潘斐，朱逸凡，嚴一凡，杜姍姍，李莎，徐虹，羅正山,3*

1(南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京，211816)2(南京工業(yè)大學 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京，211816)3(南京軒凱生物科技股份有限公司，江蘇 南京，211816)

血紅素作為一種含鐵卟啉化合物，廣泛存在于各種生物體中[1]，其對細胞的轉錄、翻譯和蛋白質后修飾等起著一定的調控作用[2-3]。這些生理功能使其在食品、醫(yī)學診斷等領域具有廣泛的應用前景[4]。隨著市場需求不斷擴大，當前通過動植物提取法獲得的血紅素已無法滿足日益增加的應用需求。此外，動植物提取法存在原料來源有限且產品質量不穩(wěn)定等缺點。利用合成生物學技術理性設計細胞代謝網絡，以廉價生物質為底物發(fā)酵生產血紅素是近來的研究熱點，且該方法具有價格低廉、產物純度高和環(huán)境友好等優(yōu)勢，被寄予厚望。

近年來，隨著合成生物學的快速發(fā)展，研究人員已成功實現(xiàn)多種生物基化學品的工業(yè)化生產，如丙酮酸、聚谷氨酸等[5-7]。在血紅素的生物合成方面，研究人員通過優(yōu)化C4和C5途徑來合成血紅素取得了一定的成果，但是存在一些不足。KWON等[8]通過在大腸桿菌中構建C4途徑以及優(yōu)化胞內代謝流，實現(xiàn)了血紅素的合成，但發(fā)現(xiàn)C4途徑合成血紅素的效率非常低。此外，ZHAO等[9]在大腸桿菌中通過理性優(yōu)化C5合成途徑、調控血紅素合成的下游途徑、補加合成前體等策略，顯著改善了血紅素的積累，并發(fā)現(xiàn)C5途徑合成血紅素的效率明顯高于C4途徑，但獲得血紅素合成的底物轉化率僅為0.000 138 mol/mol(血紅素/葡萄糖)，遠低于理論轉化率。因此，如何提升C5途徑合成血紅素的底物轉化率是下一步研究的重點。與大多數(shù)天然產物合成途徑一樣，血紅素的生物合成途徑非常長且涉及到28個途徑基因(從葡萄糖到合成血紅素)。目前，幾乎所有血紅素生物合成研究都是采用多個質粒在一個宿主細胞中表達合成途徑基因的策略，這會對菌株的生長產生不利影響。為避免在單一宿主細胞中設計天然產物合成途徑造成的胞內代謝流紊亂和細胞代謝壓力增高等問題，共培養(yǎng)體系設計策略被提出并用于構建細胞生長與產物合成平衡、無有毒中間代謝產物累積、生產效率顯著提高的細胞工廠，取得了令人矚目的成績[10-11]。例如，ZHOU等[12]將紫杉醇前體的合成途徑分為2個模塊，分別構建在釀酒酵母和大腸桿菌中，通過進一步的途徑優(yōu)化實現(xiàn)了紫杉醇前體的高效合成。

本課題組前期研究獲得了1株谷氨酸非依賴性高產聚谷氨酸的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) NX-2S154，該菌株具有較高的三羧酸循環(huán)代謝通量和谷氨酸合成代謝流。此外，對該菌株的代謝途徑進行相應的設計和優(yōu)化后，實現(xiàn)了其利用葡萄糖等碳源高效合成聚谷氨酸等產品[13-15]。B.amyloliquefaciensNX-2S154菌株的這些特點為理性設計C5途徑合成血紅素的研究提供了一個難得的底盤菌株。本研究以具有高谷氨酸合成代謝通量的解淀粉芽孢桿菌NX-2S154和具有異源酶高表達能力的大腸桿菌BL21為出發(fā)菌株，通過將血紅素的合成途徑分為前體5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)合成模塊和5-ALA合成血紅素模塊，分別理性設計在解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌中構建血紅素生物合成的共培養(yǎng)體系，并對獲得的共培養(yǎng)體系進行進一步的代謝途徑設計和過程優(yōu)化實現(xiàn)了血紅素的合成，以期提高菌株發(fā)酵的底物轉化率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌NX-2S154以及大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)為本實驗室保藏菌株，大腸桿菌GM2163用于質粒的去甲基化。本研究所用菌株與質粒詳見表1，質粒構建所有引物詳見表2。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

表2 本研究所使用引物Table 2 Primers used in the study

續(xù)表2

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、壯觀霉素，上海麥克林生化科技有限公司；基因組抽提試劑盒、2×Phanta Max Master Mix、One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；谷氨酸檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；酵母粉、蛋白胨，OXOID公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉10，蛋白胨5，(NH4)2SO415，Na2HPO4·12H2O 10,KH2PO42,FeSO4·7H2O 0.05。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵方法

5-ALA搖瓶發(fā)酵：發(fā)酵種子液培養(yǎng)12 h后以1%(體積分數(shù)，下同)的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，發(fā)酵周期為54 h，定時取樣。

血紅素共培養(yǎng)體系搖瓶發(fā)酵：分別單獨培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌菌株與大腸桿菌的發(fā)酵種子液12 h，各以1%的接種量轉接于含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，于32 ℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)3 h，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導，定時取樣測定共培養(yǎng)體系中的血紅素和生物量等。

7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：發(fā)酵罐中裝液量為3 L，解淀粉芽孢桿菌工程菌株與大腸桿菌工程菌株種子液分別培養(yǎng)12 h，各以1%的接種量同時轉接到發(fā)酵罐中，發(fā)酵條件為32 ℃，400 r/min，通氣量為1 vvm，共培養(yǎng)3 h后加入IPTG進行誘導并定時取樣測定相關發(fā)酵參數(shù)。

1.2.2 轉化方法

參考SHA等[13]的解淀粉芽孢桿菌轉化方法進行相關質粒轉化。

1.2.3 基因敲除與載體構建

利用QIU等[16]報道的CRISPR-cas9n基因組編輯技術對解淀粉芽孢桿菌的基因組DNA進行編輯。以敲除聚谷氨酸合酶基因pgsBCA為例，流程如下：以解淀粉芽孢桿菌基因組為模板，利用引物sgpgsBCA-F/R、pgsBCA-UP-F/R和pgsBCA-DN-F/R分別通過擴增得到crRNA-tracRNA、UPgene和DNgene基因片段。將上述基因片段通過重疊PCR進行連接，獲得crRNA-tracRNA-UPgene-DNgene片段，接著，將上述片段組裝到線性化的pDR244載體上，獲得重組質粒pDR-sgpgsBCA。將pDR-sgpgsBCA以及pHT01-cas9n質粒(先前研究構建[16])同時轉入解淀粉芽孢桿菌中。通過平板篩選和菌落PCR獲得正確的陽性克隆子。挑取陽性轉化子轉接到液體LB培養(yǎng)基中，并加入IPTG誘導Cas9蛋白表達，利用PCR技術驗證目的基因是否敲除成功。同樣，利用上述方法對解淀粉芽孢桿菌的prob、nas、ldh和pta基因進行敲除以構建不同工程菌株。

基因表達質粒構建流程：以大腸桿菌MG1655基因組為模板，利用引物gltX1-F/R、hemA1-F/R和hemL1-F/R分別通過PCR擴增獲得gltX、hemA、hemL基因片段，之后通過重疊PCR連接上述基因片段，獲得gltX-hemA-hemL多基因片段。將gltX-hemA-hemL基因片段與線性化pMA5載體進行組裝，構建成功后轉入相應的解淀粉芽孢桿菌中，獲得目的基因表達的工程菌株。此外，利用表2所示引物從大腸桿菌基因組上擴增獲得hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH基因片段并按照上述質粒構建方法將其組裝到pRSF-Duet1中，獲得質粒pRSF Duet1-hemBCDEFGH。從大腸桿菌以及解淀粉芽孢桿菌基因組上擴增出不同來源gltX、hemA、hemL基因片段，通過重疊PCR進行連接，獲得不同組合的gltX、hemA、hemL多基因片段。將不同組合的gltX-hemA-hemL基因片段與pMA5載體組裝，獲得不同的gltX、hemA、hemL表達質粒。以大腸桿菌基因組為模板，擴增獲得rhtA以及ccmABC基因片段，將上述片段組裝到相關的質粒上，獲得表達質粒。

1.2.4 5-ALA與血紅素檢測方法

參考TAN等[17]的化學檢測法檢測5-ALA;參考ZHAO等[9]的液相檢測方法檢測血紅素。

2 結果與分析

2.1 構建血紅素生物合成的共培養(yǎng)體系

前體供應對于微生物細胞工廠合成目標產物至關重要[18]。谷氨酸作為血紅素合成的前體，其胞內水平將在很大程度上影響血紅素的合成。為了驗證B.amyloliquefaciensNX-2S154在血紅素生物合成過程中能否提供充足谷氨酸前體。首先，利用CRISPR-cas9n技術敲除B.amyloliquefaciensNX-2S154中編碼聚谷氨酸合酶的基因pgsBCA，獲得工程菌株B.amy-0(NX-2S154ΔpgsBCA)。接著，將出發(fā)菌B.amyloliquefaciensNX-2S154與工程菌株B.amy-0分別在LB平板上劃線培養(yǎng)。通過對這2株菌株的菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在敲除pgsBCA基因后，菌落形態(tài)由飽滿濕潤變得扁平且十分干燥(圖1-a、圖1-b)。通過對上述2株菌株進行搖瓶發(fā)酵來驗證聚谷氨酸合酶基因敲除前后的胞內谷氨酸含量以及菌株生長情況。由圖1-c可知，工程菌株B.amy-0的OD600達到7.84，與原始菌株相比提升12.90%。此外，通過測定B.amyloliquefaciensNX-2S154以及B.amy-0菌株的胞內谷氨酸含量，發(fā)現(xiàn)B.amy-0菌株的胞內谷氨酸含量達到674.67 μg/g，相對于原始菌株(75.64 μg/g)提升了791.94%。這些結果充分說明B.amy-0菌株具有高效的胞內谷氨酸合成通量，可為血紅素合成的共培養(yǎng)體系提供充足谷氨酸前體。

a-NX-2S154菌落形態(tài)；b-NX-2S154ΔpgsBCA菌落形態(tài)；c-聚谷氨酸合酶基因敲除前后菌株生長情況及胞內谷氨酸濃度圖1 NX-2S154與NX-2S154ΔpgsBCA菌落形態(tài)及發(fā)酵代謝產物產量Fig.1 The NX-2S154 and NX-2S154ΔpgsBCA colony morphology and fermentation metabolite yield

以葡萄糖為底物合成血紅素涉及到28個的途徑酶。如將這些途徑基因全部過表達于單個宿主細胞中將會嚴重影響菌株的胞內代謝流平衡。因此，我們將血紅素的合成途徑分為前體5-ALA合成模塊和5-ALA合成血紅素模塊，分別構建于解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌中。在解淀粉芽孢桿菌中異源表達大腸桿菌來源的gltX，hemA和hemL基因構建前體5-ALA合成模塊，獲得工程菌株B.amy-1[NX-2S154ΔpgsBCA(pMA5-gltXE.coli-hemAE.coli-hemAE.coli)]。由圖2-a可知，工程菌株B.amy-1在發(fā)酵過程中5-ALA的積累量不斷增加，達到136.81 mg/L。而對照菌株B.amy-0僅存在微量的本底表達(約1.45 mg/L)。同時，在大腸桿菌中異源表達大腸桿菌來源的hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG和hemH基因構建血紅素合成模塊，獲得工程菌株E.coli-a。將工程菌株B.amy-1和E.coli-a進行血紅素的共培養(yǎng)發(fā)酵，獲得7.84 mg/L的血紅素積累。此時，共培養(yǎng)體系的5-ALA質量濃度相對較低，僅為76.62 mg/L，較B.amy-1菌株下降了43.99%(圖2-b)。

a-B.amy-1工程菌株發(fā)酵過程中5-ALA產量；b-共培養(yǎng)體系發(fā)酵過程中5-ALA和血紅素產量圖2 B.amy-1工程菌株以及共培養(yǎng)體系發(fā)酵參數(shù)Fig.2 Fermentation parameters of co-cultivation system and B.amy-1 engineering strain

2.2 代謝工程優(yōu)化共培養(yǎng)體系改善血紅素合成

為了提高上述共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，需要采取組合多種代謝工程策略對共培養(yǎng)體系進行進一步的代謝途徑優(yōu)化。首先，通過對不同宿主來源的5-ALA途徑基因gltX、hemA、hemL進行基因表達的適配性優(yōu)化，獲得8種含有不同基因組合的工程菌株。這些工程菌株的搖瓶發(fā)酵結果表明工程菌株B.amy-2[NX-2S154ΔpgsBCA(pMA5-gltXB.Amy-hemAB.Amy-hemLE.coli)]的5-ALA產量提升最為明顯，其5-ALA積累量達到298.72 mg/L，較對照菌株B.amy-1(136.8 mg/L)菌株提升了118.3%(圖3)。因此，菌株B.amy-2將作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

圖3 不同來源5-ALA途徑基因組合的產量Fig.3 Titer of 5-ALA pathway gene combinations from different sources

阻斷目標產物合成的競爭代謝通路是改善目標產物合成效率的一種高效策略[19]。為了改善共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，利用CRISPR-cas9n技術分別敲除B.amy-2菌株的ldh、pta、nas以及prob基因來阻斷副產物乳酸、乙酸、N-乙酰氨基谷氨酸以及脯氨酸的生物合成，獲得B.amy-3、B.amy-4、B.amy-5和B.amy-6工程菌株。這些菌株的搖瓶發(fā)酵的5-ALA積累水平相對于B.amy-2菌株分別提升32.47%、29.40%、42.03%和6.01%(圖4-a～圖4-d)。

a-敲除ldh基因對菌株生長和5-ALA濃度的影響；b-敲除pta基因對菌株生長和5-ALA濃度的影響；c-敲除nas基因對菌株生長和5-ALA濃度的影響；d-敲除prob基因對菌株生長和5-ALA濃度的影響；e-敲除4個旁路基因對菌株生長和5-ALA濃度的影響；f-敲除4個旁路基因對共培養(yǎng)體系的影響圖4 敲除旁路基因對菌株生長、5-ALA以及共培養(yǎng)體系的影響Fig.4 Effects of knockout bypass genes on strain growth, 5-ALA, and co-culture systems

其中，敲除解淀粉芽孢桿菌的nas基因使得5-ALA產量提升最明顯，達到424.26 mg/L。接著，為了進一步改善解淀粉芽孢桿菌合成5-ALA的能力，在B.amy-2菌株中同時敲除上述4個旁路基因獲得了B.amy-7工程菌株，該菌株搖瓶發(fā)酵5-ALA的產量達到524.26 mg/L，較B.amy-2菌株(298.72 mg/L)提高了75.50%(圖4-e)。這些結果進一步說明阻斷5-ALA和血紅素生物合成的競爭代謝途徑對改善前體5-ALA的合成至關重要。最后，將工程菌株B.amy-7與E.coli-a菌株進行血紅素的共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中血紅素的產量達到18.16 mg/L，相比于阻斷副產物合成途徑之前提高了131.62%。此外，工程菌株B.amy-7與E.coli-a的發(fā)酵體系中5-ALA的積累量為185.72 mg/L，較B.amy-7單獨發(fā)酵下降了64.57%(圖4-f)。

為加速共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌的胞內5-ALA向胞外轉運進入大腸桿菌的效率，避免5-ALA胞內積累對5-ALA生物合成途徑的反饋抑制，在工程菌株B.amy-7中表達rhtA基因來構建5-ALA胞外轉運通路，獲得工程菌株B.amy-8。通過對工程菌株B.amy-8和E.coli-a進行血紅素共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在強化5-ALA胞外轉運后，共培養(yǎng)體系中5-ALA的積累量較B.amy-7與E.coli-a的共培養(yǎng)體系有所降低，并且共培養(yǎng)體系中血紅素含量提升了16.91%，達到21.23 mg/L(圖5)。

圖5 構建5-ALA胞外轉運蛋白對共培養(yǎng)體系的影響Fig.5 Effects of constructing 5-ALA extracellular transporter on co-culture system

2.3 轉運途徑設計強化血紅素的合成

血紅素的胞內合成受到嚴格調控，為減少血紅素胞內積累對其生物合成途徑關鍵酶的反饋抑制，在E.coli-a菌株中過表達編碼血紅素胞外轉運蛋白的ccmABC基因構建血紅素的胞外轉運通路，獲得E.coli-b工程菌株。工程菌株B.amy-8與E.coli-b的共培養(yǎng)發(fā)酵結果表明構建血紅素胞外轉運通路使得血紅素的積累量提高了34.02%，達到28.36 mg/L，其中胞外血紅素濃度達到14.94 mg/L(圖6)。

圖6 表達血紅素胞外轉運蛋白對 5-ALA以及胞內、胞外血紅素濃度的影響Fig.6 Effects of expression of heme extracellular transporter on 5-ALA and intracellular and extracellular heme concentration

通過對共培養(yǎng)體系進行多種代謝工程改造后，解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力得到了不斷提升，相對于優(yōu)化前的共培養(yǎng)體系，血紅素的產量提升了2.62倍(表3)。

表3 本研究所獲工程菌株和共培養(yǎng)體系合成5-ALA與血紅素的產量比較Table 3 Titer of 5-ALA and heme in the engineering strains and the co-cultivation system obtained in this study

續(xù)表3

2.4 7.5 L發(fā)酵罐分批及分批補料發(fā)酵

為了提升上述共培養(yǎng)體系合成血紅素的能力，將B.amy-8與E.coli-b的共培養(yǎng)體系在7.5 L發(fā)酵罐進行血紅素的分批發(fā)酵，其5-ALA和血紅素產量分別達到168.48 mg/L與36.31 mg/L，與搖瓶發(fā)酵相比分別提升了2.45%和28.03%(圖7-a)。

a-分批發(fā)酵；b-分批補料發(fā)酵圖7 共培養(yǎng)體系發(fā)酵參數(shù)Fig.7 Parameters of co-culture systems

此外，有文獻報道在發(fā)酵初期過高的葡萄糖濃度會導致乙酸等副產物的積累從而影響細胞的生長[20]。為了提高發(fā)酵過程中菌體密度以及目標產物的合成，分批補料發(fā)酵策略被采用。首先將初始葡萄糖質量濃度設為20 g/L，并在發(fā)酵12、24和36 h分別流加10 g/L的葡萄糖。由圖7-b可知，在補料發(fā)酵過程中，共培養(yǎng)體系的菌株生長迅速進入對數(shù)生長期，并且在48 h菌株的OD600達到最高。血紅素的積累量達到65.38 mg/L，相對于分批發(fā)酵提升1.8倍。

3 討論與結論

本研究以B.amyloliquefaciensNX-2S154和E.coliBL21為出發(fā)菌株構建血紅素合成的共培養(yǎng)體系，獲得了7.84 mg/L的血紅素積累。通過對解淀粉芽孢桿菌中合成5-ALA的關鍵途徑基因進行適配性優(yōu)化，并敲除多個副產物合成途徑關鍵基因實現(xiàn)了碳代謝流高效流向血紅素，使得血紅素的產量達到18.16 mg/L，相比于優(yōu)化前提高了131.62%。此外，通過載體工程策略構建5-ALA與血紅素的胞外轉運通路，獲得了28.36 mg/L的血紅素。最后，在7.5 L發(fā)酵罐進行血紅素的分批與分批補料發(fā)酵，使得血紅素的產量達到65.38 mg/L。

本研究雖然首次采用共培養(yǎng)體系實現(xiàn)血紅素的生物合成，但目前血紅素的產量及其轉化率仍然相對較低。因此，后續(xù)可能需要進一步開展以下研究工作來進一步改善血紅素合成效率。首先，開發(fā)基因表達的動態(tài)調控系統(tǒng)來理性調節(jié)關鍵基因的表達水平，提高代謝流流向血紅素生物合成的效率[21]。其次，血紅素的生物合成受到嚴格調控，需要研究血紅素對關鍵酶的反饋抑制機制，并通過蛋白質工程手段緩解反饋抑制作用。另外，需要探索血紅素共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌與大腸桿菌之間的信息交流以及物質交換機制，為構建上述菌株共培養(yǎng)體系高效合成血紅素及其他產物提供新的研究方向[22]。