海源葉生物科技有限公司,5 g·瓶-1,純度98%);過氧化氫(H2O2,國藥集團化學試劑有限公司,批號:20160325,純度30%);乙酸(上海申博化工有限公司,批號:1801101)。

1.3 藥材與飲片

1～15號當歸飲片購自甘肅、河北等不同地區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定,均為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels干燥根的加工品。分別取批號為1804002、18010261、20180101的3批生當歸飲片,按照《中國藥典》2020年版收載的炮制工藝加工制備得到酒當歸飲片[14],按照《甘肅省中藏藥材炮制規(guī)范》收載的炮制方法制備得到土炒當歸飲片[15],編為16～21號。分別取批號為2018-03-09、2018-03-20、2018-03-08的3批當歸藥材,加工制備得到當歸頭、當歸身、當歸須飲片,編為22～30號(表1)。

表1 當歸飲片樣品采集情況表

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取100 g當歸飲片樣品,加入8倍量水,浸泡30 min后煎煮3次,每次3 h,合并煎液并濃縮至相同體積,凍干后即為當歸飲片提取物。干燥提取物用RPMI 1640培養(yǎng)基溶解,制成供試品溶液,置冰箱冷藏室(0～4 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標準品溶液的制備

取65.2 mg Hemin,以10 mL的RPMI 1640培養(yǎng)基溶解,所得Hemin溶液質(zhì)量濃度為1×104μmol·L-1,實驗中稀釋至相應(yīng)工作濃度,作為本方法的標準品。

2.3 聯(lián)苯胺染液的制備

分別配制0.5%、10%的乙酸溶液和1%的H2O2溶液,取聯(lián)苯胺20 mg,用10 mL的0.5%乙酸溶液溶解,得到質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的聯(lián)苯胺溶液。

2.4 細胞培養(yǎng)

選用人類髓性白血病K562細胞系,使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每2～3 d傳代1次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.5 加藥培養(yǎng)與檢測

調(diào)整細胞濃度并接種于6孔細胞培養(yǎng)板,24 h后加藥培養(yǎng);取樣品溶液,以0.5劑距配置多個劑量組,按照表2加入對應(yīng)藥物并充分混勻,共培養(yǎng)4 d。為維持細胞生長和分化所必要的營養(yǎng),每2.5 d換液1次。反應(yīng)完成后,按照1 000 r·min-1離心10 min收集細胞,每組加入60 μL聯(lián)苯胺溶液和60 μL的H2O2溶液,避光反應(yīng)30 min,加入600 μL的10%乙酸溶液,混勻后于570 nm處測定吸光值(ABS)。每組平行3孔,每孔重復(fù)測定2次,取其平均值。血紅蛋白含量(相對值)按照公式(1)計算:

(1)

表2 加樣方法與加樣量

2.6 供試品濃度選擇和效價測定

實驗前期,對Hemin和當歸飲片提取物進行大范圍的濃度篩選,分析得到標準品和供試品不同濃度對血紅蛋白含量(相對值)的影響,選擇效應(yīng)顯著且量效相關(guān)的濃度范圍,在此范圍內(nèi)探究并計算當歸飲片補血效價。

本實驗以Hemin為標準品,設(shè)定供試品當歸飲片估示效價A為100 U·mg-1。按照生物檢定量反應(yīng)平行線測定法進行實驗設(shè)計,標準品組設(shè)置高、中、低3個劑量組ds1、ds2、ds3分別為0.326、0.652、1.304 U·mL-1，實驗組設(shè)置高、中、低3個劑量組dt1、dt2、dt3分別為0.024、0.048、0.096 U·mL-1(表3),操作步驟同2.5項下。分析方法參考《中國藥典》2020年版附錄1431生物檢定統(tǒng)計法[16],按照公式(2)進行計算。

(2)

注：常數(shù)2.51是效價計算所需數(shù)值,根據(jù)《中國藥典》2020年版所收載的1431生物檢定統(tǒng)計法,本研究選用量反應(yīng)平行線測定法,設(shè)置高低劑量比為1∶0.5,由此確定效價計算所需數(shù)值為2.51。

表3 檢測結(jié)果表

3 結(jié)果

3.1 當歸補血活性檢測和量效關(guān)系考察

標準品Hemin和當歸樣品的量效曲線圖形狀基本一致,低濃度時無明顯促進血紅蛋白生成作用,隨著樣品濃度增高，促進作用增強,但高濃度時由于藥物產(chǎn)生毒性作用導致血紅蛋白生成量減少。如圖1所示,量效曲線圖基本符合“S”曲線趨勢,提示當歸與Hemin的補血作用趨勢在一定范圍內(nèi)基本相同。

圖1 Hemin(A)和當歸飲片(B)補血活性量效曲線圖

3.2 線性關(guān)系考察

分別以標準品Hemin和當歸樣品對數(shù)劑量考察線性關(guān)系,結(jié)果如下:Hemin線性方程為:y=0.332 6lnx+0.511 0,R2=0.991 4,在5.18～40.00 μmol·L-1范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系(圖2A);當歸樣品飲片線性方程為:y=0.452 9lnx+1.744 5,R2=0.990 7,在0.39～3.00 μg·mL-1范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系(圖2B)。說明此反應(yīng)類型在一定范圍內(nèi)適用生物檢定中的量反應(yīng)平行線測定法進行效價測定。

圖2 Hemin(A)和當歸飲片(B)補血活性線性考察

3.3 效價計算

3.3.1 可靠性檢驗 當歸樣品可靠性檢驗結(jié)果分析:試品間差異不顯著(P>0.05),說明供試品和標準品效價無明顯差別;回歸項差異顯著(P<0.01),說明隨著樣品質(zhì)量濃度的降低,血紅蛋白含量(相對值)有規(guī)律地降低;偏離平行線差異無顯著意義(P>0.05),說明供試品和標準品呈平行直線關(guān)系(表4)。綜上所述,所測結(jié)果有效。

表4 當歸樣品生物效價(3·3)法可靠性測驗結(jié)果

3.3.2 效價與可信限 根據(jù)《中國藥典》2020年版所載的量反應(yīng)平行線測定法,結(jié)合表3與公式2所示進行計算,得到當歸樣品測得效價PT=1 358.37 U·mg-1,效價可信限率FL=6.37%,即表示該樣品效價在1 285.625～1 458.766 U·mg-1范圍內(nèi)是可信的。

3.4 方法學考察

3.4.1 精密度 取相同質(zhì)量濃度的當歸樣品的供試品溶液6份,檢測得到血紅蛋白含量(相對值)分別為110.57%、111.26%、109.48%、112.96%、112.47%、111.35%,RSD值為1.26%,表明儀器精密度良好。

3.4.2 重復(fù)性 取當歸樣品的干燥提取物5份,分別按照1.2項下的制備和檢測方法計算補血效價,5次結(jié)果分別為1 427.754、1 292.922、1 392.497、1 463.447、1 358.423 U·mg-1,RSD值為4.73%,表明該方法具有較好的重復(fù)性。

3.5 樣品檢測結(jié)果與分析

1～15號當歸飲片購自甘肅、河北等不同地區(qū)代表性企業(yè),測得效價差別明顯,表明該方法可以有效區(qū)分不同來源、不同批次的當歸飲片(圖3A)。13～15號生當歸飲片炮制得到16～18號酒當歸飲片以及19～21號土炒當歸飲片;測得13～21號當歸不同炮制飲片效價差別明顯,表明該方法可以對相同來源、不同炮制方法所得飲片進行區(qū)分。中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論認為生當歸質(zhì)潤,具有補血、調(diào)經(jīng)、潤腸通便的功能;酒當歸辛溫,有增強活血散瘀之功;土炒當歸苦溫,健脾和血，補血而不滑腸。本方法檢測結(jié)果顯示,不同炮制品的補血效應(yīng)排序為:生當歸>土炒當歸>酒當歸(圖3B),這與酒當歸主活血、土炒當歸溫和入藥的傳統(tǒng)理論是相符合的。22～30號當歸飲片分別為當歸頭、當歸身、當歸須各3批,以上當歸不同入藥部位測得效價差別明顯,表明該方法可以對相同來源、不同入藥部位進行區(qū)分;此外,本方法檢測結(jié)果顯示,不同入藥部位的補血效應(yīng)排序為:當歸身>當歸頭>當歸須(圖3C),這與“頭止血,身和血,梢破血”的傳統(tǒng)理論是相符合的。

4 討論

中藥的化學成分復(fù)雜、藥理作用廣泛,僅對少數(shù)成分進行質(zhì)控不能完全反映其質(zhì)量和臨床療效。在化學分析的基礎(chǔ)上增加生物活性測定,全面評價飲片質(zhì)量,是完善中藥質(zhì)量標準體系的有益補充,也是保證臨床用藥安全有效的重要方法。本文以當歸為研究對象,探索性地對其補血藥效相關(guān)的生物活性檢定方法進行研究。

K562細胞源于一位慢性髓系白血病患者的腹水,是此類疾病中第一個實現(xiàn)人工培養(yǎng)的細胞[17]。K562胞內(nèi)蛋白表達與紅系祖細胞相近,可誘導其定向紅系分化[18-20],相對于造血干細胞,該細胞不僅滿足體外研究紅系分化的需要,又具有易獲得易培養(yǎng)的優(yōu)勢,是本文體外補血活性測定方法的最優(yōu)選擇。紅系分化是指從造血干細胞到最終脫核釋放成熟紅細胞的過程,是當歸補血功效研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但存在分化周期較長、晚期細胞識別困難等問題;而血紅蛋白產(chǎn)生于紅系分化過程,其含量升降可體現(xiàn)紅細胞水平變化及其臨床意義[21]。研究表明,當歸補血的作用機制主要是促進造血干細胞增殖,提高血紅蛋白水平[22-24];而Hemin作為生物補鐵劑,可從外源大幅提高血紅蛋白合成原料,從而誘導K562細胞向紅系分化[25]。綜上,本研究結(jié)合血紅蛋白檢測技術(shù),以當歸飲片為供試品,以Hemin為標準品,從補血活性層面探索建立當歸飲片生物效價方法,以期量化當歸飲片的補血水平。

圖3 不同批次(A)、炮制方法(B)、入藥部位(C) 當歸飲片的補血效價

實驗表明,本方法的開發(fā)過程及結(jié)果均符合《中國藥典》2020年版所載的生物活性測定指導原則和生物檢定統(tǒng)計法的各項要求,將此方法應(yīng)用于不同來源、炮制方法、入藥部位的當歸飲片,可以得到穩(wěn)定可靠的補血效價。其中,生、土、酒當歸,當歸身、頭、尾的補血效價排序結(jié)果,也在一定程度上證明了傳統(tǒng)中醫(yī)用藥的科學性。綜上,本研究將與飲片功效高度相關(guān)的補血生物效價方法引入當歸飲片質(zhì)量評價中,從而改善了目前當歸及其他大多飲片的質(zhì)量控制方法依賴成分、忽視藥效的現(xiàn)狀。這為建立基于補血生物活性的當歸飲片質(zhì)量標準提供了試驗依據(jù),為進一步規(guī)范當歸飲片的炮制工藝和臨床應(yīng)用提供了理論指導,同時也為完善其他補血類中藥的生物檢定和質(zhì)量標準提供了參考。