吉春亮,蘇艷,張金戈,盛先杰,張健榕,單晨嘯

(1.句容市第四人民醫(yī)院藥劑科,江蘇 鎮(zhèn)江 212008;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

前胡Peucedaniradix為傘形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根。其性微寒,味苦、辛[1]。作為疏風(fēng)清熱，止咳祛痰的常用中藥之一,近年來關(guān)于前胡化學(xué)成分分析的文獻(xiàn)報(bào)道提示,前胡中的多種香豆素類化合物,可能是其解熱祛痰，治療感冒、咳嗽、支氣管炎及癤腫等病癥的物質(zhì)基礎(chǔ)[2-3]。前胡中的香豆素主要包括簡單香豆素、角型吡喃香豆素和呋喃香豆素3種,通?？梢酝ㄟ^測定香豆素類的含量來評(píng)價(jià)前胡的質(zhì)量[4-5]?！吨袊幍洹芬园谆ㄇ昂姿丶鞍谆ㄇ昂宜貫槠浜繙y定項(xiàng)下的指標(biāo)性成分,規(guī)定前胡含白花前胡甲素(C21H22O7)不得少于0.90%,含白花前胡乙素(C24H26O7)不得少于0.24%[6]。另外有研究表明,白花前胡甲素及白花前胡乙素具有較好的抗炎作用,可通過抑制NF-κB、STAT3等信號(hào)通路控制炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7-9]。

雖然目前關(guān)于前胡的化學(xué)活性成分研究較多,但未見全面分析其進(jìn)入體內(nèi)的原型成分及代謝物,特別是被吸收進(jìn)入肺組織中的活性成分及代謝物的研究報(bào)道較少[10-11]。因此,有必要對(duì)前胡的化學(xué)成分及體內(nèi)活性成分進(jìn)行全面研究,進(jìn)而闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析表征前胡的化學(xué)成分,通過與混合對(duì)照品的質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)對(duì)比化合物的質(zhì)荷比、相對(duì)保留時(shí)間、二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解方式,推測其中的化學(xué)成分。再根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥后入血及入肺的原型及代謝情況,推測前胡的體內(nèi)代謝過程,為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)甚至治病機(jī)制等研究提供依據(jù)[12-13]。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司),LC-20A快速液相儀(日本Shimadzu公司),Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司),MS3.Digital旋渦振蕩器(IKA公司),Speed Vac離心濃縮儀(美國Thermo Scientific公司),Neofuhe23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司),ER-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SK8200H數(shù)控超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司),BS214D型萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試劑

乙腈、甲醇(色譜純,德國默克公司),甲酸(色譜純,阿拉丁試劑有限公司),75%乙醇(分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

1.3 藥材

前胡(批號(hào):20220511)購自亳州市紫銳藥業(yè)有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授鑒定為傘形科白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根。白花前胡甲素(批號(hào):JOT-10487)、白花前胡乙素(批號(hào):JOT-10486)購自成都普菲德生物科技有限公司,白花前胡素 E(批號(hào):B-044-181216)購自成都瑞芬思生物科技有限公司,以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。

2 方法

2.1 樣品制備

供試品溶液的制備:取前胡(打粉后過3號(hào)篩)約100 g,精密稱定,加入1 L 75%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮至100 mL(濃縮液所含生藥量為1 g·mL-1),放冷,取200 μL前胡提取液于1.5 mL離心管中,置于冷凍離心機(jī)中4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min后,小心吸出所有上清液于1.5 mL離心管中,溶劑完全揮干后,加入200 μL甲醇于超聲波清洗儀中超聲30 min至完全溶解,隨后再12 000 r·min-1離心10 min,取部分上清液進(jìn)樣(進(jìn)樣液中含生藥量為1 g·mL-1)。

對(duì)照品溶液的制備:取白花前胡甲素對(duì)照品、白花前胡乙素和白花前胡素E對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇溶解,定容。進(jìn)一步稀釋制成每1 mL含10 μg的混合對(duì)照品溶液,即得。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 給藥方案 雄性SD大鼠6只,體質(zhì)量180～220 g,由杭州醫(yī)學(xué)院提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002。所有動(dòng)物飼養(yǎng)均按照美國國家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi),按照飼養(yǎng)要求先自由飲食和飲水,并且自動(dòng)開關(guān)燈以模擬正常晝夜交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將6只大鼠隨機(jī)分為2組(空白組和前胡給藥組，n=3),給藥組給予前胡提取液,按26 g·kg-1的劑量給藥,每日1次,每次2 mL,空白組灌胃等體積的生理鹽水,連續(xù)給藥7 d后取材。

2.2.2 生物樣品收集與處理 血漿樣品收集與處理:在最后1次給藥后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1、2、4 h)，通過各組大鼠眼眶取血的方式來收集血樣,取出后置于裝有抗凝血?jiǎng)┑碾x心管中并輕搖混勻,于4 ℃、5 000 r·min-1冷凍離心10 min,吸取血漿用于后續(xù)成分分析。吸取500 μL血漿樣品,加入3倍體積的乙腈沉淀樣品,取上清完全揮干后,加入200 μL甲醇超聲復(fù)溶,隨后12 000 r·min-1,離心10 min后取上清進(jìn)樣。

肺組織樣品收集與處理:分別于最后1次給藥后1、2、4 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,取肺組織。分別取對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的大鼠0.2 g肺組織加入2 mL EP管中,加入0.8 mL超純水后勻漿,將勻漿液全部轉(zhuǎn)移至5 mL EP管后,加入3倍體積的乙腈,充分振蕩,于5 000 r·min-1離心10 min后取出上清至1.5 mL離心管中,完全揮干溶劑后,加入200 μL甲醇超聲復(fù)溶,12 000 r·min-1,離心10 min后取上清液留待進(jìn)樣。

2.3 色譜條件

色譜柱:Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18(3.0 mm×100 mm, 2.2 μm)色譜柱,柱溫:35 ℃,流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈。流速為0.3 mL·min-1,進(jìn)樣體積5 μL。梯度洗脫程序:0～3 min,10%B;3～20 min,25%B;20～30 min,40%B;30～41 min,60%B;41～55 min,85%B;55～57 min,95%B;57～58.1 min,10%B;58.1～63 min,10%B。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),離子源溫度(TEM)550 ℃,氣簾氣(CUR)40 psi,霧化氣(GS1)55 psi,輔助加熱氣(GS2)55 psi,離子源噴霧電壓(IS)5 500 V,碰撞電壓(CE)10 V,去簇電壓(DP)100 V,正離子模式下為全掃模式,掃描范圍為m/z50～1 500。

2.5 數(shù)據(jù)處理

通過查閱國內(nèi)外關(guān)于前胡的文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫建立包含化合物名稱、分子量、分子式、結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜和紫外信息的前胡化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫,將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView SoftwareTM(ABSciex)進(jìn)行分析,從原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中篩選目標(biāo)化合物,獲取各化合物的保留時(shí)間、精確分子量等信息。按偏差小于10 ppm、根據(jù)化合物的二級(jí)碎片信息和檢索的化合物裂解過程中產(chǎn)生的碎片信息,分析總結(jié)主要類型化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。

3 結(jié)果

正離子模式下相關(guān)樣品顯示出更為豐富的質(zhì)譜信息,因此本研究選擇正離子模式所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析[14]。解析出前胡中所含化合物的質(zhì)譜信息如表1所示,結(jié)果共鑒定出54個(gè)化合物,包括52個(gè)香豆素類、1個(gè)萜烯類和1個(gè)酚類化合物。其中,白花前胡甲素、白花前胡素E和白花前胡乙素3個(gè)化合物通過與對(duì)照品分別對(duì)比分子量、保留時(shí)間和二級(jí)碎片等質(zhì)譜信息得到進(jìn)一步確認(rèn)。圖1為正離子模式下的前胡提取液及混合對(duì)照品總離子流圖。

表1 前胡體外化學(xué)成分鑒定

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

圖1 正離子模式下的前胡提取液(A)及混合對(duì)照品(B)的總離子流圖

3.1 前胡體外成分鑒定

在前胡提取物中共推測出52個(gè)香豆素類成分[15]。香豆素類化合物的基本母核是苯駢α-吡喃酮,該母核的一般特征是芳環(huán)上連接有多個(gè)氧原子和羥基,所以在堿性條件下可以開環(huán)。其分子量較小,在正離子模式下具有較強(qiáng)的分子離子峰,其質(zhì)譜主要發(fā)生中性小分子碎片丟失,出現(xiàn)一系列連續(xù)失去一分子羰基、羥基或水、甲基或甲氧基以及烷基鏈的碎片離子峰,其中環(huán)上的羰基比酯鍵中的更易失去[16]。圖2為前胡中典型成分的提取離子流圖及裂解規(guī)律圖。

例如,正離子模式下化合物3(RT=2.432 min,C15H16O8)(圖2A)的母離子在m/z325.091 8 [M+H]+,其產(chǎn)物離子分別為m/z163.039 8 [M+H-Glc]+、m/z119.051 5 [M+H-CO2]+,分別為依次脫糖基、掉落1分子CO2形成。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測化合物3為茵芋苷[17-18]?；衔?2(RT=9.211 min,C20H26O10)(圖2B)母離子在m/z427.158 8 [M+H]+,二級(jí)碎片離子分別為m/z247.097 5 [M+H-Glc]+、m/z229.086 9 [M+H-Glc-H2O]+、m/z175.040 3 [M+H-Glc-H2O-C4H6]+,分別為依次脫糖基、掉落1分子H2O以及小分子C4H6形成。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測化合物12為Praeroside Ⅵ[19]。

正離子模式下,化合物14(RT=11.019 min,C20H24O9)(圖2C)母離子在m/z409.150 1 [M+H]+,產(chǎn)物離子分別為m/z247.096 6 [M+H-Glc]+、m/z229.086 2 [M+H-Glc-H2O]+、m/z187.039 2 [M+H-Glc-H2O-C3H6]+、m/z175.039 4 [M+H-Glc-H2O-C4H6]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測化合物14為紫花前胡苷[20]。化合物32(RT=29.532 min,C18H18O7)(圖2D)母離子為m/z369.094 5 [M+Na]+,產(chǎn)物離子為m/z287.092 5 [M+H-C2H3O2]+、m/z245.081 6 [M+H-C2H3O2-C2H2O]+、m/z227.070 1 [M+H-C2H3O2-C2H2O-H2O]+和m/z175.040 3 [M+H-C2H3O2-C2H2O-H2O-C4H4]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測化合物32為前胡香豆素D。

圖2 前胡中典型成分的提取離子流圖及裂解規(guī)律圖

另外,正離子模式下化合物47(RT=37.677 min,C21H24O7)母離子為m/z411.141 2 [M+Na]+,產(chǎn)物離子分別為m/z351.121 7 [M+Na-CH3COOH]+、m/z329.138 3 [M-CH3COOH]+、m/z245.081 5 [M-CH3COOH-CH3CH2CH(CH3)CO]+、m/z227.070 8 [M-CH3COOH-CH3CH2CH(CH3)COOH]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測化合物47為白花前胡香豆精Ⅰ?；衔?0(RT=42.284 min,C24H26O7)母離子為m/z449.156 8 [M+Na]+,產(chǎn)物離子分別為m/z349.105 4 [M+Na-CH3CH=C(CH3)COOH]+、m/z327.120 4 [M-CH3CH=C(CH3)COOH]+、m/z227.070 7 [M-2CH3CH=C(CH3)COOH]+和m/z227.070 8 [M-CH3COOH-CH3CH2CH(CH3)COOH]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道以及標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜信息,表明化合物50為白花前胡乙素。

3.2 前胡體內(nèi)成分鑒定

大鼠連續(xù)給藥前胡提取物7 d后的血漿和肺部組織樣品中共檢測到22個(gè)原型成分,包括1個(gè)酚類化合物和21個(gè)香豆素類化合物等。入血的原型成分有21個(gè),分別為4-甲氧基香豆素(P8)、(+)-白花前胡醇(P11)、(-)-白花前胡醇(P13)、前胡香豆素G(P15)、蕓香霉素(P17)、紫花前胡苷元(P19)、5-甲氧基香豆素(P22)、九里香內(nèi)酯(P25)、蛇床子素(P28)、異氧化前胡素(P29)、異補(bǔ)骨脂素(P33)、前胡香豆素A(P34)、前胡香豆素E(P39)、白花前胡甲素(P43)、氧化前胡素(P45)、白花前胡香豆精 Ⅱ(P46)、白花前胡香豆精Ⅰ(P47)、3,5-二叔丁基苯酚(P48)、白花前胡乙素(P50)、白花前胡丙素(P51)、白花前胡素E(P52),具體的信息見表2。前胡給藥后典型入血原型成分的提取離子流圖及裂解規(guī)律如圖3所示。

3.2.1 原型成分的鑒定 正離子模式下,P28(RT=25.025 min)(圖3A)母離子為m/z245.117 3 [M+H]+,產(chǎn)物離子分別為m/z227.070 7 [M+H-H2O]+、m/z189.021 7 [M+H-C4H8]+、m/z175.039 6 [M+H-C5H10]+、m/z147.044 7 [M+H-C5H10-CO]+和m/z131.050 7 [M+H-C4H8-CH2O-CO]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為蛇床子素[21]。P52(RT=43.110 min)(圖3B)母離子為m/z451.173 0 [M+Na]+,產(chǎn)物離子分別為m/z245.080 8 [M+H-C10H15O3]+、m/z227.071 1 [M+H-C10H15O3-H2O]+、m/z175.039 8 [M+H-C10H15O3-H2O-C5H10]+,分別為依次3',4'雙水解、脫水、開環(huán)掉落C5H10形成。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道和對(duì)照品對(duì)比,推測該化合物為白花前胡素E。

圖3 典型入血原型成分的提取離子流圖及裂解規(guī)律

3.2.2 代謝物的鑒定 本實(shí)驗(yàn)在前胡中共推測出26個(gè)代謝成分。其中在血中找到26個(gè)代謝物,肺部組織中找到9個(gè)代謝物。前胡提取物給藥后典型入血及肺組織中的代謝成分的裂解情況如圖4所示。結(jié)果提示前胡中的香豆素類成分在體內(nèi)主要以氧化、葡萄糖醛酸化、脫異戊烯基化以及水解等方式代謝[22]。

例如,正離子模式下M3(RT=7.040 min,C20H22O11)(圖4A)母離子為m/z439.123 7 [M+H]+,產(chǎn)物離子分別為m/z263.091 9 [M+H-Glu]+、m/z245.082 0 [M+H-Glu-H2O]+、m/z191.034 0 [M+H-C5H10]+、m/z147.044 7 [M+H-C5H10-CO]+和m/z163.037 9 [M+H-C4H8-CH2O-CO]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為蕓香霉素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

正離子模式下,化合物38(RT=33.502 min,C16H14O4)母離子為m/z271.097 4 [M+H]+,在m/z203.034 3 [M+H-C5H8]+、m/z175.039 4 [M+H-C5H8-CO]+、m/z147.045 2 [M+H-C5H8-2CO]+、m/z131.050 4 [M+H-C5H8-CO2-CO]+產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為歐前胡素。M13(RT=19.542 min,C11H6O4)母離子為m/z203.032 8 [M+H]+,其準(zhǔn)分子離子峰比歐前胡素(C38)的小68 Da,推斷其為可能為C38脫異戊烯基化后的產(chǎn)物。M13分別為m/z175.033 0 [M+H-CO]+和m/z147.045 8 [M+H-2CO]+產(chǎn)生二級(jí)碎片離子。根據(jù)其連續(xù)丟失 CO 特征的碎片裂解方式及相對(duì)分子質(zhì)量,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中碎片信息,推測該化合物為歐前胡素的脫異戊烯基產(chǎn)物花椒毒酚。M16(RT=25.960 min,C16H14O6)在正離子模式下準(zhǔn)分子離子為m/z303.087 4 [M+H]+,其準(zhǔn)分子離子峰比歐前胡素(C38)的大32 Da,推測其為C38的雙氧化產(chǎn)物。二級(jí)碎片離子分別為m/z203.033 1 [M+H-CO2-C4H8]+、m/z147.043 5 [M+H-CO2-C4H8-2CO]+、m/z119.088 9 [M+H-CO2-C4H8-3CO]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為歐前胡素雙氧化產(chǎn)物[23-24]。

圖4 大鼠給藥前胡提取物后血漿中代謝成分的裂解規(guī)律圖

另外,正離子模式下P43(RT=35.225 min,C21H22O7)母離子為m/z409.125 7 [M+Na]+,產(chǎn)物離子分別為m/z245.082 6 [M+H-C7H10O3]+、m/z227.071 3 [M+H-C7H10O3-H2O]+、m/z175.039 1 [M+H-C7H10O3-H2O-C4H4]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為白花前胡甲素[22]。M6(RT=13.740 min,C14H14O5)(圖4B)母離子為m/z263.091 4 [M+H]+,其分子量比P43小124 Da,二級(jí)碎片離子分別為m/z245.080 8 [M+H-H2O]+、m/z203.069 9 [M+H-C2H4O2]+、m/z175.039 2 [M+H-C4H8O2]+,分別為依次脫水、3',4'雙水解、開環(huán)掉落C2H4形成。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為白花前胡甲素雙水解產(chǎn)物。M12(RT=17.690 min,C16H16O6)(圖4C)母離子為m/z305.102 9 [M+H]+,二級(jí)碎片離子分別為m/z203.034 8 [M+H-C4H6O3]+、m/z175.033 9 [M+H-C5H6O3]+、m/z147.043 5 [M+H-C5H6O3-CO]+。根據(jù)此裂解方式及其產(chǎn)生的碎片離子信息,再結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道,推測該化合物為白花前胡甲素單水解產(chǎn)物[25-26]，見表2。

表2 大鼠灌胃前胡提取物后的體內(nèi)原型及代謝物信息

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

4 討論

祛痰止咳是前胡最具特色的傳統(tǒng)功效之一[27]。既往的植物化學(xué)研究表明,前胡中的香豆素類化合物具有多種藥理活性,這也導(dǎo)致其化學(xué)成分的研究主要集中在香豆素類化合物上。前胡中香豆素類化合物的酯鍵易水解形成凱琳內(nèi)酯,具有較好的鎮(zhèn)咳祛痰和抗炎活性。例如,白花前胡丙素和紫花前胡苷具有祛痰作用;白花前胡甲素、白花前胡素E、白花前胡丁素以及白花前胡丙素等為NF-κB以及STAT-3的雙通路抑制劑,可顯著降低TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá),在體內(nèi)外均顯示出一定的抗炎效果[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)前胡提取液中的化學(xué)成分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、全面的定性分析,根據(jù)化合物的二級(jí)碎片信息和檢索的化合物裂解過程中產(chǎn)生的碎片信息,分析總結(jié)典型化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。從前胡中鑒定出54個(gè)化學(xué)成分,其中香豆素類成分種類最多,占比最大。大鼠連續(xù)給藥前胡提取物7 d后的血漿和肺部組織樣品中共檢測到22個(gè)原型成分,其中有21個(gè)為香豆素類化合物。從前胡中鑒定出的化學(xué)成分可能為相關(guān)藥理作用的活性成分,但是如何將化學(xué)成分與藥效相關(guān)聯(lián)以確定前胡藥效物質(zhì)是今后的一個(gè)研究方向。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入闡明前胡藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、建立更為科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系用于前胡的質(zhì)量和安全評(píng)價(jià),規(guī)范藥材市場,保證臨床合理和精準(zhǔn)用藥提供了重要參考。